专利名称：表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法1，3-甘油二酯是天然食用油脂(甘油三酯)的结构类似物，其口感、外观均与前者一致，但在人体内的代谢吸收方式不同甘油三酯经消化酶消化后生成单甘酯和游离脂肪酸，二者吸收进入血液后，很大部分重新合成甘油三酯而增加血脂或造成脂肪积累。而1， 3-甘油二酯经消化酶作用后生成甘油和游离脂肪酸，甘油经丙酮酸进入TCA循环，游离脂肪酸被运往肝脏进行氧化。因此，食用含有1，3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、 防止体重增加的效果。天然存在的1，3-甘油二酯很少，因而其人工合成尤显重要。鉴于1，3-甘油二酯主要用作健康食用油脂，其合成过程中必须尽量避免酸、碱、有机溶剂等有害成分的参与以及高温、高压等苛刻条件对产品口感、外观的不良影响，因而适宜利用脂肪酶的区域选择性在无溶剂条件下由甘油和高级脂肪酸直接酯化是来合成高纯度的1，3-甘油二酯。已有利用游离脂肪酶催化合成1，3-甘油二酯的报道[孟祥河，邹冬芽，段作营等.无锡轻工大学学报，2005, 23(2) 31-35 ]。但是无溶剂合成1，3-甘油二酯的反应为高黏度非均相体系，这造成了脂肪酶在应用中分散性差、选择性下降、稳定性差、回收重复利用困难的问题。纳米材料能大幅提高分散性；另外，本实验室曾采用表面活化的疏水硅藻土为载体采用多种方法对Arthrobacter sp.脂肪酶进行固定化，发现通过交联处理脂肪酶的选择性和稳定性有Il著提高[Yang G, Wu J-P, Xu G, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008，2009，57(1-4): 96-103 ]。此外，磁性材料为酶在高黏度体系中的回收重复利用提供了方便，刘薇等以磁性基质固定化的脂肪酶，具有出很好的分离效果[刘薇，白姝，孙彦.过程工程学报，2004，4(4) 362-366.]。为了同时解决脂肪酶在高粘度非均相体系中的若干问题，我们尝试将纳米材料、 表面活化交联处理及磁性基质结合起来，对脂肪酶进行固定化。目前，尚无将疏水性表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶应用于无溶剂体系中1，3-甘油二酯合成的尝试的报道。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法。表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法的步骤如下 1)向200 mL无氧水中加入0. 20 0. 30 mol三价铁盐和0. 10 0. 15 mol 二价铁盐，以盐酸调整至PH = 1.5 1.7，超声处理20 30 min ；升温至65 90 °C，在1 300 1 500rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL质量百分数25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，使溶液pH = 9 10，15 30 min后，磁分离，无氧水洗涤5 10次，再以 0. 010 0. 015 mol/L乙醇水溶液洗涤2 3次；2)加入80 100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，4 8 mL硅烷交联剂，50 60 °C、 180^220 rpm搅拌5 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3 5次；3)加入16 20mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液， 180^220 rpm搅拌纩3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤;Γ5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；4)将含有10 50mg脂肪酶、pH = 5 10的水溶液与10 50 mg表面活化的磁性纳米粒子微球载体混合，0 4 °C、18(T220 rpm搅拌12 24 h，加入5 25 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 24 h，磁分离，冻干8 12 h，得到磁性纳米固定化脂肪酶；5)将40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸与10 35 mg 4 A分子筛、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm搅拌下反应7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二价铁盐为!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 或i^e2(S04)3*7H20。所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述白勺月旨肪BS为 Mucor javanicus^ Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 月旨肪Si。 所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。本发明将磁性固定化脂肪酶应用于在无溶剂体系中合成1，3-甘油二酯的反应中，选择性、活力及操作稳定性均有显著提高，并且大大方便酶的回收和重复利用，产品纯度高、不含有毒溶剂，具有极大的应用价值。


图1固定化脂肪酶与游离酶重复利用情况比较；
图2表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶扫描电子显微镜照片； 图3表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶透射电子显微镜照片； 图4表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化酶X射线晶体衍射图谱。

1)向200mL无氧水中加入0. 20 0. 30 mol三价铁盐和0. 10 0. 15 mol 二价铁盐， 以盐酸调整至pH = 1.5 1.7，超声处理20 30 min ；升温至65 90 °C，在1 300 1 500 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL质量百分数25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，使溶液pH = 9 10，15 30 min后，磁分离，无氧水洗涤5 10次，再以 0. 010 0. 015 mol/L乙醇水溶液洗涤2 3次；
2)加入80 100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，4 8 mL硅烷交联剂，50 60 °C、 180^220 rpm搅拌5 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3 5次；
3)加入16 20mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液， 180^220 rpm搅拌纩3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤;Γ5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；4)将含有10 50mg脂肪酶、pH = 5 10的水溶液与10 50 mg表面活化的磁性纳米粒子微球载体混合，0 4 °C、18(T220 rpm搅拌12 24 h，加入5 25 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 24 h，磁分离，冻干8 12 h，得到磁性纳米固定化脂肪酶；
5)将40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸与10 35 mg 4 A分子筛、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm搅拌下反应7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二价铁盐为!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 或i^e2(S04)3*7H20。所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述白勺月旨肪BS为 Mucor javanicus^ Rhizopus chinentis 或 Candia antarctica 月旨肪Si。 所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。实施例1
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 300 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗涤3次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌2 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。4 °C下，将10 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌M h，加入25 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌M h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h 即为固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到89%，目标产物
含量80% (质量分数)。采用气象色谱内标法计算产物生成量及底物消耗量，三月桂酸甘油酯为底物，位置异构体过量值re = (1，3-甘油二酯)％ (1，2-甘油二酯)％，以每分钟催化消耗1 Umol油酸所需的酶量(或固定化酶量)为一个酯化活力单位(Ue，ymol - min 0，每克蛋白所具有的酯化活力即为酯化比活。游离酶，位置异构体过量值re = 70%，比活为0.133 U· (g蛋白)S在40 ！以上迅速失活，固定化酶位置异构体过量值re = 85%，酯化比活为游离酶的11倍，固定化酶经磁性分离回收可重复使用5次以上，在80 °C仍不失活。实施例2
1)向200mL无氧水中加入0. 20 mol三价铁盐和0. 10 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至65 °C，在1 500 rpm搅拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加100mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 60 220 rpm搅
5拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3飞次；
3)加入20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将50 mg Mucor Javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 10磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体，在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于70% (质量分数)。实施例3
1)向200mL无氧水中加入0. 30 mol三价铁盐和0. 15 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至90 °C，在1 500 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，15 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 °C ,180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将50 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 10磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体，在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于70% (质量分数)。实施例4
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 300 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗涤3次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌2 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。4 °C下，将10 mg Rhizopus chinentis脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌M h，加入25 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌M h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到90%，目标产物
含量高于80% (质量分数)； 实施例5
1)向200mL无氧水中加入0. 20 mol三价铁盐和0. 10 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至65 °C，在1 500 rpm搅拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加100mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 60 220 rpm搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3飞次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体， 在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率85%，目标产物含量75% (质量分数)。实施例6
1)向200mL无氧水中加入0. 30 mol三价铁盐和0. 15 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至90 °C，在1 500 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，15 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 °C ,180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将 50 mg Rhizopus chinentis 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体，在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于67% (质量分数)。实施例7
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 300 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7,0.015 mol/L乙醇水溶液洗涤3次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 200 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌2 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子。4 °C下，将10 mg Candida antarctica脂肪酶粗酶粉溶于1 mL pH = 5磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌M h，加入25 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌M h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到90%，目标产物含量70% (质量分数)；
实施例8
1)向200mL无氧水中加入0. 20 mol三价铁盐和0. 10 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至65 °C，在1 500 rpm搅拌下，N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加100mL体积分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，50 60 220 rpm搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3飞次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，220 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将 50 mg Candida antarctica 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体， 在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。
500 mg油酸、100 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于70% (质量分数)。实施例9
1)向200mL无氧水中加入0. 30 mol三价铁盐和0. 15 mol 二价铁盐，以盐酸调整至 pH = 1.7，超声处理20 min;升温至90 °C，在1 500 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入10 mL质量分数28%的氨水，15 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，0.010 mol/L乙醇水溶液洗涤2次；
2)加入80mL体积分数为50%的乙醇水溶液，4 mL硅烷交联剂，60 °C ,180 rpm搅拌 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入16mL pH = 7的磷酸缓冲液及16 mL质量分数5%的戊二醛水溶液，180 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体。4 °C下，将 50 mg Candida antarctica 脂肪酶粗酶粉溶于 1 mL pH = 10 磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入50 mg载体， 在冰浴中220 rpm搅拌12 h，加入5 μ L质量分数为25%的戊二醛水溶液，搅拌12 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥12 h即为固定化酶。200 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率大于80%，目标产物含量大于67% (质量分数)。
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本发明公开了一种表面活化的磁性纳米粒子固定化脂肪酶制备1,3-甘油二酯的方法，包括如下步骤1)以二价和三价铁盐的混合物共沉淀制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子，以硅烷偶联剂进行修饰，并在修饰后的微粒外表以戊二醛活化，从而得到表面活化的磁性纳米粒子；2)加入脂肪酶酶溶液，搅拌、洗涤、干燥得到固定化酶；3)采用该固定化酶催化甘油与脂肪酸的酯化反应，得到1,3-甘油二酯。本发明所涉及的固定化脂肪酶在1,3-甘油二酯的合成反应中，活力、操作稳定、区域选择性均显著提高，酶的回收利用操作极大简化，产品纯度高且不含有害溶剂。