专利名称：一种高通量微流控生物力学长期刺激系统及其应用的制作方法生物体内细胞处于一个充满力学刺激的环境、生物力学刺激参与了胚胎发育、骨组织平衡、正常心血管系统维持等正常生理过程，而异常的生物力学刺激则可引起动脉血管硬化、骨质疏松等疾病的发生、发展。虽然力学刺激功能异常是导致某些疾病的重要因素，但其作用机理尚不清楚，而传统研究方法的局限性阻碍了相关研究进展。近年来，力学刺激体外研究模型的建立和应用大大促进了相关研究的进展。体内最常见的两种生物力学刺激是流体剪切力和拉伸力，几乎所有的脉管系统如血管、输尿管、以及组织间隙如骨间隙等均存在这两种力。目前已有的体外模型有的只能研究流体剪切力，如层流板，也有的只能研究拉伸力，然而，细胞所处的生物体内是一个有着多种力学刺激的复杂环境，一个更接近体内环境的生物力学体外研究模型必须考虑多种力学刺激对细胞的作用。近年来，人们设计和改进了一些能够同时施加流体剪切力和牵张应力的装置(Moore，J.E.，Burki, E., Suciu, A., Zhao, S.Μ., Burnier, Μ., Brunner, H.R.and Meister, J.J.(1994)A Device for Subjecting Vascular Endothelial-Cells to Both Fluid Shear-Stressand Circumferential Cyclic Stretch.Ann Biomed Eng.22,416-422 ；Qiu, Y.C.andTarbell, J.M.(2000)Interaction between wall shear stress and circumferentialstrain affects endothelial cell biochemical production.J Vasc Res.37，147—157 ；Toda, M.，Yamamoto，K.，Shimizu, N.，Obi，S.，Kumagaya, S.，Igarashi，T.，Kamiya, A.andAndo, J.(2008)Differential gene responses in endothelial cells exposed to acombination of shear stress and cyclic stretch.J Biotechnol.133，239-244)，其基本的原理是用内壁贴附了内皮细胞的硅橡胶管模拟血管，在管腔内保持一定压力的情况下通过管腔的扩张给粘附的细胞施加牵张应力，同时通过液体的冲刷给细胞施加剪切应力。但是，上述装置的缺点也很明显，即细胞在管壁的粘附不好控制、不能对细胞在力学刺激下的行为进行实时观察以及干预等，这些问题也制约着相关研究的进展。近年来，微流控技术的快速发展为许多疾病病理研究模型的建立提供了契机，微流控芯片可以为细胞提供更接近于生理、病理条件下的微环境，可以结合表面化学和软刻蚀技术对细胞行为进行操控和干预，还可以在细胞群体和单细胞两种水平对细胞的行为变化进行观察和分析。Huh等(Huh, D.,Matthews, B.D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, Μ., Hsin, H.Y.and Ingber,D.Ε.(2010) Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.Science.328,1662-1668)采用的微流控装置可以对贴附在膜上的细胞产生流体剪切力和拉伸力，其用途是模拟和研究肺泡功能。Douville 等(Douville, N.J., Zamankhan, P., Tung, Y.C., Li, R.，Vaughan, B.L., Tai, C.F., White, J., Christensen, P.J., Grotberg, J.B.and Takayama,S.(2011)Combination of fluid and solid mechanical stresses contribute to celldeath and detachment in a microfluidic alveolar model.Lab Chip.11,609-619)米用的微流控装置同样可以提供流体剪切力和机械拉伸力，其用途也是模拟和研究肺泡的结构和功能。然而，上述的微流控装置只适合做肺泡模型，并且很难进行长时间对细胞进行力学刺激的实验。因为长时间微流控细胞培养和实验面临诸如温度和酸碱度控制、气泡产生、堵塞、漏液等问题，其中任何一个问题都可能导致实验的失败。发明内容因此，本发明的目的是针对现有的微流控装置只适合做肺泡模型，并且很难进行长时间对细胞进行力学刺激的实验的不足，提供一种同时提供流体剪切力和拉伸力，并可以提供长时间生物力学刺激的微流控系统及其应用，为相关研究提供有效工具。针对上述技术目的，本发明的技术方案如下:一方面，本发明提供一种高通量微流控生物力学长期刺激系统，包括至少一个生物力学刺激微流控装置、细胞培养驱动系统和负压发生器，所述细胞培养驱动系统与微流控装置连接以驱动微流控装置的微流通道内的液体流动；所述负压发生器与微流装置相连以使其产生负压，其用于生物力学刺激的器官、组织的生理、病理状况的高通量观察和检测。优选地，所述生物力学刺激微流控装置包括透明的微流通道模块和与其相适配的透明的负压产生模块，所述微流通道模块底部和负压产生模块顶部通过弹性膜相键合，所述生物力学刺激微流控装置是所述微流通道模块、所述弹性膜、所述负压产生模块的整合体，所述微流通道模块用于流体流动，所述负压产生模块用于产生使弹性膜发生形变的负压；所述微流通道模块顶部设有流体出口和流体入口，所述流体出口和流体入口分别通过与流体入口和流体出口相适配的第一 PE管连接于微流通道，并与其相贯通，所述微流通道设于所述微流通道模块底部；所述负压产生模块顶部设有负压凹槽，所述负压凹槽设于微流通道下方，所述负压产生模块顶部设有一个气路开口，所述气路开口通过与其相适配的第二 PE管与负压凹槽相连。优选地，所述细胞培养驱动系统包括储液瓶和与其连接的蠕动泵，所述生物力学刺激微流控装置、所述储液瓶、所述蠕动泵通过所述第一 PE管串联形成循环流体通路；所述储液瓶通过所述第一 PE 管和所述流体出口与所述微流通道相连，所述蠕动泵通过所述第一 PE管与所述储液瓶相连，所述蠕动泵通过第一 PE管和所述流体入口与所述微流通道相连以驱动微流通道内的流体流动。
优选地，所述负压发生器包括气流分配器、气流控制器和微型真空泵，所述气流分配器底部通过第二 PE管连接至气流开口与负压发生模块连接，以使负压发生模块产生负压；所述气流控制器包括控制器和电动气流开关，所述气流分配器顶部和微型真空泵均连接至电动气流开关的第一端，所述电动气流开关的第二端与控制器相连。
优选地，所述负压凹槽一侧还设有与其相贯通的负压缓冲池，所述第二 PE管通过负压缓冲池与负压凹槽相连。
优选地，所述负压缓冲池通过一个凹槽与负压凹槽相贯通，优选地，所述第二 PE管垂直连接于负压缓冲池底部。
优选地，所述负压凹槽中间围绕一个长方形平台，和所述弹性膜紧贴并对应于其上方的所述微流通道，所述长方形平台和所述弹性膜间填充有液体润滑剂；优选地，所述负压产生模块的顶部和底部封合而成一体结构，所述长方形平台长为1.5Χ104μπι，宽为1.0Χ IO3 μ m,。
优选地，所述微流通道呈第二长方体结构，其由第三、第四侧壁和微流通道底部，所述微流通道底部由弹性膜构成，优选地，所述第二长方体的长为1.8X IO4 μ m，宽为1.5 X IO3 μ m,高为 0.5 X IO3 μ m。
优选地，所述微流通道模块的顶部和底部通过第一、第二侧壁连接成水平方向贯通的第一长方体结构，所述第一、第二侧壁和顶部由聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块构成，优选地，所述第一长方体的长为2.5-3.0XlO4Um,宽2.0-2.5X104ym,高为3.0-5.0 X IO3 μ m。
优选地，所述微流通道模块、负压产生模块和弹性膜均由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成。
优选地，所述流体出口和流体入口均为圆形孔，优选地，所述圆形孔的直径为8.0X IO2 μ m ;所述第一 PE管垂直连接于所述微流通道模块底部。
优选地，所述负压产生模块的顶部呈长方形，该长方形的长为2.5-3.0X IO4 μ m，宽为2.0-2.5 XlO4Um,所述负压凹槽呈第三长方体结构，其截面为长方形，高为5X IO2 μ m，宽为2.5X IO2 μ m ;所述负压缓冲池呈垂直于平台区的圆柱形空腔状，所述圆柱形空腔的直径为5.0X IO3 μ m,高为1.0X IO3 μ m ;所述凹槽呈第四长方体结构，其长为3.0 X IO3 μ m，宽为5 X IO2 μ m,高为5 X IO2 μ m ;所述气路开口为圆形孔，优选地，所述圆形孔的直径为8 X IO2 μ m。
优选地，所述微流通道膜块和负压产生膜块长均为2.5-3.0X IO4 μ m，宽均为 2.0-2.5 X IO4 μ m，厚均为 3.0-5.0 X IO3 μ m ;所述弹性膜长为 2.5-3.0 X IO4 μ m，宽2.0-2.5 X IO4 μ m,厚为 10-100 μ m。
另一方面，本发明提供一种高通量微流控生物力学长期刺激系统在生物力学刺激研究、相关药物的高通量检测 和筛选或在制备用于生物检测的试剂盒中的应用。
又一方面，本发明提供了一种微流控生物力学刺激系统在制备用于生物检测的试剂盒中的应用，优选地，所述试剂盒为为体外生物力学刺激研究或相关药物的高通量检测和筛选的试剂盒。
再一方面，本发明提供一种用于生物检测的试剂盒，该试剂盒包括根据本发明的高通量微流控生物力学长期刺激系统，还包括检测试剂和缓冲液，优选地，所述检测试剂为细胞力学相关的细胞因子、抗体、活性小分子或用于筛选的药物。
本发明的有益效果为:基于微流控技术，通过合理设计和整合微流通道模块、弹性膜、负压产生模块的生物力学刺激微流控装置，能够同时提供流体剪切力和机械拉伸力，一个系统可同时包括多个微流控装置，用于生物力学刺激的器官、组织的生理、病理状况的高通量观察和检测，建立体内疾病的体外模型，为相关研究提供有效工具，体积小，结构简单，易于制作和使用；光学透明材料制作，易于肉眼或镜下观察通道内的情况，可以在显微镜和培养箱之间任意转换，可以实现对细胞在两种力学刺激下以及化学刺激下的原位动态监测，两种力学刺激的大小、频率随时可调，可以随时改变细胞的化学微环境，温度、酸碱环境恒定，系统可保持长时间稳定工作；实现高通量观察和检测。


以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
图1为本发明所述的高通量微流控生物力学长期刺激系统的结构示意图2为本发明所述的生物力学刺激微流控装置的结构示意图3为所述弹性膜放置于本发明所述的系统的微流控装置中进行拉伸的实验结果示意图，图中a为拉伸前的弹性膜的结果示意图，图中b为拉伸后的弹性膜的实验结果示意图4为将大鼠骨髓基质干细胞(MSC细胞)输入本发明所述的系统的微流控生物力学刺激装置中后与MSC细胞单独拉伸和单独剪切进行对比的实验结果示意图，图中a为MSC细胞单独拉伸的实验结果示意图，b为MSC细胞单独剪切的实验结果示意图，c为MSC细胞在本发明的装置中经拉伸和剪切后的实验结果示意其中:
I为微流通道模块，101为微流通道模块的顶部，102为微流通道模块的底部，103为第一侧壁，104为第二侧壁，105为流体入口，106为流体出口，107为第一 PE管，108为微流通道，1081为微流通道顶部、1082为微流通道底部、1083为第三侧壁、1084为第四侧壁；
2为弹性膜；
3为负压产生模块，301为负压产生模块的底部，302为负压产生模块的顶部，303为负压凹槽，304为气流开口，303负压凹槽，305为第二 PE管，306负压缓冲腔，307为凹槽，308为长方形平台；
4为生物力学刺激微流控装置；5为储液瓶；6为蠕动泵；7为气流分配器；8为控制器；9为电动气流开关；10为微型真空泵。

如图1所示，本发明所述的高通量微流控生物力学长期刺激系统，包括细胞培养驱动系统5、负压发生器6和一个生物力学刺激微流控装置4，所述细胞培养驱动系统与生物力学刺激微流控装置连接以驱动生物力学刺激微流控装置的微流通道内的液体流动；所述负压发生器与生物力学刺激微流装置相连以使其产生负压。
所述细胞培养驱动系统包括储液瓶5和与其连接的蠕动泵6，所述储液瓶5通过流体入口 105与微流通道108相连，所述蠕动泵6通过流体出口 106与微流通道108相连以驱动微流通道内的流体流动。`
所述负压发生器包括气流分配器7、气流控制器和微型真空泵10，所述气流分配器7底部通过第二 PE管305连接至气流开口 304与负压发生模块3连接，以使负压发生模块3产生负压；所述气流控制器包括控制器8和电动气流开关9，所述气流分配器7顶部和微型真空泵10均连接至电动气流开关9的第一端，所述电动气流开关9的第二端与控制器8相连。
所述储液瓶501的容量为50毫升，瓶盖和瓶体能够拧紧密封，瓶盖有三个孔，分别为液态流入孔，液体流出孔、换气孔。液体流入孔和流出孔均由直径为8.0X IO2 μ m的PE管穿过，两管均开口于液面以下，PE管和瓶盖之间通过浇注PDMS而密封。换气孔由内径为8.0XlO2Um的针头穿过，针头在瓶内部分位于液面以上，针头的另一端和孔径为0.22微米的针式滤器连接，开口于空气中。针头穿过瓶盖部分以及针头和滤器连接部分均密封。
所述蠕动泵502的规格:能够提供最小流量为2微升/分钟，滚轴为10个，两通道。
所述微型真空泵603，流量为28升/分钟，真空度为10千帕。
所述电动气流开关6022的结构类似注射器，由圆柱体形外壳和活塞组成。外壳材料为铜，内径为I厘米，长5厘米，在底部有两个开口，内径为5毫米，分别连接抽气管的近、远两端。外壳的中部(2.5厘米处)有一个开口，内径为3毫米。活塞部分材料为不锈钢，长为6厘米，外径为0.5厘米，活塞头部材料为聚四氟乙烯，其外径和外壳的内径相当，与壳体之间紧密摩擦形成对气体的密封。活塞的尾部通过轴承以及连杆和固定于步进电机轴上的圆盘相连。步进电机和控制器6021通过信号线连接，控制器6021可以调节电机转速和方向。
所述气流分配器:由PDMS材料制作，体积为外径为2厘米，高为2厘米的圆柱体，内为直径I厘米，高为I厘米的圆柱体空腔。在圆柱体的正上方有一个孔，连接内径为2毫米的PE管，该管通过孔径变换接头连接到气流控制器的远端开口。在圆柱体空腔的圆柱面上，分别开4-6个孔并和0.8晕米外径、0.5晕米内径的PE管连接,该PE管连接到微流芯片的负压气孔开口，多个PE管可以连接多个芯片。
如图2所示，本发明所述的微流控装置4，该装置包括透明的微流通道模块I和与其相适配的透明的负压产生模块3，所述微流通道模块底部和负压产生模块顶部通过弹性膜2经等离子氧化处理共价键合，所述微流通道模块2、负压产生模块3和弹性膜2均由PDMS材料制成，所述弹性模2为长2.5-3.0 X IO4 μ m,宽2.0-2.5 X IO4 μ m,厚为10-100 μ m的弹性模2，，所述微流通道模块I用于流体流动，所述负压产生模块3用于产生使弹性膜2发生形变的负压；所述微流通道模块顶部101和底部102通过第一、第二侧壁103、104连接成水平方向贯通的第一长方体结构，所述第一长方体的长为2.5-3.0X IO4Um,宽 2.0-2.5XlO4U m,高为 3.0-5.0XlO3Um,所述微流通道模块为长 2.5-3.0XlO4Um,宽2.0-2.5 X IO4 μ m，厚为3.0-5.0XlO3Um的PDMS模块，所述微流通道模块顶部101设有流体入口 105和流体出口 106，所述流体入口 105和流体出口 106分别通过与流体入口105和流体出口 106相适配的第一 PE管107垂直连接于微流通道模块底部102的微流通道108，所述微流通道108呈第二长方体结构，其由微流通道顶部、底部1081、1082和第三、第四侧壁1083、1084构成，并与其相贯通，所述微流通道底部由弹性膜构成，所述第二长方体的长为1.8 X IO4 μ m，宽为1.5 X IO3 μ m，高为0.5 X IO3 μ m，所述流体入口 105和流体出口 106均为圆形孔，所述圆形孔的直径为8.0X IO2 μ m ;所述负压产生模块3的底部301和顶部302封合而成一体结构，所述负压产生模块3由PDMS模块构成，所述负压产生模块长为 2.5-3.0XlO4Um,宽为 2.0-2.5Χ104μπι，厚为 3.0-5.0X IO3 μ m，所述负压产生模块顶部302设有负压凹槽303，所述负压凹槽303设于微流通道108的下方，从而形成与微流通道108相隔离的单独的空间，所述负压产生模块顶部302设有一气路开口 304，所述气路开口 304通过与其相适配的第二 PE管305与负压凹槽303相连，所述负压凹槽中间围绕一个长方形平台308，和所述弹性膜紧贴并对应于其上方的所述微流通道108，长方形平台长为1.5 X IO4 μ m，宽为1.0X IO3 μ m，所述长方形平台308与弹性膜2不键合，添加液体润滑剂，使之在负压作用下相互之间可以移动，所述负压凹槽303 —侧还设于与其相贯通的负压缓冲池306，所述第二 PE管305通过负压缓冲池306与负压凹槽303相连，所述负压缓冲池306通过一个凹槽307与负压凹槽303相贯通，所述第二 PE管305垂直连接于负压缓冲池306底部，，所述负压产生模块的顶部302呈长方形，该长方形的长为2.5-3.0X IO4 μ m，宽为2.0-2.5Χ104μπι，所述负压凹槽303呈第三长方体结构，其截面为长方形，高为5.0XlO2Um,宽为2.5X IO2 μ m ;所述负压缓冲池306呈垂直于底部301的圆柱形空腔状，所述圆柱形空腔的直径为5.0X IO3 μ m,高为1.0X IO3 μ m ;所述凹槽307呈第四长方体结构，其长为3.0Χ103μπι，宽为5.0Χ102μπι，高为5.0 X IO2 μ m ;所述气路开口 304为圆形孔气路开口，所述圆形孔气路开口 304的直径为8.0 X IO2 μ m。
使用时，首先通过微流通道模块I的流体入口 105将细胞悬液加入微流通道108，在37摄氏度5%二氧化碳条件下，使细胞贴壁于微流通道108底部的弹性膜2上，然后，将微流通道108的流体入口 105和流体出口 106与细胞培养基驱动系统5连接；再将负压产生模块3的气路开口 304通过第二 PE管和负压发生器6连接，然后，开动细胞培养基驱动系统5，细胞培养基驱动系统5可以驱动微流通道108内的液体流动，从而对微流通道108内基底上附着的细胞产生流体剪切力，而负压发生器6产生的负压可以通过第二 PE管305传导入负压产生模块3内的负压凹槽303内，使负压凹槽303上方的弹性膜2发生形变，从而拉动贴于长方形平台的弹性膜2，使之发生水平方向的形变，从而使贴附在上面的细胞受到机械拉伸力。由于弹性膜2在平行于通道长轴方向上的形变非常小，可以忽略不计，施加在弹性膜2以及弹性膜 上细胞的力主要是垂直于通道长轴方向的，因此，细胞的受力情况为:平行于通道方向的流体剪切力和垂直于通道方向的机械拉伸力。
具体试骀实施例
试骀实施例1
将弹性膜(PDMS膜，其上面印有荧光标记蛋白点阵)放置于本发明所述的高通量微流控生物力学长期刺激系统的微流控装置中进行拉伸，结果如图3所示，经负压拉伸后的PDMS膜，与拉伸前的PDMS膜相比，拉伸率达25%，其拉伸率和均匀性能够达到预期效果，完全满足模拟体内试验的需要。
试骀实施例2
将MSC细胞(大鼠骨髓基质干细胞，取自SD大鼠(购自北京维通利华实验动物公司)，提取方法参考以下文献进行:Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, Takagi S, OkumuraM, Fujinaga T.1solation and multilineage differentiation of bovine bone marrowmesenchymal stem cells.Cell Tissue Res2005 ；319:243-53.)输入本发明所述的高通量微流控生物力学长期刺激系统的微流控装置中，与MSC细胞单独拉伸和单独剪切的结果相t匕，如图4所示，从该图可以看出单独拉伸可以使细胞的骨架沿拉伸力平行方向排列，而单独流体剪切力可以使细胞骨架沿剪切力方向排列；拉伸力和流体剪切力的合力则可使细胞骨架的排列呈现与合力方向相同的趋势。因此，流体剪切力和拉伸力对血管内细胞的排列有重要影响，从而说明本发明的系统为相关研究的有力工具。


本发明提供一种高通量微流控生物力学长期刺激系统及其应用，包括至少一个生物力学刺激微流控装置、细胞培养驱动系统和负压发生器，所述细胞培养驱动系统与微流控装置连接以驱动微流控装置的微流通道内的液体流动；所述负压发生器与微流装置相连以使其产生负压；及其在体外生物力学刺激研究、相关药物的高通量检测和筛选或制备用于生物检测的试剂盒中的应用。本发明的系统基于微流控技术，通过合理设计和整合微流通道模块、弹性膜、负压产生模块的微流控装置，能够同时提供流体剪切力和机械拉伸力，建立体内疾病的体外模型，为相关研究提供有效工具，易于制作使用，可同时连接多个动脉血管模拟微流控装置，实现高通量观察和检测。