神经修复材料及其制备方法[0002]我国每年因各种创伤或外科手术(如肿瘤切除)而导致的周围神经损伤的病人超过100万人。这些病人如得不到及时有效的修复治疗，将造成相关部位神经功能的永久性丧失。神经损伤时神经间隙处增生的瘢痕组织是外周神经自我修复的主要障碍。间隙较大的外周神经损伤，需要用自体神经移植进行修复；但自体神经移植存在诸多缺点，如供区神经障碍、供区神经瘤形成、供区神经有限、供区神经与受区神经难以匹配，等等。因此，寻找和研制促进周围神经损伤后再生的桥梁系统是全世界医学界普遍关注并投入巨资广泛研究的重大难题。[0003]目前有关神经再生的理论主要归纳为以下三点:①神经营养理论，也就是神经远段雪旺细胞分泌营养因子诱导轴突再生，这个理论虽然已经被许多实验所证实，然而似乎难以解释有些实验现象。例如在神经缺损间隙有微小增加的情况下神经轴突通过率大幅度下降，因为距离微小的增加不会引起营养因子浓度的急剧下降，因而不足以解释神经轴突通过率的骤降。而且，导管促进神经再生的能力却由于加入有方向性基质材料而增加(参见②)，这也是神经营养理论不能解释的。②接触引导理论认为，轴突的延伸需要接触合适的基质，有方向性的导管内基质构型可以促进成纤维细胞和雪旺细胞增殖、迁移，进而引导轴突延伸。③基膜管 理论认为，周围神经节段缺损后成纤维细胞首先增殖迁移到神经缺损间隙，形成纤维缆连接两神经断端；雪旺细胞随后沿着纤维缆形成柱状基膜管，大约直径10-20微米。轴突延伸长入基膜管后形成髓鞘。因此，利于雪旺细胞轴向迁移的导管构型有助于引导有髓神经纤维生长。[0004]目前虽然对各种神经生长或营养因子有诸多研究，但是这种神经生长或营养因子的实际应用却始终存在一个“瓶颈”问题:小分子在体内快速降解，使得很多神经生长或营养因子还没来得及发挥作用就已经降解或失活，从而大大降低了其有效性。此外，神经修复机制复杂，神经损伤后的微环境对神经修复的影响多样，因此虽有多种学说，目前尚无能够完整解释整个修复过程的理论，除自体移植之外，也没有很好的神经再生修复手段，而自体移植显然存在着供体严重不足的缺陷，其应用存在种种限制。由于以上种种原因，对于神经修复的手段和神经修复材料，仍然存在迫切的需求。
[0005]本发明的目的是提供一种能够有效利用能够促进神经生长的细胞因子的神经修复材料，并且通过利用细胞因子间的协同作用，使其促进神经生长的效果最大化，从而达到修复神经损伤的目的。[0006]本发明提供了一种神经修复材料，包括:能够促进神经生长的细胞因子的组合，以及所述细胞因子的控释载体，其中所述载体主要由纤维蛋白原、纤粘连蛋白、肝素、纤维蛋白稳定因子、凝血酶和氯化钙形成，所述能够促进神经生长的细胞因子的组合优选选自神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少两种，所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包埋于所述载体中。本发明的神经修复材料利用控释载体的“智能释放”，根据神经修复的进程调节释放细胞因子的速度，从而循序渐进地发挥细胞因子的功能；同时利用细胞因子的协同作用，进一步促进神经的修复。[0007]神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子分别作用于不同神经修复相关细胞，例如神经生长因子(NGF)主要促进感觉神经元存活和轴突生长，脑源性神经营养因子(BDNF)主要支持运动神经元存活和轴突生长，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)增强轴突再生和血管生成，血管内皮生长因子促进血管内皮的生长和新血管的生成。本发明利用了各细胞因子分别对各种神经细胞的生长促进或营养作用，从而产生了优于单种细胞修复之和的协同作用效果。
[0008]本发明所用载体系统曾用于骨生长因子的控释，参见发明人早期专利CN200810065863.1。众所周知，骨组织与神经组织有着截然不同的组织结构、微环境和修复机制。然而原本用于模拟骨组织修复早期的临时基质的载体系统，在本发明的神经修复中也得到了意料不到的技术效果，发明人分析其原理为:缓释各种神经因子，从而延长了神经因子发挥功能的时间，并促进了神经修复的进行。
[0009]在一个优选的实施方式中，其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包括神经生长因子和碱性成 纤维细胞生长因子。
[0010]在一个优选实施方式中，所述载体中纤粘连蛋白与肝素的摩尔比在1:1至10:1范围内。在此范围内，能够达到更优的保护细胞因子的作用。
[0011]在一个优选实施方式中，所述纤维蛋白原在所述载体中的含量为90wt%以上。此条件下的载体更加稳定。
[0012]在一个优选实施方式中，所述神经修复材料中所述纤维蛋白稳定因子与纤维蛋白原的比例关系为:每Img纤维蛋白原对应0.3IU至1.2IU的纤维蛋白稳定因子。
[0013]在一个优选的实施方式中，所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合预装于神经导管的内部，以便于固定其在组织中的位置，增强其修复作用的导向性、靶向性和针对性，并进一步避免细胞因子在组织中的流失和浪费。所述神经导管可以是天然材料或人工材料制成，例如壳聚糖、聚乳酸、PLGA、明胶、胶原等或其组合。所述神经导管可以是编织管、多通道管等各种组成结构，优选多通道神经修复导管。最优选将所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合预装于所述神经导管的内部之后，再进一步制备成多通道神经修复导管。也就是说，所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合本身也通过冻干形成了多通道的形式。
[0014]在一个优选实施方式中，所述多通道神经修复导管由多种天然与人工材料管壁和具有轴向多通道的生物可降解填充基质组成。所述生物可降解填充基质包括纤维蛋白原、纤粘连蛋白、肝素、纤维蛋白稳定因子、凝血酶和氯化钙，以及上述能够促进神经生长的细胞因子的组合。
[0015]本发明还提供了一种制备上述神经修复材料的方法，包括如下步骤:[0016](I)将上述能够促进神经生长的细胞因子的组合作为组分I，配制含有纤维蛋白原、纤粘连蛋白、肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II，其中所述能够促进神经生长的细胞因子的组合优选选自神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子中的至少两种；
[0017](2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III ；
[0018](3)将组分II加入组分I，以溶解组分I ;和
[0019](4)将组分III加入组分II和I的混合溶液，以形成神经修复因子缓释系统，
[0020]优选 地,进一步包括步骤:
[0021](5)将所述神经修复因子缓释系统注入多通道神经修复导管的通道中。
[0022]在一个优选的实施方式中，其中所述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度可为4mg/ml至120mg/ml。所述步骤(2)中的凝血酶在组分III中的浓度可为40-800IU/ml，所述氯化钙在组分III中的浓度可为35-45 μ mol/ml。所述组分II和组分III的pH值优选为6.8至8。
[0023]在一个优选实施方式中，在所述步骤(3)中将组分II加入组分I之后，可在33°C至37°C水浴中放置15至30分钟。所述步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后，放入37°C温箱孵育0.5至I小时。
[0024]本发明的神经修复材料除了利用了细胞因子之间的协同作用之外，还利用了仿生学的载体缓释系统，即纤维蛋白原和纤粘连蛋白溶液在凝血酶和纤维蛋白稳定因子的作用下形成彼此共价交联的凝胶体系；在同一反应体系中能够促进神经生长的细胞因子与肝素结合，而肝素因与纤粘连蛋白具有高亲和力而连接到该凝胶体系，从而使得能够促进神经生长的细胞因子能够牢固地包埋在凝胶基质中，形成缓释系统。fXIII因子作为纤维蛋白稳定因子是形成所述凝胶基质所必需的，肝素不但把能够促进神经生长的细胞因子组合包埋在凝胶基质结构中，还保护其免受抑制和降解，提升其生物学活性。
[0025]本发明的神经修复材料具有如下技术效果:1、能够通过主要由细胞介导的材料降解而产生主动缓释；2、其缓释特征为微量、高效、平稳，无初始爆发性释放，仅需较少量能够促进神经生长的细胞因子组合，就可以维持有效长期释放，从而长期发挥作用；3、肝素有保护各种能够促进神经生长的细胞因子的作用，阻止其灭活，有效提高其生物活性；4、能够根据修复的过程“智能”释放:酸性环境中，能够促进神经生长的细胞因子组合以较高速率释放；在中性和碱性环境下，释放速度降低，这与损伤阻止修复过程的PH变化匹配:早期初损伤时，损伤部位的PH值较低，随着组织修复的进行，pH值逐渐恢复到正常的生理值，能够促进神经生长的细胞因子组合的释放速率会随着损伤修复的进行而由快到慢，以适应损伤后不同时期神经再生的需要；5、释放速率可以通过改变缓释系统载体的构成参数进行调节，以满足不同移植位点的需要；6、神经损伤初期的修复很重要，因此越快完成修复对于预后越好，本发明由于结合了多通道神经修复导管，可以制备成成品出售，不需临床应用时现场制备，节省了时间，从而改善了修复效果，增加了良好预后的几率。



[0026]图1为根据本发明一个实施方式的神经修复材料的成分构成示意图；
[0027]图2为根据本发明示例性实施方式的三种构型外壁的壳聚糖神经导管的扫描电镜照片(A至C)和光学照片(D至F)，其中A和D为旋转蒸发法制备的壳聚糖神经导管，B和E为冷冻干燥法制备的壳聚糖神经导管；C和F为编织法制备的壳聚糖神经导管；
[0028]图3为根据本发明一个实施方式的一种多通道神经导管结构示意图；
[0029]图4为用模具制备的不同形状的生长因子控释凝胶块；
[0030]图5为用壳聚糖材料制备的神经导管(A)和其中装有本发明所述载体和所述能够促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系的神经导管(B)；
[0031]图6为用ELISA方法检测生长因子(bFGF，NGF)体内释放曲线。FG:纤维蛋白胶；Fn:纤粘连蛋白；Hep:肝素；bFGF:碱性成纤维细胞生长因子；NGF:神经生长因子； [0032]图7为用ELISA方法检测生长因子(bFGF，NGF)体外释放曲线。FG:纤维蛋白胶；Fn:纤粘连蛋白；Hep:肝素；bFGF:碱性成纤维细胞生长因子；NGF:神经生长因子。
[0033]图8为术后8周神经吻合口中段神经冰冻切片NF200和SlOO免疫荧光观察(X200)。其中图a、b、c分别为A组、B组、C组染色结果，图d为正常大鼠坐骨神经染色；原照片中绿色为NF-200，红色为S100，因专利法要求将图片转为灰度之后，浅色为NF-200，深色为SlOO ；
[0034]图9为术后8周各组标本神经吻合口中段新生神经纤维髓鞘观察(甲苯胺蓝染色 X200)；
[0035]图10为术后8周各组标本神经吻合口中段新生神经纤维透射电镜观察神经，其中图a、b、c分别为A组、B组、C组，图d为正常神经(X 20000)。

[0036]在本发明中，发明人将具有协同作用机制的能够促进神经生长细胞因子组合，如神经生长因子(NGF，主要促进感觉神经元存活和轴突生长)、脑源性神经营养因子(BDNF，主要支持运动神经元存活和轴突生长)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，增强轴突再生和血管生成)和血管内皮生长因子利用控释载体系统制备成控释体系。载体系统所用控释基质材料主要为纤维蛋白原(FG)、纤粘连蛋白(FN)、硫酸肝素(HS)等，三者在组织修复起始过程中起着重要作用(参见图1)。发明人分析其原理可能在于:纤维蛋白原和纤粘连蛋白之间形成牢固的共价键，不易被组织液的PH所影响；而纤粘连蛋白和肝素之间、以及肝素和因子(bFGF)之间是由氢键连接，所以适于在损伤区随着pH的变化，而调解因子的释放速度，即根据修复的过程“智能”释放:酸性环境中，能够促进神经生长的细胞因子组合以较高速率释放；在中性和碱性环境下，释放速度降低，这与损伤阻止修复过程的pH变化匹配:早期初损伤时，损伤部位的PH值较低，随着组织修复的进行，pH值逐渐恢复到正常的生理值，能够促进神经生长的细胞因子组合的释放速率会随着损伤修复的进行而由快到慢，以适应损伤后不同时期神经再生的需要。
[0037]在控释载体中，进一步包括凝血酶和纤维蛋白稳定因子例如XIII因子(fXIII)。发明人分析其原理可能在于，组织损伤后凝血酶裂解纤维蛋白原，形成纤维蛋白单体，单体聚合形成凝胶网络。同时还裂解XIII因子，产生活化的XIII因子。活化的XIII因子催化纤维蛋白单体间以及纤维蛋白单体和FN间发生共价交联。FN广泛地介导细胞与细胞外基质的相互作用，在细胞黏附、迁移、生长和分化中起重要作用。它除了通过整合素结合到细胞表面外，还结合肝素和纤维蛋白。肝素可以结合和调节许多蛋白的活动，例如FN、bFGF、BDNF 和 NGF 等。
[0038]在一个优选实施方式中，所述能够促进神经生长的细胞因子的组合选自神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子中的至少两种，所述能够促进神经生长的细胞因子的组合包埋于所述载体中。神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子分别作用于不同神经修复相关细胞，例如神经生长因子(NGF)主要促进感觉神经元存活和轴突生长，脑源性神经营养因子(BDNF)主要支持运动神经元存活和轴突生长，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)增强轴突再生和血管生成，血管内皮生长因子促进血管内皮的生长和新血管的生成。在本发明中，具有不同功能的细胞因子协同作用，起到了优于单独细胞因子之和的修复效果。
[0039]在一个优选的实施方式中，所述能够促进神经生长的细胞因子组合包括神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。
[0040]在一个优选实施方式中，将此能够促进神经生长的细胞因子组合控释凝胶体系注入壳聚糖导管内，模拟正常神经的束膜管和基膜管结构，壳聚糖导管的结构及制备参见图2，其中A和D为旋转蒸发法制备的壳聚糖神经导管，B和E为冷冻干燥法制备的壳聚糖神经导管；(:和F为编织法制备的壳聚糖神经导管。在进一步优选的实施方式中，采用新型模具和热致相分离技术，在该含有该控释凝胶体系的壳聚糖导管内部制备出具有智能型生物活性仿生微结构的神经组织工程修复导管，例如具有多通道结构的导管，其结构示意图参见图3。导管内的生物活性因子“智能”型释放主要体现在:在酸性环境中，活性因子以较高的速率释放；在中性和碱性的环境下，释放速度较低。由于损伤组织PH值降低，随着组织的修复PH值逐渐恢复到正常的生理值，活性因子的释放速率就会由快到慢，以适应损伤后不同时期神经再生的需要。通过对壳聚糖材料分子量和脱乙酰度的调节可得到不同的降解速度和力学强度，适合不同类型神经损伤修复的需要。用此智能生物活性仿生微结构神经修复导管桥接神经缺损断 端，导管内部定向微结构引导雪旺细胞和轴突延伸，导管外壁阻挡纤维结缔组织侵入，内部基质中多种生物活性因子“智能”型释放，为周围神经再生提供理想的微环境，有望改善较长距离周围神经缺损的修复效果。
[0041]在一个优选的实施方式中，促进神经生长的细胞因子缓释系统可预装于各种天然或人工材料神经导管内部，然后通过模具和冷冻干燥法进一步可以制成多通道神经修复导管，其结构示意图参见图3。多通道结构对于神经的再生可以起到导向和支撑等作用，进一步促进了神经的修复。
[0042]根据需要，上述能够促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系凝胶可以制备成各种所需的形状，参见图4。所述需要可以是损伤大小、位置等参数。
[0043]在本发明中，对于上述能够促进神经生长的细胞因子的组合的控释体系凝胶来说，更加优选的方式是装入导管中。除了在组织中的支撑作用和定型外，装入导管中还有一个优点是能够制备成成品，方便其在临床中的应用，节省了手术的时间。对于寸秒寸金的神经外科手术来说，节省时间就增加了修复成功的几率，大大优于需要手术时现用现配的复杂材料。参见图5，其中列出了用壳聚糖材料制备的神经修复导管中装入本发明的细胞因子组合缓释体系成品的照片。
[0044]用壳聚糖材料制备的神经导管外壁降解时间达到了国家标准要求的1-1.5年(A)，本发明的纤维蛋白原、纤粘连蛋白以及硫酸肝素等材料构成的控释体系降解时间为4-8周(B)，因此壳聚糖导管足以在释放完成之前保护凝胶不受周围组织的压迫，以避免外力的破坏。
[0045]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，应理解的是，下述实施例仅为示例性实施例，不用于限定本发明要求保护的范围。
[0046]实施例1
[0047]神经生长因子/碱性成纤维细胞生长因子/载体缓释系统的制备
[0048](I)将神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的组合作为组分I，配制含有纤维蛋白原、纤粘连蛋白、肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II;
[0049](2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III ；
[0050](3)将组分II加入组分I，以溶解组分I ;
[0051](4)将组分III加入组分II和I的混合溶液，以形成神经生长因子/碱性成纤维细胞生长因子/载体缓释系统
[0052](5)上述步骤(1)中的纤维蛋白原在组分II中的浓度可为4mg/ml。所述步骤
(2)中的凝血酶在组分III中的浓度可为40IU/ml，所述氯化钙在组分III中的浓度可为35 μ mol/ml O所述组分II和组分III的pH值优选为6.8。
[0053](6)在上述步骤⑶中将组分II加入组分I之后，可在33°C水浴中放置30分钟。所述步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后，放入培养箱(37°C温箱)孵育0.5小时。神经生长因子在最终体系中浓度为I μ g/ml，碱性成纤维细胞生长因子在最终体系中浓度为50ng/ml。
[0054]实施例2
[0055]包含神经生长因子/血管内皮细胞生长因子/载体缓释系统的多通道神经修复导管的制备
[0056](I)将神经生长因子和血管内皮细胞生长因子的组合作为组分I，配制含有纤维蛋白原、纤粘连蛋白、肝素和纤维蛋白稳定因子的溶液作为组分II ;
[0057](2)配制含有凝血酶和氯化钙的溶液作为组分III ；
[0058](3)将组分II加入组分I，以溶解组分I ;
[0059](4)将组分III加入组分II和I的混合溶液，以形成神经生长因子/血管内皮细胞生长因子/载体缓释系统；
[0060](5)将所述神经生长因子/血管内皮细胞生长因子/载体缓释系统注入壳聚糖神经导管中，用模具和冷冻干燥技术制备成多通道神经导管；
[0061](6)上述步骤⑴中的纤维蛋白原在组分II中的浓度可为120mg/ml。所述步骤
(2)中的凝血酶在组分III中的浓度可为800IU/ml，所述氯化钙在组分III中的浓度可为45 μ mol/ml ο所述组分II和组分III的pH值优选为8。
[0062](7)在上述步骤(3)中将组分II加入组分I之后，可在37°C水浴中放置15分钟。所述步骤(4)中将组分III加入到组分II和I的混合溶液之后，放入培养箱(37°C温箱)孵育I小时。神经生长因子在最终体系中浓度为I μ g/ml，血管内皮细胞生长因子在最终体系中浓度为100ng/ml。
[0063]评价例I
[0064]体内、体外缓释曲线及其分析[0065]分别在体内和体外条件下检测本发明的细胞因子控释凝胶体系中细胞因子的释放曲线，结果见图6和图7。
[0066]图6为用ELISA方法检测生长因子(bFGF，NGF)体内释放曲线。FG:纤维蛋白胶；Fn:纤粘连蛋白；Hep:肝素；bFGF:碱性成纤维细胞生长因子；NGF:神经生长因子。由图6可见，生长因子缓释系统FG/Fn/!fep/-bFGF和FG/Fn/!fep/-bFGF在体内接近线性释放，而生长因子与FG简单的物理混合凝胶在体内植入后3天内出现爆释。
[0067]图7为用ELISA方法检测生长因子(bFGF，NGF)体外释放曲线。FG:纤维蛋白胶；Fn:纤粘连蛋白；Hep:肝素；bFGF:碱性成纤维细胞生长因子；NGF:神经生长因子。本实验发现，生长因子缓释系统FG/Fn/!fep/-bFGF和FG/Fn/!fep/-bFGF在体外缓冲盐溶液中释放非常缓慢，在第20天的时候加入纤维蛋白溶解酶(plasmin)，出现生长因子的爆释；而生长因子与FG简单的物理混合凝胶在体外缓冲盐溶液中释放很快，浸泡10天已经释放90%。
[0068]综上可知，本发明的控释(缓释)系统有效地达到了对其中加入的细胞因子的缓释作用，避免了爆释现象 ，相应延长了细胞因子释放的时间，从而能够持续地促进神经的修复。
[0069]评价例2
[0070]神经修复结果检测
[0071]利用结合有生长因子NGF、bFGF的控释凝胶修复了大鼠坐骨神经离断伤，具体实验方法和实验结果如下:
[0072]方法:
[0073]SD大鼠27只随机分为A、B、C三组，每组9只。建立大鼠坐骨神经横断模型:A组:以含有神经生长因子(NGF)与碱性成纤维生长因子(bFGF)控释凝胶的神经导管桥接神经远近端(间隙3mm) ；B组:以含有生理盐水的神经导管桥接神经远近端(间隙3mm):C组:采用神经远近端直接缝合。术后8周进行坐骨神经指数(SFI)、神经电生理、肌肉湿重比检查以及组织学和免疫组化观察。
[0074]结果:
[0075]从数据上看，A组在SF1、神经传导速度、肌肉湿重比、再生神经纤维密度及髓鞘化等方面均高于B组和C组，但三组的SF1、肌肉湿重比及新生轴突直径和髓鞘厚度均无显著性差异(P>0.05)。A组与B组的神经传导速度差异无统计学意义(P>0.05)，两组均明显高于C组(P〈0.05)。至于再生神经纤维密度，三组间差异具有统计学意义(P〈0.05)(参见表I)。
[0076]结论:小间隙吻合结合控释生长因子对神经再生有明显的促进作用。
[0077]表1术后8周各组神经吻合口中段新生神经纤维参数(X土 S，N = 9)