专利名称：使用硅胶或复合硅胶载体的酶固定方法 酶指在生物化学反应中完成催化作用的蛋白质，且一般由于在提取后不稳定而不能用于有机溶剂中或高温下。因此，酶反应通常通过简单的分批法进行，其中将底物和可溶性酶混合并在常温下培养。但是，为了回收活性酶，必须从反应混合物中分离酶，但这在技术上是极难的任务。一般使用通过pH改变或热处理从反应混合物中分离酶和污染的蛋白质的方法(Progress in Chemical Industry，25(9)，596(1985))，但这种方法由于反应后活性酶的丧失而不经济。为了解决所述问题，已对这样的方法进行了研究，其中酶的催化活性可以通过将酶物理限制或定位于某空间而重复地呈现，而代表性的实例为固定化酶。例如，韩国专利申请1987-13473公开了通过载体表面上的氨基和酶分子的氨基之间经多功能交联剂的缩合反应而形成席夫碱的方法。另一方面，韩国专利申请1991-123834公开了将G1-7-ACA酰基转移酶固定在具有戊二醛氨基(glutaraldehydroaminogroup)的树脂Doulite A7和Doulite A568上的方法。但是通过所述方法得到的载体存在由于载体表面积小而难以获得高活性固定化酶的问题。另一方面，韩国专利申请1996-703112公开了将DAOD和G1-7-ACA酰基转移酶固定在其中引入了戊二醛氨基的有机硅氧烷聚合物上的方法。但是，在重复使用由所述方法制备的固定化酶的情况下，有机硅氧烷聚合物，载体，破裂并无法用作载体，导致过滤性降低，从而不可能重复使用。如上可见，在有机物质用作载体的情况下，其表现出容易控制微结构且酶的固定特征优良的优点，但在长期使用的情况下表现出由于载体本身膨胀或弱化而使载体的独特特征改变的缺点。相反，在无机物质用作载体时，它表现出优良的耐热性、耐久性、耐化学性，并已知因载体表面上大量存在硅烷醇基团而具有优良的固定特征。因此，本发明的发明人已开发出使用硅胶或复合硅胶，无机材料，作为载体，固定DAOD和G1-7-ACA酰基转移酶的方法。本发明的目的在于提供固定化酶的制备方法，通过该方法，使酶通过固定在硅胶或复合硅胶载体上而即使在长期重复使用的情况下仍保留活性。本发明的另一目的是提供由所述制备方法得到的固定在载体上的酶。
本发明涉及将D-氨基酸氧化酶(DAOD)或戊二酸单酰基-7-氨基头孢烷酸酰基转移酶(G1-7-ACA酰基转移酶)固定在硅胶或复合硅胶载体上的方法。DAOD是Trigonopsis variabilis的突变体的发酵产物，而G1-7-ACA酰基转移酶是大肠杆菌(E coli)重组体的发酵产物。作为用于本发明的载体，硅胶或复合硅胶是优选的。作为所述复合硅胶，可以列举TiO2复合硅胶、Al2O3复合硅胶和ZrO2复合硅胶。对于所述载体，孔径优选在100-1000?的范围内。在孔径为1000?或更高的情况下，每体积载体的酶活性由于载体表面积小而低，而在孔径为100?或更小的情况下，由于孔径小于酶大小而不能将酶充分固定在孔中。优选载体的粒径为40-80目。为了将酶固定在所述载体上，首选需要通过向其表面引入氨基而活化载体。以下的反应式1代表用于活化载体的方法。也就是说，可以通过载体表面上存在的硅烷醇基团和氨基烷基硅烷衍生物之间的硅烷偶联反应使下式1的载体和下式2的氨基烷基硅烷衍生物反应而获得其中引入了氨基的下式3的活化载体。
其中，R代表甲基或乙基；m、n和o独立地代表0-3的整数；而载体代表硅胶或复合硅胶。
作为所述式2的氨基烷基硅烷衍生物，可以列举β-氨基乙基-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、氨基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷和γ-氨基丙基三乙氧基硅烷。
载体的活化方法可以如下详细解释。也就是说，将式1的硅胶或复合硅胶加入有机溶剂中，加入式2的氨基烷基硅烷衍生物，并在回流下进行硅烷偶联反应，优选在100-110℃下进行，以形成其中引入了氨基的式3的水不溶性载体。所述氨基烷基硅烷衍生物的量优选为载体的1-20重量％，优选为2-15重量％。
另一方面，可以通过使如上得到的活化载体与交联剂反应而固定酶。以下的反应式2显示了酶的固定方法。也就是说，使其中引入了氨基的载体(式3)与具有醛基的交联剂(式4)反应，得到下式5的化合物，然后使其与具有氨基的酶(式6)反应，以将酶固定在载体上。
其中，m、n和o独立地代表0-3的整数；载体代表硅胶或复合硅胶；而酶代表DAOD或G1-7-ACA酰基转移酶。
作为式4的交联剂，可以使用聚醛如戊二醛、双醛淀粉和琥珀醛，其中优选戊二醛。
详细的酶固定方法如下。首先，使其中引入了氨基的式3的载体与式4的交联剂反应，形成式5的化合物。交联剂的量优选为载体的20-50重量％。反应于0-30℃在搅拌下进行0.5-4小时。然后使式5的化合物与式6的酶反应，以将酶固定在载体上。优选的酶溶液浓度为30-70U/mL。反应于10-30℃进行0.5-15小时，优选在搅拌下进行1-7小时。反应溶液的pH值和温度应该控制在不导致酶活性降低的范围内。
优选固定化酶的量为50-200U/kg载体。交联反应之后，优选通过用适宜的缓冲液充分洗涤酶固定的载体而消除没有完全结合的可除去的酶和过量的交联剂。
此外，本发明提供固定在载体上的酶，所述酶可以由下式7代表。
其中，载体代表硅胶或复合硅胶；而酶代表DAOD或G1-7-ACA酰基转移酶。

以下通过实施例进一步描述本发明。以下的实施例具体解释本发明，本发明的范围不受实施例的限制。
实施例1硅胶的活化将100g硅胶加入1000mL甲苯中，并将混合物搅拌30分钟。加入10gβ-氨基乙基-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷，并在110℃下回流搅拌3小时，过滤得到活化硅胶。
实施例2DAOD的固定将如实施例1所述活化的40-80目硅胶(50g)加入200mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，并缓慢加入20g戊二醛。将所述反应混合物于20℃下搅拌2小时，并过滤。加入含有DAOD(50U/mL)的水溶液(150mL)，于10℃下搅拌3小时，过滤得到固定化DAOD。
实施例3G1-7-ACA酰基转移酶的固定将如实施例1所述活化的40-80目硅胶(30g)加入500mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，并缓慢加入10g戊二醛。将所述反应混合物于20℃下搅拌2小时，并过滤。加入含有G1-7-ACA酰基转移酶(40U/mL)的水溶液(100mL)，于10℃下搅拌3小时，过滤得到固定化G1-7-ACA酰基转移酶。
实验例1根据孔径测定DAOD的活性和半衰期-DAOD效力测定将100mL底物[溶于100mM KPO4缓冲液的20mM头孢菌素C溶液(pH 8.0)]置于100mL锥形瓶中，用氧饱和，加入300mg DAOD并搅拌。此时，测定由DAOD消耗的氧的量，以确定DAOD活性，并在25℃下用D.O计测定所消耗的氧。DAOD活性单位(U)代表每分钟产生1μmole G1-7-ACA的酶的量。
-半衰期测定将1.2kU DAOD加入1000mL头孢菌素C溶液(将20g纯度为78％的头孢菌素C溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中)中并搅拌。将温度保持在25℃，并通过加入5％NH4OH而将pH值保持在7.5。此时，引入氧(0.1vvm，体积/溶液体积/分钟)，并将内部压力保持在1kgf/cm2。当根据HPLC分析头孢菌素C至G1-7-ACA的转化达到95％时终止反应，并通过测定DAOD效力而确定半衰期。
取决于硅胶孔径的DAOD的初始活性和半衰期的测定结果如表1所示。
表1.

根据表1，可以看出固定化DAOD酶的初始活性和半衰期大大地受硅胶载体孔径的影响，而适当的孔径为100-1000?。
实验例2取决于孔径的G1-7-ACA酰基转移酶的活性和半衰期的测定-G1-7-ACA酰基转移酶的效力测定将50mL底物[溶于5mM KPO4缓冲液中的52mM G1-7-ACA溶液(pH 8.0)]和150mg G1-7-ACA酰基转移酶加入100mL反应器中，并搅拌。通过加入0.1M NaOH而将pH值保持在8.0-10，保持15分钟。此时，测定所消耗的NaOH的量，以确定G1-7-ACA酰基转移酶的活性，并将温度保持在37℃。G1-7-ACA酰基转移酶的活性单位(U)代表每分钟产生1μmol 7-ACA的酶的量。
-半衰期测定将4.8kU G1-7-ACA酰基转移酶加入1000mL G1-7-ACA溶液(将25g纯度为95％的G1-7-ACA溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中)中并搅拌。在大气压下将温度保持在25℃，并通过加入5％NH4OH而将pH值保持为8.0。当根据HPLC分析G1-7-ACA至7-ACA的转化达到95％时终止反应，并通过测定G1-7-ACA酰基转移酶的效力确定半衰期。
取决于硅胶孔径的G1-7-ACA酰基转移酶的初始活性和半衰期的测定结果如表2所示。
表2.

由表2可以看出，固定化G1-7-ACA酰基转移酶的初始活性和半衰期大大地受硅胶载体孔径的影响，而适宜的孔径为100-1000?。
实验例3取决于硅胶种类的G1-7-ACA酰基转移酶的活性和半衰期的测定根据与实施例3相同的方法，将G1-7-ACA固定在孔径为100-300?的复合硅胶上，并如实验例2确定固定化G1-7-ACA酰基转移酶的初始活性和半衰期。结果如表3所示。
表3.

由表3可以看出，即使在使用复合硅胶的情况下，初始活性和半衰期也是优良的。
工业实用性根据本发明的固定在载体上的酶，在DAOD的情况下活性为64-70U/g，在G1-7-ACA酰基转移酶的情况下为108-118U/g，高于现有技术的情况(韩国专利申请1991-23834第24页的表1和表2)，在DAOD的情况下半衰期98倍或更大，在G1-7-ACA酰基转移酶的情况下是139倍或更大，非常稳定。


本发明涉及将D－氨基酸氧化酶(DAOD)或戊二酸单酰基－7－氨基头孢烷酸酰基转移酶(G1－7－ACA酰基转移酶)固定在硅胶或复合硅胶载体上的方法，而根据本发明制备的固定化酶具有优良的初始活性和活性半衰期。