一种用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜及其制备方法与应用的制作方法[0002]慢性肾病是肾损害或肾功能减退持续3个月以上，严重地导致尿毒症。慢性肾病发病率高，致残致死率高，治疗费用昂贵，严重影响人们的健康和生活，已成为当前重要的“全球公共健康问题”。蛋白尿是衡量肾小球损伤程度的重要指标，也是导致肾病变的主要因素。因此，减少或消除蛋白从细胞内漏出，是治疗肾病或修复肾脏的关键。目前，蛋白尿主要使用肾素-血管紧张素系统抑制剂、糖皮质激素等治疗，但病情容易反复，且副作用很大。这些药物只是暂时控制表征，没有从根本上修复受损的肾小球滤过膜。[0003]本发明合成的聚合物作为一种生物相容性的材料，在生物医学领域具有广泛的应用。然而，将其自组装成微米级下片状大小的膜和控制孔的大小在纳米级别内，具有很大的挑战性。本自组装多孔聚合物膜模拟肾滤过膜滤过膜屏障，具有生物相容性和一定的促进细胞生成作用。
[0004]本发明针对现有技术的不足，提供一种用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜及其制备方法与应用。[0005]一种用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜，由聚合物自组装形成的，具有较高的比表面积和多孔。所述自组装多孔聚合物膜带有负电性和通透的多孔，所述自组装多孔聚合物膜的尺寸为80-10000 nm，所述自组装多孔聚合物膜上孔的尺寸为3-500 nm ；所述自组装多孔聚合物膜上连接有肾小球滤过膜上的nephrin的抗体(anti_nephrin);所述的膜具有肾小球滤过膜靶向性。所述的自组装多孔聚合物膜能够模拟胞外基质，作为一种物理生物的过滤屏障，能减少蛋白尿的产生，促进肾滤过膜的自我修复，进而达到滤过膜的修复。[0006]一种用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜的制备方法，包括如下步骤: (1)加入引发剂和有机酯，并用氮气去除反应瓶中的空气后密封，在100-200°C下搅拌反应10-30小时，得到材料a ;所述引发剂与有机酯摩尔比为1:300-6000 ；
(2)将步骤(1)得到材料a用有机溶剂和醇分别溶解和沉淀，如此反复2-6次后；在10-100 1:真空干燥2-20小时，得到中性的聚合物微粒；
(3)将聚合物微粒溶于有机溶剂中，并加入有机酸酐，在20-150°C下搅拌反应2-20小时，得到负电荷的聚合物微粒；所述聚合物微粒与有机酸酐的摩尔比为1:1-100 ；
(4)将负电荷的聚合物微粒按照0.001-4% (wt/v%)溶于有机溶剂中，在20-80 °C加入0.005-4倍体积有机溶剂的有机醇，后淬冷，于蒸馏水中交换溶剂，自组装得到负电荷的自组装多孔聚合物膜；
(5)将负电荷的自组装多孔聚合物膜分散到去离子水中，根据经典的EDC与NHS偶联羧基和氨基法接上肾小球滤过膜上的nephrin的抗体(ant1-nephrin),得到用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜；所述的负电荷的自组装多孔聚合物膜与ant1-nephrin的摩尔比为I:1-20
(6)将接上抗体的自组装多孔聚合物膜分散在生理盐水中，通过静脉注射进入到大鼠体内；跟踪监测大鼠尿蛋白和肾小球滤过膜和肾功能的治疗效果。
[0007]上述方法中，步骤(1)中所述引发剂包括甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、丙二醇、异丙醇、丁醇、丁二醇、聚乙二醇、聚酰胺胺醇、聚丙烯胺醇中的一种以上；所述有机酯包括甲酯、乙酯、丁酯、乙酸乙酯、丙交脂、丙酯、乙酸丁酯中的一种以上。[0008]上述方法中，所述有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、吡啶、一氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和乙酸乙酯中的一种以上；所述醇包括甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙三醇、丙二醇、异丙醇、丁醇和已醇中的一种以上。
[0009]上述方法中，步骤(4)中所述有机酸酐包括乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐、已酸酐、乙二酸酐、丙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐和已二酸酐中的一种以上。
[0010]上述方法中，步骤(6)的大鼠肾小球滤过膜和肾功能的检测包括尿蛋白、尿素氮、血肌酐的检测、组织免疫染色、podocin染色、肾小球滤过膜超微结构的电子显微镜观察。
[0011]一种用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜应用于降低蛋白尿和修复肾滤过膜。
[0012]本发明的聚合物孔膜是利用自组装的方法合成的，膜上具有丰富的多孔，较大的比表面积，膜片的大小在体内能够适当的通过破坏了的滤过膜，而且利用抗体的作用能够将自组装多孔聚合物膜准确的靶向到肾滤过膜表面，此外，膜片上孔的大小及负电荷效应，很好的模拟了生物体内肾的滤过膜的物理屏障，从而阻止了大分子的蛋白泄出，减少了蛋白对足细胞的毒害作用。同时，本发明的孔膜模拟胞外基质，有利于促进细胞的生长。
[0013]根据以上所述优点，本发明的自组装多孔聚合物膜，通过静脉注射法，能够作为肾病治疗的一种新方案，从模拟滤过膜的物理屏障上修复，达到了很好的肾滤过膜的修复作用，是前所未有的治疗策略。
[0014]因此，我们通过体外细胞测试和体内的治疗中的一系列测试，证实我们制备的自组装多孔聚合物膜确实拥有良好的生物相容性和降低蛋白尿的效果，并且具有修复肾滤过膜的作用。
[0015]本发明的制备方法工艺简单，成本较低，制得的聚合物孔膜具有丰富的多孔，良好的生物相容性，能够降低蛋白尿，修复滤过膜效果良好，有效的延长了慢性肾病的进展和患者的生命，在治疗肾病方面具有重要的应用价值。
[0016]


[0017]图1为实施例1制得的自组装多孔聚合物膜的扫描电子显微镜图。
[0018]图2为实施例2制得的自组装多孔聚合物膜的扫描电子显微镜图。
[0019]图3为实施例3中自组装多孔聚合物膜培养细胞的细胞活性图。[0020]图4为自组装多孔聚合物膜干预后的蛋白尿变化结果图。
[0021]图5为正常对照组小鼠的肾滤过屏障的透射电子显微镜(TEM)图。
[0022]图6为白蛋白肾病模型组的小鼠的肾滤过屏障的TEM图。
[0023]图7为白蛋白肾病材料干预组的小鼠的肾滤过屏障的TEM图。

[0024]下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明:
实施例1
制备一种大孔的自组装多孔聚合物膜，步骤如下:
1)在烧瓶中加入IX 10_4摩尔的乙二醇和聚乙二醇(乙二醇和聚乙二醇摩尔比为1:1 )，加入0.1摩尔的甲酯和乙酸丁酯(甲酯和乙酸丁酯摩尔比为1:1)，并用氮气去除反应瓶中的空气后密封，在Iio °C下搅拌反应15小时；
2)将上述得到材料用乙酸乙酯溶解和用乙醇沉淀，如此反复4次；
3)得到的产物在701:真空干燥10小时，得到中性的聚合物微粒；
4)将聚合物微粒Imol溶于有氯仿中，并加入I mol的乙酸酐，在80 °C下搅拌反应20小时，得到负电荷的聚 合物微粒；
5)将负电荷的聚合物微粒Ig溶于30 ml氯仿和乙酸乙酯中，在40 °C搅拌下加入100ml聚乙二醇和乙醇后，用液氮淬冷3 min，倒入1000 ml的蒸馏水中交换溶剂，得到负电荷的自组装多孔聚合物膜；
6)负电荷的自组装多孔聚合物膜分散在pH=5.5-6的PB缓冲溶液中，搅拌15 min后加入EDAC与Sulfo-NHS,揽拌15min，调节pH至7-7.5,加入ant1-nephrin (肾小球上的nephrin抗体,购自美国Santa crus公司)，室温下搅拌4小时，过滤清洗3次,得到用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜；所述的负电荷的自组装多孔聚合物膜与EDAC摩尔比为1:5，EDAC与Sulfo-NHS摩尔比为1:2，负电荷的自组装多孔聚合物膜与ant1-nephrin 摩尔比为 1:3。
[0025]结果见图1，得到的膜上具有丰富的孔，膜大小大于3 Mffl，孔的大小在100 nm以上。
[0026]实施例2
制备一种小尺寸孔的自组装多孔聚合物膜，步骤如下:
1)将实施I例所述的得到的负电荷的聚合物微粒Ig溶于25 ml氯仿和乙酸丁酯中，在40 °C搅拌下加入100 ml聚乙二醇和甲醇后，用液氮淬冷3 min，倒入1000 ml的蒸馏水中交换溶剂，得到负电荷的自组装多孔聚合物膜；
2)将负电荷的自组装多孔聚合物膜分散在pH=5.5-6的PB缓冲溶液中，搅拌15 min后加入EDAC与Sulfo-NHS,搅拌15min，调节pH至7-7.5,加入ant1-nephrin (肾小球上的nephrin抗体,购自美国Santa crus公司),室温下搅拌4小时，过滤清洗3次,得到用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜；所述的负电荷的自组装多孔聚合物膜与EDAC摩尔比为1:5，EDAC与Sulfo-NHS摩尔比为1:2，负电荷的自组装多孔聚合物膜与ant1-nephrin摩尔比为1:3。得到用于肾小球滤过膜修复的自组装多孔聚合物膜；
结果见图2，自组装多孔聚合物膜的膜大小平均在600 nm之内，膜上孔的尺寸平均在IOOnm以下。
[0027]实施例3
足细胞生长至80%的细胞经胰酶消化后制成浓度为5X 104/ml的细胞悬液，接种细胞悬液100 μ L到96孔板，置37 °C、5% CO2培养24 h,换成无血清培养液培养6 h使细胞处于静止期，分别加入10 μ L不同浓度的自组装多孔聚合物膜(0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml、I mg/ml>10 mg/ml),同时设只加培养液的空白对照和含细胞但不加自组装多孔聚合物膜的正常对照。每种浓度设3个复孔，将培养板在培养箱孵育12 h。孵育完后向每孔加入10μ L CCK-8溶液，2 h后用酶标仪测定450 nm波长的吸光值。重复3次。结果见图3，在材料浓度高达10 mg/ml时，几乎没有细胞毒性，细胞活性与对照组相比，为89%，在低于0.1mg/ml的浓度下，细胞的活性接近100%甚至具有促进细胞增殖的作用。说明本发明所得自组装多孔聚合物膜具有很好的生物相容性。
[0028]实施例4
SD大鼠18只，随机分为3组，分别进行右肾全切术或假手术，第一组为对照组，正常给予水与食物；第二组为病理组，手术切除一只肾后，牛血清白蛋白(BSA)(用生理盐水将BSA粉末配成0.2g/ml溶液，并过滤除菌)溶液腹腔注射，以5g/kg/d BSA腹腔注射，第三组为病理干预组，手术切除一只肾后，牛血清白蛋白(BSA)(用生理盐水将BSA粉末配成0.2g/ml溶液，并过滤除菌)溶液腹腔注射，以5g/kg/d BSA腹腔注射，给予食物与水，第三天起，每隔四天尾部静脉注射自组装多孔聚合物膜10 mg/kg (自组装多孔聚合物膜粉末溶于生理盐水中)。收集 每组的24小时尿液，用考马斯蓝显色法，测出尿液中含有的总蛋白量，方法如下:
(O 10 mg牛血清白蛋白用10 ml纯水稀释成I mg/ml的标准蛋白质溶液；
(2)分别吸取2μL、4 μL、6 μL、8 μ I UO μ 1,12 μ I标准蛋白质溶液加入到考马斯亮蓝溶液中混匀，终体积800 μ I ；
(3)取适量体积的尿样本加入到考马斯亮蓝溶液中混匀，终体积800μI ;
(4)从每管中吸取200μ I加入96孔板中。
[0029](5)紫外分光光度计法，在595 nm波长测定标准蛋白溶液和样本溶液OD值；
(6)用标准曲线软件Curve Expert 1.3拟合标准曲线,并根据样本溶液OD值计算样
本蛋白浓度，并乘以24h尿量得出24h尿蛋白定量。
[0030]结果见图4，对照组大鼠的尿蛋白一直处于低(正常)水平，病理组大鼠的尿蛋白随着时间上升，在400-600 mg/天高浓度内波动,而通过自组装多孔聚合物膜干预后,尿蛋白的浓度有了大范围的下降，能够维持在较低浓度水平上。
[0031]实施例5
透射电镜图片:大鼠在注射白蛋白后40天后，牺牲掉大鼠，取其肾组织切片，取包埋好的肾组织超薄切片后，载在装有支持膜的铜网上，进行切片染色，具体步骤如下:
(I)预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板。
[0032](2)滴数滴醋酸铀染液于蜡板上，用镊子夹住铜网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使铜网浮在液滴上。
[0033](3 )盖上培养皿，染色30~45 min。
[0034](4)滴数滴蒸馏水于蜡板上，从染液中取出铜网，滤纸吸干残余染液后置于蒸馏水滴上进行清洗，5 minX 3次。
[0035](5)滴数滴硝酸铅染液于蜡板上，从蒸馏水中取出铜网浮在铅染液滴上。
[0036](6)盖上培养皿，染色10 min。
[0037](7)滤纸吸干残余染液后蒸馏水清洗，5 minX3次。将铜网晾干。
[0038](8) HT7700透射电子显微镜观察，拍照。
[0039] 结果见图，图5为正常对照组的透射电镜图，肾小球足突结构排列正常。图6为病理组透射电镜图，肾小球足突则有不同程度变宽，足细胞高度肿胀，胞质内有明显的空泡变性；足突弥漫性融合、消失，融合的足突内可见微丝节段聚集形成斑块样结构。图7为病理自组装多孔聚合物膜干预组的透射电镜图，与同时期病理组比，病变程度明显减轻，足突排列有明显恢复，足突弥漫性融合减少。
[0040]本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。