专利名称：一种用于治疗高脂蛋白血症的低密度脂蛋白吸附材料的制作方法 心血管疾病是威胁人类健康的三大疾病之一，全世界每年约有800万-1000万人死于动脉硬化引起的心血管疾病和中风。流行病学研究表明，心血管疾病与血液中LDL浓度过高有着密切关系。LDL在血液中起到运输脂类尤其是胆固醇的作用，它由肝脏产生并释放入血液。LDL中含19-21％蛋白质，37-43％胆固醇酯，8-11％未酯化的胆固醇，4-11％甘油三酯，22％磷脂以及约1％糖类。其数均分子量为2.7×106。LDL的平均尺寸和密度存在个体差异，这些差异主要由于遗传和饮食因素所引起。如果血液中LDL浓度过高，则会造成血液粘稠度上升，在血管破损或狭窄处，被氧化的LDL容易和其它蛋白形成斑块，继续积累从而造成动脉粥样硬化。降低血液中LDL含量能够明显改善心血管的流变性，因此成为降低心血管疾病发病率的重要措施。利用血液净化疗法能够直接降低血液中的LDL浓度，治疗效果快速、显著，对于饮食控制和药物治疗没有效果的严重的遗传性高胆固醇血症患者尤为适用。高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)同样是血液中富含胆固醇的脂蛋白，它的生理功能是将胆固醇运输到肝脏，进行分解、排出，使血液中保持着适宜的胆固醇含量，对缓解心血管疾病有着十分有益的作用。在进行LDL血液净化时，应最大程度的减少吸附材料对HDL的非特异性吸附。在合成LDL吸附材料方面，研究者们做了大量的工作，已有一些产品问世。根据材料与LDL的作用机理，大体可分为离子型吸附剂、疏水型吸附剂和免疫吸附剂，目前商品化的有硫酸右旋糖酐纤维素吸附剂(离子型吸附剂)和LDL抗体吸附剂(免疫吸附剂)，其他处于研究中的吸附剂包括以肝素、多肽、氯磺酸等分子为配基的吸附材料。已经商业化的LDL吸附剂仍存在很多缺陷需要改进。如硫酸右旋糖酐纤维素吸附剂(专利号JP61165330)是通过吸附材料带有的负电荷与LDL的受体结合区域作用，达到吸附LDL的目的，但硫酸右旋糖酐可激活第十二凝血因子，治疗过程需要非常慎重；免疫吸附剂(专利号CA2001358)通过把LDL抗体偶联到吸附材料表面，使其特异性吸附LDL，吸附剂选择性高、吸附效果明显。但由于抗体来源困难、价格昂贵、不易保存，使得此吸附剂的售价达到12万元，大大限制了使用人群。近些年来，人们一直试图研制其它对LDL具有较高选择性、较大吸附容量、价格低廉、血液相容性好的吸附剂，虽然研究较多，但离实际应用还有很大距离。如模拟抗LDL抗体和LDL结合位点的氨基酸序列设计的以丝氨酰柼於 滨 谷氨酸三肽为配基的吸附材料(余喜讯等。航天医学与医学工程，2002，15(4)300-302)，在胶血比为1∶2时，静态吸附2小时后，血浆中LDL的去除率为28.77％，HDL的去除率约10％，可见LDL吸附率低，对HDL的非特异性吸附也较高，说明利用简单的小肽很难模拟抗元抗体间的相互作用。又如以氯磺酸为配基的吸附材料(徐建宽，高等学校化学学报，2002，23(7)1421~1424)与硫酸右旋糖酐纤维素吸附剂的作用机理相似，胶血比为1∶1时，静态吸附2小时，可除去病人血浆中50％的LDL和9％的HDL，但此实验吸附所采用的胶血比远低于临床常规1∶10的比例，因此折算一下，实际吸附容量不高。总之，目前使用低密度脂蛋白吸附剂治疗高脂血症存在以下关键问题需要解决(1)选择性不高。在清除致病性分子LDL的同时，许多血液中有益的物质同时也被除去，如HDL，容易产生治疗副作用；(2)选择性高的吸附材料治疗费用昂贵。为了解决现有吸附材料存在的问题，应主要从以下两方面入手(1)综合分析LDL的结构特点及LDL与其受体相互作用的方式，通过一定的合成手段，使吸附剂最大程度的模拟LDL的受体结构，从而实现对LDL更高的选择性；(2)采用廉价、易得的基质和化合物合成吸附剂，从而降低成本。
本发明的目的是要合成一种血液相容性好，价格低廉，对LDL具有较高选择性和较大吸附能力的LDL吸附材料，以克服现有LDL吸附材料存在的对LDL吸附能力差，选择性较低、制备成本较高的缺陷。
本发明的技术方案是选择血液相容性好的琼脂糖凝胶为载体，在材料表面引入枝状间隔臂，在枝状间隔臂分子上偶联两种对LDL具有不同作用方式的功能基团做为配基，这两种功能基团分别是对LDL具有离子作用的磺酸基和具有疏水作用的吲哚基团，其选择根据是(1)LDL表面存在丰富的游离胆固醇及胆固醇酯疏水区域，能够与疏水功能基团产生吸附作用；(2)LDL上载脂蛋白Ap0B-100的受体结合区域氨基酸残基序列为Arg-X-X-Arg-Lys-Arg-X-X-Arg/Lys，是一个正电荷集中区，可以与带有负电荷的功能基团产生吸附作用；(3)半胱氨酸、丝氨酸等小分子同时具有三个活性基团，可以通过这些分子作为间隔臂同时偶联两种配基。希望通过吸附材料表面两种功能基团与LDL的吸附作用，实现提高吸附剂对LDL的选择性，减少对血液中其它有益成分非特异性吸附的目的。
具体的实验步骤如下第一步，选择血液相容性好的琼脂糖凝胶作为吸附剂基质，使用N，N’羰基二咪唑(CDI)活化其表面羟基；第二步，利用双氨基试剂合成带有功能基团氨基的琼脂糖凝胶；第三步，将半胱氨酸的巯基与具有氨基末端的琼脂糖凝胶相连，合成的材料表面带有半胱氨酸枝状间隔臂，其末端活性基团为氨基和羧基；第四步，分别在材料表面枝状分子携带的两种活性基团--氨基和羧基上偶联不同的配基。最终制备同时偶联负电型配基牛磺酸和疏水配基吲哚乙酸的吸附材料。
按照上述实验构思，本发明提供了一种用于治疗高脂蛋白血症的低密度脂蛋白吸附材料，包括选用琼脂糖凝胶为基质，采用N，N’羰基二咪唑作为活化试剂活化载体，以半胱氨酸为枝状间隔臂，具有牛磺酸及吲哚乙酸两种配基，对低密度脂蛋白具有较高吸附选择性的吸附材料的合成过程，其特征在于1)利用N，N’羰基二咪唑活化琼脂糖凝胶，其中琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，N，N’羰基二咪唑的质量浓度为60~220g/L，反应温度25~37℃，反应时间1~2小时；2)利用双氨基试剂合成带有功能基团氨基的琼脂糖凝胶。其中双氨基试剂在溶液中的体积百分比为2~20％，反应温度25~37℃，反应时间2~4小时，带有氨基功能基团的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％；3)占体积百分比为30~50％的琼脂糖凝胶表面的氨基首先在20~60g/L碳二亚胺盐酸盐(EDC)的催化下与浓度为80~160g/L溴乙酸的羧基反应，再与浓度为80~160g/L的半胱氨酸的巯基反应，两步反应的温度均为25~37℃，反应时间均为2~4小时，合成的材料表面带有半胱氨酸枝状分子，其末端活性基团为氨基和羧基；4)利用末端活性基团为氨基和羧基的琼脂糖凝胶合成具有牛磺酸及吲哚乙酸两种配基的低密度脂蛋白吸附材料，具体合成方法是带有氨基的载体先与体积百分比为3~25％的双醛基试剂反应，在室温下反应2~18小时，再与0.2~1.0mol/L的牛磺酸反应，室温反应2~24小时。用双氨基试剂在碳二亚胺盐酸盐的催化下先与载体表面的羧基反应，再进一步与吲哚乙酸反应，其中，吲哚乙酸的浓度为0.2~1.0mol/L，反应时间2~24小时。
5)吸附材料1ml，加入LDL浓度为129.12mg/dl的高脂蛋白血症病人的血浆10ml，在30癈，150rpm的摇床中震荡2.5小时，吸附材料对LDL的清除率为33.5％-46.6％，对HDL的清除率为1.3％-4.2％。
本发明的效果和益处是通过一个具有三个活性基团的枝状连接臂分子--半胱氨酸，将静电功能基和疏水功能基同时键合到材料表面，一方面增加了配基的密度，可以提高吸附剂对LDL的吸附容量，另一方面，能够提高选择性。由于吸附剂对LDL具有两种不同的识别方式，从而能够更好的将LDL和与它具有相似结构的其它脂蛋白，特别是与有益的HDL区分开来。实验证实，对LDL的选择性好于目前的非免疫型LDL吸附剂。

以下结合技术方案，详细叙述本发明的细节和最佳实施例。
实施例1CDI活化琼脂糖凝胶的制备取琼脂糖凝胶0.6~1.0L，用去离子水经过真空抽滤4-5次除去凝胶中的防腐剂，依次以30％、70％、100％的丙酮清洗凝胶，称取60~220g的CDI溶于的1.0L丙酮中，然后把洗好的凝胶加到该溶液中，在25~37℃、150转/分钟摇床中反应1~2小时。反应结束后，用6~10倍体积的丙酮反复清洗已活化的凝胶，真空抽滤，除去反应过程中产生的咪唑。
实施例2氨基琼脂糖凝胶的制备在1.0L的丙酮中加入0.021~0.25L的双氨基试剂(如二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺等)，再加入0.6~1.0L用N，N’羰基二咪唑活化的琼脂糖凝胶，在温度25~37℃，150转/分的摇床中反应2~4小时。反应结束后，用6~10倍体积的去离子水反复清洗反应后的凝胶，然后再用0.15mol/L、pH8.2的硼酸缓冲液清洗胶样。此时琼脂糖凝胶表面的氨基密度50~107mmol/L凝胶。
实施例3半胱氨酸枝状分子与琼脂糖凝胶的偶联将80~160g溴乙酸溶解在1L水中，用NaOH调节溶液pH值至4.5~7.5，把0.6~1.0L氨基琼脂糖凝胶加入此溶液中，再加入20~60g的EDC作为缩合剂，在25~37℃，150转/分钟的摇床中反应2~4小时；反应完毕后使用水和0.1mol/L pH8.0的磷酸缓冲液冲洗凝胶；将该凝胶进一步加入到1L溶有半胱氨酸的磷酸缓冲液中，其中半胱氨酸的浓度为80~160g/L，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为8.0，在25~37℃，150转/分钟的摇床中反应2~4小时。
实施例4偶联牛磺酸和吲哚乙酸的LDL吸附材料的制备首先利用凝胶表面半胱氨酸的氨基通过双醛基试剂偶联牛磺酸。具体反应是将0.6~1.0L偶联有半胱氨酸的凝胶分散到1.0L 0.15mol/L pH8.2的硼酸缓冲液中，再加入双醛基试剂(如戊二醛、乙二醛)0.03~0.25L，在25~37℃，150转/分钟的摇床中反应2~4小时；取出反应体系内的凝胶，用蒸馏水反复清洗，抽滤，然后用2mol/L的醋酸和0.15mol/LpH8.2的硼酸缓冲液清洗凝胶。将该凝胶加入到1.0L 0.2~1mol/L牛磺酸的硼酸缓冲液中，在25~37℃，150转/分钟的摇床中反应2~24小时；使用硼氢化钠还原凝胶至白色，至此，牛磺酸分子被偶联到吸附材料表面。
进一步利用凝胶表面半胱氨酸的羧基通过双氨基试剂偶联吲哚乙酸。具体反应是取偶联牛磺酸的琼脂糖凝胶0.6~1.0L，分散到1.0L 0.1mol/L pH4.5的MES缓冲溶液中，加入20~60g的EDC作为缩合剂，再加入0.021~0.25L的双氨基试剂(如二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺等)，在温度25~37℃，150转/分的摇床中反应2~4小时，反应完毕后，取出凝胶，用6~10倍体积的去离子水反复清洗，此凝胶再分散到1.0L 0.1mol/L pH4.5的MES缓冲溶液中，加入20~60g的EDC作为缩合剂，再加入35~175g吲哚乙酸，在温度25~37℃，150转/分的摇床中反应2~24小时。取出凝胶，用6~10倍体积的去离子水反复清洗干净，备用。至此，偶联牛磺酸和吲哚乙酸的LDL的吸附材料制备完毕。
实施例5偶联牛磺酸和吲哚乙酸的LDL吸附材料的体外静态吸附实验取合成的LDL吸附材料1ml，加入10ml患有高脂蛋白血症病人的血浆，吸附前血浆中LDL、HDL初始浓度分别为129.12mg/dl和18.59mg/dl，在30℃，150转/分钟的摇床中震荡2.5小时后，吸附剂对LDL的清除率为33.5％~46.6％，HDL的清除率为1.3％~4.2％，选择性好于目前的非免疫型LDL吸附剂。


本发明属于生物分离工程技术领域。特别涉及到合成了具有牛磺酸及吲哚乙酸两种吸附功能基的低密度脂蛋白(LowDensity Lipoprotein，LDL)吸附材料，并在高脂蛋白血症病人血浆中进行了吸附试验。生物分离工程领域一种治疗高脂蛋白血症的低密度脂蛋白吸附材料，选用琼脂糖凝胶为基质，以半胱氨酸为枝状间隔臂，具有牛磺酸及吲哚乙酸两种配基。其特征在于1ml的吸附材料，对于10ml的LDL浓度为129.12mg/dl的高脂蛋白血症病人血浆，2.5小时的LDL的清除率为33.5％－46.6％，HDL的非特异性清除率为1.3％－4.2％。本发明的效果和益处是对病人血浆中的低密度脂蛋白具有较高的吸附容量，对高密度脂蛋白的非特异性吸附较小。