专利名称：神经元的生成、再生和保护的制作方法在神经系统的发育过程中，神经元将轴突延伸出很远的距离，以便以合适的方式支配它们的靶标。这涉及刺激细胞中能刺激生长锥活性的特定的信号通路。尽管发育的神经系统，特别是发育的中枢神经系统的可塑性很高，但是成年人的神经系统，特别是成年人的脑的修复能力较为有限。因此，神经突-轴突生长和针对退变的保护被认为是改善神经退行性疾病、病症或疾病状态的结果的重要因素，例如神经系统的急性损伤或慢性神经退行性病症。能诱导神经突从所述神经元细胞生长的产品会为这类疾病、病症或疾病状态带来非常有用的治疗和/或预防和/或缓解的解决办法。在神经元发育过程的另一方面，不会分化成为成熟的神经元结构的神经元前体细胞的增殖会产生神经系统瘤。能诱导神经突从这类前体细胞生长的产品会为这类瘤带来治疗和/或预防和/或缓解的解决办法。大体上，当嗜神经病毒感染神经元细胞是，它对神经元的形态，特别是对神经突生长没有正性影响。事实上，有很多例子显示嗜神经病毒导致神经元细胞通过凋亡而死亡。这既涉及诸如疱疹病毒的DNA病毒，又涉及诸如甲病毒、本雅病毒和副粘病毒的有包膜RNA病毒或诸如小核糖核酸病毒和呼吸道肠道病毒的无包膜RNA病毒。狂犬病病毒，特别是减毒的狂犬病病毒株，也被描述为能诱导神经元凋亡。例如，WO 03/048198涉及狂犬病病毒G蛋白及其至少100个氨基酸的片段，它们能导致神经元细胞完整性被破坏和凋亡小体的形成。这些凋亡小体能刺激体液免疫应答， 特别是B细胞依赖性体液免疫应答。WO 03/048198 证实-减毒的狂犬病病毒株(例如减毒的ERA株)诱导其感染的细胞发生凋亡性破裂；-由此产生的凋亡小体刺激体液免疫应答，特别是刺激B细胞依赖性体液免疫应答；-狂犬病病毒株诱导的凋亡由其G蛋白的性质决定；_含有来自减毒狂犬病病毒株(例如减毒ERA株)的G蛋白的狂犬病病毒能引发人类细胞的凋亡，而来自致病性狂犬病病毒(例如攻击病毒标准CVS株)的G蛋白的表达则不会引发凋亡(参见，具体为WO 03/048198的实施例5和图19和20)。还可参见Lay et al. 2003 禾口 Prehaud et al. 2003。因此，已知凋亡性狂犬病病毒株的G蛋白，例如减毒ERA株的G蛋白，可用于刺激体液应答，特别是B细胞依赖性体液免疫应答。由于这些特定的G蛋白诱导其感染的细胞发生凋亡，所以它们还被建议作为通过对靶细胞进行凋亡破裂来去除不需要的细胞的候选剂。还描述了狂犬病病毒株的致病性与其诱导凋亡的能力负相关(参见WO 03/048198 ；Ugolini 1995 ；Sarmento et al. 2005 ；Ugolini 2008 Jackson et al. 2008)。 因此，狂犬病病毒株的毒力越大，其致凋亡能力越小。诸如CVS株的毒性狂犬病病毒株不能诱导神经元凋亡，并进而能逃避体液探测， 这解释了为什么在疾病的指征和症状出现之前，毒性狂犬病病毒株能在CNS中广泛传播。进行了进一步的研究来分析由嗜神经病毒感染所诱导的基因表达模式的改变，所述嗜神经病毒例如狂犬病病毒或I型单纯疱疹病毒(HSV-I)。这些研究已经表明，在不存在神经胶质的条件下，有丝分裂后的人神经元具有检测病毒感染的内在机制，并且诸如致病性狂犬病病毒或HSV-I的嗜神经病毒能诱导细胞因子从有丝分裂后的人神经元释放(Pr6haud et al. 2005)。该细胞因子释放被认为进一步促进神经元逃避凋亡，并促进这类嗜神经病毒的进一步传播。因此，神经元细胞死亡机制以及病毒感染时神经元产生免疫应答的能力已经得到彻底的研究。然而，对神经生成、神经再生和神经保护所涉及的过程，特别是对从有丝分裂前神经元(例如神经元前体细胞或瘤性神经元)或从退变神经元的神经突生长所涉及的过程还知之甚少。对于关注狂犬病病毒的研究人员，目前所知的概况是减毒狂犬病病毒株由于能诱导凋亡而被认为具有医疗用途，并且毒性狂犬病病毒株已知不能诱导凋亡，但是相反，能并保持促进它们的传播的神经元网络。尽管毒性狂犬病病毒株被描述成能保持神经元网络的完整性，但是据报道它们对神经元形态，特别是神经突生长具有负性影响，或者最起码没有正性影响。例如，出版物Guigoni and Coulon 2002描述，毒性狂犬病病毒株 CVS-Gif-sur-Yvette不能诱导大鼠运动神经元的神经突生长(参见例如，该出版物的图5A 和 5B)。对神经突生长的负性影响也有报道。例如，出版物Scott et al.，2008报道了致病性CVS-Il狂犬病病毒株诱导树突和轴突出现串珠(beading)，即形成空泡，这是负面胁迫影响的特征。本发明提供了神经元生成、再生和保护的方法，其源于某些致病性狂犬病病毒株， 并且显示出惊人且出人意料的特性。发明概述本发明证实，一些致病性(和非凋亡性)狂犬病病毒G蛋白具有神经突生长促进效应，即一些非凋亡性狂犬病病毒G蛋白诱导和/或刺激神经突生成。凋亡性狂犬病病毒 G蛋白没有表现出该效应。并不是所有的非凋亡性狂犬病病毒G蛋白都表现出该效应。本发明人鉴定出了一亚类非凋亡性(和毒性)狂犬病病毒株，其G蛋白对神经突生长具有显著的正性效应。如下文所描述并展示的，该亚类的代表性株是CVS-NIV株。该非凋亡性(和毒性)株的G蛋白与凋亡性(和减毒)ERA株(CNCM 1-2760)的G蛋白仅有 6个氨基酸不同。本发明还证实，该神经突生长促进效应是由于所述非凋亡性狂犬病病毒G蛋白的胞质尾区，特别是由于它们的PDZ结合位点(PDZ-BS)和/或由于位于CVS-NIV株的G蛋白序列中第491位的氨基酸，更特别是由于它们的PDZ-BS。本发明涉及多肽、核酸、载体、细胞和药物组合物或药物，所述多肽是某些非凋亡性狂犬病病毒G蛋白或来源于某些非凋亡性狂犬病病毒G蛋白，特别是来自它们的胞质尾区。本发明的方法能有效用作神经突生长刺激剂和/或诱导剂。它们能有效用于例如在神经系统瘤的治疗中诱导神经元分化，以及用于例如在神经退行性疾病、病症或疾病状态的治疗中或在微生物感染的治疗中再生受损的神经元，或用于保护神经元免受神经毒性剂或氧化应激的影响。附图简要说明本申请涉及的一些附图是彩色的。所提交的申请包括彩色打印的附图，因此能在专利局申请文档审查部门获得它们。图1 各种神经元病症、疾病状态和疾病中所涉及的神经生成、神经再生和神经保护，所述神经元病症、疾病状态和疾病包括神经毒性、抽搐、中风、外伤、衰老、神经退行性疾病、脑病。图2 由本发明人制备并在下文的实施例中使用的重组狂犬病病毒(rRABV)的示意性结构。 CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白与ERA株(凋亡性株)的G蛋白仅有6个氨基酸不同。G-存活=CVS-NIV株的G蛋白；G-死亡=ERA株的G蛋白；G-cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中的G-死亡的胞质尾区；G-cyto存活=ERA G基因背景中的G-存活的胞质尾区；SP =信号肽；EC 胞外结构域；TM 跨膜结构域；Cyto 胞质结构域。图3A、3B、3C、3D :CVS_NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区包含促进神经突生长的分子特征。图3A 用rRABV G-CVS-NIV和rRABV G-ERA进行的神经突生长测定。图3B 有db-cAMP的情况下，用rRABV G-CVS-NIV和rRABV G-ERA进行的神经突生长测定的结果。图 3C 没有 db-cAMP 的情况下，用 rRABV G-CVS-NIV、rRABV G-CVS-Cyto 死亡、 rRABV G-ERA和rRABV G-ERA-Cyto存活进行的神经突生长测定的结果。图 3D 用 rRABV-G-CVS-NIV、rRABV G-CVS (LQ)和 rRABV G-CVS (HE)进行的神经突生长测定的结果。N. I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区；rRABV G-CVS (LQ) = CVS-NIV株的重组狂犬病病毒G蛋白，其中CVS-NIV株的全长 G蛋白中第491位的氨基酸H被氨基酸L取代；rRABV G-CVS(HE) = CVS-NIV株的重组狂犬病病毒G蛋白，其中CVS-NIV株的全长 G蛋白中第521位的氨基酸Q被氨基酸E取代。图4A、4B :CVS_NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区是促进神经突生成的内在效应物，其与cAMP*协同作用。图 4A 无 db-cAMP ；图4B 无db-cAMP (前两个柱状图)和有cAMP (后两个柱状图)；★表示差异显著(学生t检验，p = 0. 0067)。N. I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图5 =CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区的神经突生成效应依赖分子特征而不依赖于所表达的G蛋白的量。rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图6A、6B :CVS_NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区赋予对抗生长锥塌陷药物(LPA)的神经保护作用。图 6A 有 db-cAMP ；图 6B 无 db-cAMP。N. I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图7:由CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区诱导的对抗生长锥塌陷药物LPA的神经保护作用很强。★表示差异显著(AN0VA检验)；▲表示差异不显著(AN0VA检验)。N.I·=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区；LPA =溶血磷脂酸。图8 =CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区赋予对抗氧化应激(H2O2)的神经保护作用。这些实验是在没有db-cAMP的条件下进行的。★表示差异显著(学生t检验)；▲表示差异不显著(学生t检验)。N.I·=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图9A、9B、9C =CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区赋予对抗I型单纯疱疹病毒(HSV-I)细胞病变效应的保护作用。N. I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图10AU0B 用全反式维甲酸(ATRA)促分化药物处理的人成神经细胞瘤细胞的细胞增殖(图IOA 流式细胞术；图IOB =MTT测定)。N. I.=未感染的。图IlAUlB =CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区赋予抗增殖特性用 rRABV G-CVS-NIV或rRABV G-ERA处理的人成神经细胞瘤细胞的细胞增殖(图11A)和神经突长度(图11B)。N. I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白。图12A、12B =CVS-NIV株(非凋亡性株)的G蛋白的胞质尾区赋予抗增殖特性用 rRABV G-CVS.rRABV G-ERA.rRABV G-CVS-Cyto 死亡或 rRABV G-ERA-Cyto 存活处理的人成神经细胞瘤细胞的细胞增殖(图12A 流式细胞术；图12B =MTT测定)(N. I.=未感染的)。N.I.=未感染的；rRABV =重组狂犬病病毒；G-CVS 或 G-CVS-NIV = CVS-NIV 株的 G 蛋白；G-CVS-Cyto死亡=CVS-NIV G基因背景中ERA株G蛋白的胞质尾区；G-ERA = ERA 株的 G 蛋白；G-ERA-Cyto存活=ERA G基因背景中CVS-NIV株G蛋白的胞质尾区。图13A，13B :CVS_NIV株(图13A)和ERA株(图13B)的G蛋白的核酸和蛋白序列。在图13A中，以下划线表示CVS-NIV株G蛋白的PDZ-BS基序(QTRL)。aa=氨基酸。图14 =CVS-NIV和ERA株的G蛋白的序列比对；G蛋白仅有6个氨基酸不同(在图 14中以粗体显示)表1:

本发明证实，与凋亡性狂犬病病毒G蛋白相反，某些非凋亡性狂犬病病毒G蛋白，例如CVS-NIV株的G蛋白，具有神经突生长促进效应。本发明还证实，该神经突生长促进效应是由于所述非凋亡性狂犬病病毒G蛋白的胞质尾区，更具体而言是它们的PDZ-BS，所述PDZ-BS与凋亡性狂犬病病毒G蛋白的PDZ-BS相比具有单点突变。本发明提供了诱导和/或刺激神经突生长的方法，其可用于例如在神经系统瘤的治疗中诱导神经元分化、以及用于例如在神经退行性疾病、病症或疾病状态的治疗中或在微生物感染的治疗中使受损的神经元再生、或用于保护神经元免受神经毒性剂或氧化应激的影响。