专利名称：血管生成疗法用医药组合物的制作方法在西方化的生活方式和高龄化社会的背景下，周围动脉疾病(peripheral arterial disease ；PAD)患者的增加逐渐显著。该PAD是以动脉硬化为基础的疾病，年龄、 吸烟、糖尿病、高血压、脂质代谢异常等成为该PAD的危险因子。另外，根据美国心脏协会的报道，随着检测出PAD的无创性检查的普及，至50岁为止PAD的患病率为约2 3%，75岁以上为约20%。另外，据说PAD患者中的约40%是无症状的。现在，作为该PAD的治疗法，有以抗血小板剂(anti-platelets)、血管扩张剂 (vasodiator)、前列腺素类(prostanoid)为中心的药物疗法、血管内支架治疗、外科性旁路术。但是，药物疗法的效果有限，血管内支架治疗和外科性旁路术是针对重病例的首选治疗，但不适于治疗的情况也多。作为对这样的现有治疗法具有排斥性的PAD，有严重下肢缺血(critical Iimbischemia ；CLI) 0 CLI被定义为伴随有慢性缺血性静息痛或缺血性皮肤病变(溃疡、坏疽)的状态。CLI的预后是悲观的，据报道发病1年后约25%丧失下肢，约 25%死亡。近年来，在临床研究中，作为针对PAD的血管生成疗法，较多尝试了细胞疗法 (cell therapy)和基因治疗(gene therapy)。细胞疗法中使用了骨髓单核细胞或末梢血单核细胞。基因治疗中使用了重组血管生成因子。作为用于基因治疗的重组血管生成因子，例如，使用血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝实质细胞生长因子(HGF)。关于这些血管生成因子，通过在缺血组织表达血管生长因子，从而使血管生成增加。另外，通过使用这种血管生成因子，确认到能够促进和/或增进心肌和下肢缺血症的动物模型中的侧支循环(collateralcirculation)的发达(Circulation 90， 11-228-11-234(1994)。将使用上述那样的血管生成因子来治疗血管障碍的治疗法称为“血管生成疗法”。 特别是，最近正在利用如上所述的血管生成因子的基因积极研究针对缺血性疾病或动脉疾病的血管生成疗法。另外，作为用于血管生成疗法的医药组合物，有记载于国际公开第2002/000258 号公报(专利文献1)中的医药组合物。专利文献1中记载的医药组合物是含有HGF基因或VEGF基因与前列环素合成酶基因作为有效成分的血管生成疗法用医药组合物。现有技术文献专利文献专利文献1 国际公开第2002/000258号
发明要解决的问题然而，使用上述那样的血管生成因子的治疗法并不是对于PAD的全部病例有效， 而且长期的有效性和有害事项也不明。特别是，关于使用了生长因子的基因治疗，不能否定肿瘤发生和增大的风险。因此，期望开发出能够解决上述问题的新型治疗法。在PAD的病状中，已知血管内皮受到损伤，作为血管扩张因子(vasodilator) 的一氧化氮(nitric oxide)、前列腺素(prostaglandin)、内皮细胞依赖性超极化因子 (endothelium-derived hyperpolarizing factor ;EDHF)、血管内皮生长因子(VEGF)等减少，作为血管收缩因子(vasoconstrictor)的血管紧张素(angiotensin)-2、内皮素 (endothelirO-l等增加。这些血管因子对于PAD的治疗有用的可能性高。实际上，对于 PAD、肺动脉高血压症(Pulmonary arterial hypertension)，正在临床使用前列腺素类 (Prostanoid)。因此，在这些之中，本申请发明人等着眼于具有血小板凝集抑制、血管扩张、血管生成作用的前列腺素O^rostaglandirOU的合成酶即前列环素合成酶(PGIS)。PGIS是生物合成据报道在实验上在肺动脉高压或颈动脉内皮伤害模型中具有高有效性的治疗药的基因，作为代谢产物的PGI2具有诱导血小板凝集抑制、血管扩张作用、 血管生成作用的作用。基因治疗由于在病变局部引起长期的基因表达，因此经常存在产生物质(products)所致的有害事项的发生的问题。在临床研究中使用的生长因子中，具有肿瘤发生、发展等风险，但迄今为止在临床例中并没有PGI2治疗药导致的肿瘤发生等的报道，并且PGI2是血管扩张和血管保护因子，因而安全性明显较高。同样地，作为可比较长期地得到安全且有效的基因表达的载体，可知腺相关病毒(adeno-associated virus ；AAV) 载体是最适合的。在上述严重下肢缺血的临床研究中使用了质粒或腺病毒等，但质粒难以得到强力且长期的基因表达，需要多次的给药。另外，腺病毒虽然可以得到强力的基因表达，但效果期间短且病原性强，是安全方面令人担忧的载体。以往，病毒载体具有高基因导入效率，但就对人的病原性等在用于人体时存在许多争议。但是，AAV载体在肌细胞和神经细胞等非分裂细胞中能够以高效率实现长期的基因表达，并且对人是非病原性的，因而为受到瞩目的载体。因此，本申请发明人等使用AAV作为载体，向小鼠的骨骼肌中基因导入合成前列腺素I2(PGI2)的人前列环素合成酶基因(PGIS基因)，由此确认到肺动脉高血压症小鼠的改善例。该实验时，在进行了基因导入的小鼠的局部骨骼肌内确认到强力的PGIS基因的表达。由该实验可知，在下肢缺血治疗中能够充分期待PGIS基因的导入。另外，通常对于基因治疗而言，不仅是治疗基因的选择，基因导入时使用的载体也对基因导入效率、即治疗效果产生很大影响。关于基因治疗中使用的载体，期望尽可能地在病变部的治疗基因的表达高、并且长期持续。但是，在过去的基因治疗研究中大多使用了质粒(plasmid)或非病毒性载体 (non viralvector)，难以得到强力且长期的治疗基因的表达。然而，若为作为病毒性载体的腺相关病毒(adeno-associatedvirus ；AAV)，则对于骨骼肌细胞具有强亲和性(tropism)，因此能够实现强力且长期的治疗基因表达。该腺相关病毒(AAV)还用于人的血友病(hemophilia)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、帕金森病(Parkinson disease)的基因治疗，被证明具有高安全性和有效性。通过使用对于骨骼肌能够实现强力且长期的基因表达效率的腺相关病毒，可以得到治疗基因的长期表达，能够期待在人的临床应用的可能性。本申请发明人等基于上述见解完成了本发明。用于解决问题的方案本发明涉及一种用于周围动脉疾病的治疗或预防的血管生成疗法用医药组合物， 其含有腺相关病毒(AAV)作为有效成分，该腺相关病毒(AAV)导入了生成前列腺素12的人 PGIS基因，前列腺素12是具有诱导至少血小板凝集抑制、血管扩张作用、血管生成作用中的任意一种作用的物质。本发明涉及一种血管生成疗法用医药组合物，其特征在于，腺相关病毒(AAV)中还导入了编码血管生成因子的基因。另外，本发明涉及一种用于周围动脉疾病的治疗或预防的血管生成疗法用医药组合物，其含有导入了人PGIS基因的腺相关病毒(AAV)和导入了编码血管生成因子的基因的腺相关病毒(AAV)作为有效成分，人PGIS基因生成前列腺素12，前列腺素12是具有诱导至少血小板凝集抑制、血管扩张作用、血管生成作用中的任意一种作用的物质。这里，作为腺相关病毒，使用类型(type) 1或类型(type) 2是有效的。本发明的血管生成疗法用医药组合物具有包含腺相关病毒的医药学上可接受的载体，该腺相关病毒导入了人前列环素合成酶基因、或人前列环素合成酶基因与编码血管生成因子的基因。本发明的血管生成疗法用医药组合物中使用的编码血管生成因子的基因可以使用编码能够诱导新血管的形成的蛋白质、多肽、它们的一部分的基因中的任意一种。特别是，作为编码血管生成因子的基因，期望为血管内皮生长因子基因。如上所述，本发明提供一种对于周围动脉疾病的治疗或预防有用的血管生成疗法用医药组合物，该血管生成疗法用医药组合物具有腺相关病毒(AAV)，腺相关病毒(AAV) 含有人前列环素合成酶(hPGK)基因，该hPGIS基因生成前列腺素I2(PGU)，前列腺素 I2(PGI2)是具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，此外腺相关病毒(AAV) 还含有编码血管生成因子的基因。这里在血管生成疗法中使用的、腺相关病毒(AAV)中含有的“编码血管生成因子的基因”包括编码具有诱导与hPGIS基因同样的血小板凝集抑制、血管扩张作用、血管生成作用中的任意一种作用、且能够诱导新血管的形成的蛋白质、多肽、或它们的一部分的基因。具体而言，可列举出编码血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-2、酸性FGF(aFGF)、碱性 FGF(bFGF)、FGF-4、EGF、TGF- α、TGF- β、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子-α (TNF- α )、胰岛素样生长因子、血管生成素_1等的基因。另外，还可列举出编码控制VEGF等的基因表达的HIF-1、或者包含ets-Ι的ets家族等转录因子的基因。优选可列举出VEGF基因。这些基因的基因序列注册在公共的数据库中，本领域技术人员可以通过利用这些基因序列而容易地克隆上述的基因。以下，以VEGF基因为例进行说明。本发明中，“VEGF基因”是指编码VEGF蛋白质的基因。另外，有时将为了能够表达该VEGF基因而重组到表达质粒中的基因简称为“VEGF 基因”。具体而言，可例示出将VEGF的cDNA作为表达载体重组到后述的病毒载体中的基因。 据报道，VEGF基因在人中通过转录时的选择性剪切而存在四种亚型(VEGF121、VEGF165、VEGF189, VEGF206) (Science, 219,983 (1983)、J. Clin. Invest.，84，1470 (1989)、Biochem. Biophys. Res. Commun.，161,851 (1989))。本发明中，能够使用这些基因中的任意一种VEGF 基因，但从生物学活性最强的观点出发，更优选VEGF165基因。此外，即使是对这些VEGF的基因实施了突变等的基因，只要是编码具有血管生成作用的蛋白质的基因，则也包含在本发明的VEGF基因的范畴内。本领域技术人员可以根据文献(例如kience，M6，1306(1989))中记载的序列和数据库中注册的序列信息，容易地对该VEGF基因进行克隆，另外还能够容易地对其进行突变等。关于以上的VEGF基因、或者编码它们的突变体的基因具有血管生成作用，例如能够在体外调查对于国际公开第97/078M号公报中记载的血管内皮细胞的增殖效果。编码以上的血管生成因子的基因在本发明的血管生成疗法中可以单独使用，或者也可以多种组合使用。这里，由hPGIS合成的PGI2如上所述具有血管扩张作用、血管通透性增加作用、血小板凝集抑制作用。并且，通过合用该PGI2和编码血管生成因子的基因，可以得到更显著的合用效果。另外，本发明中，作为“具有血管扩张作用的物质”，使用PGI2，更优选使用PGI2衍生物。另外，还使用PGI2作为“具有血小板凝集抑制作用的物质”，更优选使用PGI2衍生物。本发明中，“生成具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质的物质”是指合成、产生或诱导具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的PGI2的物质。具体而言，指合成、产生或诱导使前列腺素上升的物质的物质。该物质可以是基因、蛋白质、低分子化合物等中的任意一种物质，作为合成PGI2的合成酶的物质，使用PGIS基因。PGIS基因的基因序列注册在公共的数据库中，本领域技术人员可以通过利用这些基因序列而容易地进行克隆。以下，以hPGIS基因为例进行说明。本发明中，“PGIS基因”是指编码PGIS蛋白质的基因。另外，有时将为了能够表达PGIS基因而重组到表达质粒中的基因简称为“PGIS 基因”。具体而言，可例示出B.B.R.C，Vol. 200, No. 3，pl728-1734(1994)和国际公开第 95/30013号公报中记载的将PGIS的cDNA重组到适当的表达载体中而成的基因。此外，与上述VEGF基因的情况同样地，即使是对这些PGIS的基因实施了突变等的基因，只要是编码具有作为PGIS的作用的蛋白质的基因，则也包含在本发明的PGIS基因的范畴内。对于该PGIS基因，也与VEGF基因同样地，本领域技术人员可以根据上述文献中记载的序列和数据库中注册的序列信息，容易地对该PGIS基因进行克隆，另外还能够容易地对其进行突变等。对于由该基因编码的蛋白质具有所期望的PGIS活性，例如，可以通过使用了 6-酮前列腺素Fla酶免疫检测试剂盒(Cayman公司制造、目录编号#515211)的酶免疫测定、或利用薄层色谱法(TLC)检测前列环素合成酶的代谢产物的方法等进行测定。以上的具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质PGI2、或者生成PGI2 的物质在使用了血管生成因子的基因的血管生成疗法中可以单独使用，或者也可以多种组合使用。以下，记载本发明的血管生成疗法用医药组合物的导入方法、导入形态和导入量寸。1)使用具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的PGI2、及生成该物质的 PGIS基因和编码血管生成因子的基因时，合用编码血管生成因子的基因和上述的PGIS基因时，即合用2种以上的基因时，需要全都采用基因治疗剂的形态。具体而言，可列举出 VEGF基因和PGIS基因的组合。对患者给药该基因治疗剂时，作为其给药形态，可列举出使用病毒载体的例子，实验指南书等上详细解说了其制备法、给药法(附册实验医学，基因治疗的基础技术，羊土社，1996、附册实验医学，基因导入和表达分析实验法，羊土社，1997、日本基因治疗学会编基因治疗开发研究手册、N · T · S、1999)。以下，进行具体说明。另外，本发明中，通过将目标基因导入到腺相关病毒(AAV)中，将导入了该基因的腺相关病毒(AAV)作为载体，使重组病毒感染靶细胞，由此能够将基因导入靶细胞内。这里，作为腺相关病毒(AAV)，可以使用类型(type)l、2、5、8中的任意一种，希望使用类型 (type) 1 或类型(type) 2。本发明中，为了向目标病变部位等基因导入部位导入基因，使用腺相关病毒(AAV) 载体。这是因为，腺相关病毒(AAV)能够在肌细胞、神经细胞、肝细胞等非分裂细胞中高效地进行基因导入，因而在将这样的细胞作为靶细胞时，能够长时间持续基因表达。另外，本发明的基因治疗剂构成血管生成疗法用医药组合物，在腺相关病毒(AAV) 中，希望使用能够在肌细胞、神经细胞、肝细胞等非分裂细胞中高效地进行基因导入的类型 (type) 1 或类型(type) 2。另外，作为本发明的基因治疗剂对患者的导入法，有下述方法将基因治疗剂直接导入体内的体内(in vivo)法；和，从人体中取出某种细胞并在体外将基因治疗剂导入该细胞中，然后使该细胞返回体内的回体(ex vivo)法(日経寸^ - > 7，1994年4月号， 20-45页、月刊药事，36 (1)，23-48，1994、实验医学增刊，12 (15)，1994、日本基因治疗学会编基因治疗开发研究手册，N ·Τ· S，1999)。本发明中，优选体内法。利用体内法给药时，可以通过与治疗目标疾病、目标脏器等对应的适当的给药途径进行给药。例如，可以对静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等进行给药，或者可以对确认病变的组织本身进行直接局部给药。作为制剂形态，可以采用与上述各给药形态对应的各种制剂形态，例如可以采用液剂等。例如，在制成含有有效成分基因的注射剂时，该注射剂可以通过常规方法制备，例如溶解于适当的溶剂(PBS等缓冲液、生理盐水、灭菌水等)中后，根据需要用过滤器等进行过滤灭菌，接着填充到无菌的容器中，从而能够制备该注射剂。也可以根据需要在该注射剂中加入惯用的载体等。另外，在HVJ-脂质体等脂质体中，可以制成悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。另外，为了使疾病部位的周围容易存在基因，还可以制备缓释性的制剂(微型颗粒制剂等)并埋入患部附近，或者也可以使用渗透泵等连续且缓慢地给药到患部。需要说明的是，制剂中的基因的含量可以根据治疗目标疾病、患者的年龄、体重等适当调节，通常，作为各基因，为0. 0001-100mg、优选为0. OOl-IOmg,优选几天或几个月一次将其进行给药。2)使用具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的PGI2、及生成该物质的 PGIS基因和编码血管生成因子的基因的情况。合用编码血管生成因子的基因和低分子化合物或蛋白质、肽等时，关于编码血管生成因子的基因，采用上述的基因治疗剂的形态。另一方的低分子化合物等采用一般的医药组合物的形态，以经口或非经口的方式给药。作为代表性的组合，可列举出VEGF基因和 PGI2衍生物的组合等。以下，对将上述低分子化合物或蛋白质等作为有效成分的医药组合物进行说明。上述低分子化合物或蛋白质中，只要是已经作为血管扩张剂或血小板凝集抑制剂 (抗血小板剂)市售的物质，则能够根据其药物说明书设定给药方法和给药量等，通常可列举出以下的给药形态、给药方法。S卩，口服给药时，可以利用通常该领域中使用的给药形态进行给药。非口服给药时，可以利用局部给药剂(经皮剂等)、直肠给药剂、注射剂、经鼻剂等给药形态进行给药。作为口服剂或直肠给药剂，可列举出例如胶囊、片剂、丸剂、散剂、糖球、栓剂、液剂等。作为注射剂，可列举出例如无菌的溶液或悬浮液、乳剂等，具体而言，可列举出水、 水-丙二醇溶液、缓冲液、0.4%的生理盐水等。作为局部给药剂，可列举出例如膏、软膏、洗剂、经皮剂等。以上剂型可以通过通常该领域中进行的方法与药学上可接受的赋形剂、添加剂一起制剂化。作为药学上可接受的赋形剂、添加剂，可列举出载体、结合剂、香料、缓冲剂、增稠齐U、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮化剂、防腐剂、PH调节剂、张力调节剂(tonicity adjusting agent)、浸润剂等。另外，作为药学上可接受的载体，可列举出例如碳酸镁、乳糖、果胶、淀粉、甲基纤维素等。这样的医药组合物可以通过对应于治疗目标疾病、目标脏器等的适当的给药途径进行给药。例如，可以对静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等进行给药，或者可以对确认病变的组织本身进行直接局部给药。另外，还可以为口服给药或作为栓剂的给药。给药量、给药次数根据症状、年龄、体重、给药形态等而异，通常对于成人而言，可以每天将约0. 0001 约 500mg的范围、优选为约0. 001 约IOOmg的范围以一次或分多次进行给药。将以上的低分子化合物或蛋白质作为有效成分的医药组合物只要与含有编码血管生成因子的基因的基因治疗剂同时给药，则也可以设置时间间隔来分别给药。发明的效果以上，对本发明的血管生成疗法用医药组合物进行了说明，该医药组合物被有效地用于需要血管生成疗法的周围动脉疾病的治疗或预防中。图1示出通过激光多普勒血流测定法和光学照相机对AAV-hPGIS给药组、对照 (CONTROL)组、AAV-EGFP给药组的缺血性肢体的灌注状态进行拍摄的图像。图2是定量分析(n = 12)并示出将AAV-hPGIS给药组、对照(CONTROL)组、 AAV-EGFP给药组的缺血性肢体与未发症的非缺血性肢体(右脚)比较时的缺血性肢体(左脚)的血流量灌注速度的图。图3是比较并示出AAV-hPGIS给药组、对照(CONTROL)组、AAV-EGFP给药组的坏死的改善状况的图。图4是示出在AAV-hPGIS给药组、对照(CONTROL)组、AAV-EGFP给药组中使用了基于定量RT-PCR法和蛋白质印迹法的分析的hPGIS的表达状况的图，(A)为示出从外部向骨骼肌给药hPGIS并对PGIS的表达状况进行定量RT-PCR分析(n = 5)的图，(B)为示出对小鼠体内的大腿肌肉给药hPGIS并对PGIS的表达状况进行定量RT-PCR分析(n =)的图，(C)、(D)、(E)为示出对小鼠的大腿肌肉分别给药VEGF、FLK-1、FLT时的表达状况进行定量RT-PCR分析(n = 5)的图。图5是示出AAV-hPGIS给药组、对照(CONTROL)组、AAV-EGFP给药组的利用蛋白质印迹法的分析结果的图。图6是示出对AAV-hPGIS给药组、对照(CONTROL)组、AAV-EGFP给药组分别给药 AAV type l_hPGIS载体时的左大腿肌肉内的hPGIS的表达状态的显微镜照片，A是示出利用免疫组织化学染色法进行了染色的状态的显微镜照片，B是示出对各组的左大腿肌肉内的血管性血友病因子(vWF)进行了染色的状态的代表模型的显微镜照片，C是示出关于vWF 的进行了免疫荧光染色的左大腿肌肉内的微血管密度的定量分析的图。

在麻醉下杀死动物，利用4%多聚甲醛进行灌注固定。大腿肌被摘除，包埋在OTC 混合物中。从组织试样中切出冷冻切片(7μπι)。利用抗血管性血友病因子(vWF)抗体 (DAKO)进行血管内皮细胞的免疫荧光染色。核用T0T0-3 (Molecular Probes)染色。微细血管的密度由vWF阳性细胞的数量计算。全部的共聚焦显微镜利用LSM510 META(Carl Zeiss, Jena,Germany)进行。毛细血管密度为由Image J软件测定的毛细血管的总面积相对于骨骼肌的总面积的比例。各小鼠的数据由30个连续切片计算。统计分析全部数据用平均值士标准偏差值表示。统计学的显著性使用未配对学生t检验进行评价。通过方差分析进行3组以上的比较。P <. 05视为显著。[实验结果]AAV type 1-hPGIS载体给药后的表达持续本申请发明人等利用8周龄的对照小鼠(C57/BL6)调查了 AAV type 1-hPGIS载体的效果持续期间。向小鼠的左大腿肌给药AAV type l_hPGIS载体，在分析中，使用载体给药前、给药2周后、4周后、8周后、12周后的左大腿肌。其结果，通过定量RT-PCR从给药 2周后确认到人PGIS mRNA的强力表达，即使在12周后强力的表达也持续。其结果示于表 1。由表1所示的结果可知，骨骼肌中的AAV type l_hPGIS的给药在骨骼肌内显示出强力且长期的mRNA的表达。另外，该长期的mRNA的表达通过单次的肌肉内给药实现。[表 1]表IAAVl-人PGIS载体(1. OX IO11 (v. g. /body))左大腿肌给药后的表达变化


本发明涉及一种对于周围动脉疾病的治疗或预防有用的血管生成疗法用医药组合物，该医药组合物具有腺相关病毒(AAV)，腺相关病毒(AAV)含有人前列环素合成酶(hPGIS)基因，该hPGIS基因生成具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质前列腺素I2(PGI2)，此外腺相关病毒(AAV)还含有编码血管生成因子的基因。通过在治疗目标部位给药该医药组合物，实现AAV type 1-hPGIS向骨骼肌内的基因导入，在骨骼肌细胞内产生显著的人PGIS基因表达，通过该基因表达而使由肌细胞产生并分泌的PGI2引起血管保护作用、血管生成诱导作用，使血管的缺血得到改善。