专利名称：用于乳腺癌内分泌治疗预后判断的新的分子标志物cuedc2蛋白质的制作方法肿瘤的发生严重威胁着人类健康，对肿瘤相关基因的研究一直是人类生物学一个重要的课题。乳腺癌是一种常见的肿瘤，是女性发病率最高的几种恶性肿瘤之一，多发于欧美等国家。在我国尤其是经济发达地区其发病率也呈逐年上升趋势，已经严重威胁了妇女的健康。雌激素受体α (Estrogen receptor α , ER α )是一种激素依赖核转录因子，它在大约70%的乳腺肿瘤中都有表达。雌激素结合雌激素受体导致受体二聚化并被招募到ERa 靶基因启动子区域的雌激素反应元件上。由于ERa在乳腺癌的发生发展上发挥了主要作用，目前乳腺癌的内分泌治疗主要是靶向ERa信号通路，包括降低雌激素水平；拮抗ERa 功能；或下调ERa表达水平。在这些靶向ERa的内分泌治疗中，选择性雌激素受体调节子他莫昔芬(tamoxifen)能通过竞争结合ER α并抑制乳腺癌生长，其已成为近30年来最主要的乳腺癌的内分泌治疗药物。然而，原发性或继发性他莫昔芬耐药性却是治疗这一疾病的重要挑战。ERa本身是对乳腺癌采用内分泌治疗是否敏感的最重要决定因素，ERa表达水平降低或丢失往往引起内分泌治疗耐药。已有研究表明，ERa表达水平的下降是由于某些乳腺癌肿瘤中的转录后或翻译后调节所致。例如，Src和AIBl可以激素依赖方式下调 ERa水平。然而乳腺癌中ERa水平的下调机制尚未完全明确。CUEDC2 (Gene ID :79004)是一个功能尚不明确的蛋白质。生物信息学分析表明 CUEDC2含有CUE结构域。已有报道发现CUE结构域是一类相对保守的、大约40个左右氨基酸的泛素结合结构域，它广泛存在于许多真核蛋白质中。CUE结构域能够结合单泛素和多泛素。我们实验室前期研究发现，CUEDC2降解孕激素受体，并参与乳腺癌细胞生长调控 (Zhang, P. J.，Zhao, J.，et al. 2007. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome. EMBO J 26(7) 1831-1842.)我们近期研究表明，CUEDC2与IKK复合体结合，招募GADD34和PPl，抑制NF- κ B信号通路过度激活，参与炎症反应调控(Li, H. Y.，Liu, H.，et al. 2008. Deactivation of the kinase IKK by CUEDC2 through recruitment of the phosphatase PPl.Nat Immunol 9(5) 533-541.)。
本发明的目的是提供一种CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的诊断剂的用途和CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途。本发明的进一步的目的是提供一种用于乳腺癌患者内分泌治疗预后判断的试剂盒和组合物。本发明的CUEDC2 蛋白质是指 CUE domain containing 2 蛋白质，GenBank BAE19942. 1，图1)。在MCF-7和ZR-75-1细胞种转染CUEDC2 siRNA导致ERa表达水平上调(图2)。进一步，MCF-7细胞中过表达CUEDC2能增加ERa的泛素化水平而用特异siRNA 干涉CUEDC2的表达能减少ER α的泛素化水平(图3)。利用雌激素受体特异报告基因进行的测活实验(图4)以及反转录PCR实验(图5)表明，CUEDC2能降低ERa转录活性及其靶基因的转录。2、CUEDC2在乳腺癌组织中表达增加为了研究CUEDC2在乳腺癌组织中的表达情况，首先制备了 CUEDC2单克隆抗体， 其制备过程如下首先把CUEDC2全长编码序列构建到pGEX-KG原核表达载体上。将这一 GST-CUEDC2融合表达载体转化大肠杆菌DH5 α，加IPTG诱导表达并纯化，得到GST-CUEDC2 融合蛋白质。将GST-hCUEDC2融合蛋白质IOOyg与弗氏完全佐剂进行充分乳化，对4-6 周龄BAL B/c雌性小鼠进行首次皮下注射。首次免疫3周后，将GST-hCUEDC2融合蛋白质 IOOyg与弗氏不完全佐剂充分乳化，对BAL B/c小鼠进行第二次皮下注射。第三次免疫后的第15天，经尾静脉采血，用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3天后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选，有限稀释法克隆化。 具体来说，就是稀释细胞悬液，接种96孔板，理论上使每个孔中只接种1个细胞，产生单克隆，从而得到分泌完全同质单克隆抗体的杂交瘤细胞。将得到的杂交瘤细胞经腹腔接种BAL B/c小鼠，12天左右开始采集腹水，即可得到腹水mAb，由京天成生物技术(北京)有限公司制备纯化的mAb。利用上述制备的CUEDC2抗体，发明人对449例乳腺癌病例进行了免疫组织化学分析。结果表明，CUEDC2在乳腺癌肿瘤组织中的表达量比正常癌旁组织中明显上调(图6，P <0.001)。对16例病例进行的实时定量PCR实验结果表明，CUEDC2 mRNA表达在乳腺癌肿瘤组织中也大大增加(图7)。3、乳腺癌中CUEDC2与ERa表达水平呈负相关我们还对449例乳腺癌病人中重要分子标志物如ER，PR，Ki-67，HER-I和HER-2进行了免疫组织化学分析，并对染色结果进行评分。将上述分子标志物与CUEDC2的评分情况进行相关分析，结果表明CUEDC2与ER α和冊表达水平呈负相关，与Ki_67和HER-2表达水平呈正相关，而与HER-I表达水平无统计学关联，见下表1。表1. CUEDC2与其它常见乳腺癌标志物的相关分析

本发明公开了一种CUEDC2蛋白质在制备用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的诊断剂的用途，该诊断剂包含所述CUEDC2蛋白质的抗体，该抗体为所述CUEDC2蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还提供了一种用于乳腺癌患者内分泌药物治疗预后判断的试剂盒或组合物，该试剂盒或组合物中含有抗CUEDC2蛋白质的抗体。本发明还进一步公开了CUEDC2基因或蛋白质在制备肿瘤治疗药物中的用途，即可将特异抑制CUEDC2基因蛋白质表达或活性的小分子物质、特异性抗体等作为治疗药，恢复耐药肿瘤对药物治疗的敏感性。所述CUEDC2蛋白质的新用途为确定乳腺癌病人手术后辅助治疗的用药方案提供了新依据，从而提高所使用抗癌药物的治疗效果并减轻病人的痛苦和经济负担。

公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日