专利名称：一种基于微流控技术制备单分散性微乳、脂质体和微球的方法微流控技术是一项重要的科学技术，它的主要特征就是集成化和微型化，将在疾 病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全、司法鉴定、体育竞技以及反恐、航天等领域发挥作 用。微流控芯片主要是以微通道网络和各种功能单元集成化为特点，对微量样品在微观尺 度上进行操控和处理，实现微量样品的制备、反应、分离和检测。而液滴是近年来在微流控 芯片上发展起来的一种全新的操控微小体积液体的技术。作为一种全新的技术，液滴最常 见的应用是作为微反应器，研究微尺寸上的反应及过程。在这些应用中，制备均一尺寸可控 的微乳、脂质体以及生物降解性微球在药物的输送方面有着重要的应用。目前制备微乳、脂 质体以及生物降解性微球的方法主要是采用“top-down”的方式，即传统的超声、机械搅拌 等，采用这些方法在制备乳液过程中，由于粒径不均一，小的乳液会被大的乳液吸收，同时 大的乳液又会因剪切力的作用而破坏；在乳液聚合过程中，会形成许多聚合凝聚物，同时， 在乳液的合并与破裂过程中，内包药物、酶以及细胞等目标物容易逃逸到乳液表面，导致目 标物包埋率低。因此传统方法获得的微乳、脂质体以及生物降解性微球存在粒径分布宽，形 态难以控制，且重复制备的结果偏差较大，给微乳、脂质体以及生物降解性微球的实际应用 带来许多困难。例如，亲水性药物在采用常用的薄膜水化分散法制备脂质体时，包封率低， 载药量难以满足治疗需要。作为药物载体，粒径的大小决定其在体内的分布并影响其与生 物体器官以及细胞的作用，小粒径载体可将注射部位的潜在刺激减小到最低程度；而且如 果应用单分散载体，药物的释放动力特性能够得到有效控制，从而可以更容易地构造较复 杂的药物释放系统。另外作为酶的固定化和蛋白质分离介质，由于粒径不均一，小的微球会 聚集到大微球之间的间隙中，使得分离压力增大，严重时会导致分离无法进行；作为细胞培 养载体，粒径不均一会导致养分和细胞密度的不均勻，从而导致细胞生长的不均勻；作为药 物缓释载体，由于乳液不稳定会导致药物的包埋率大大降低，另外由于粒径不均一，在系统 给药中使药物的靶向性差，导致药物在体内的生物利用度大大降低，另外制备批次之间的 差异，导致无法准确考察药物释放模式，使其应用大大受到限制。因此研究新型制备方法， 制备出单分散性微乳、脂质体和生物降解性微球，以便克服传统制备方法的不足以及由此 带来的应用上的限制。由于微流控技术产生的液滴具有样品无扩散、反应条件稳定、单分散性好，无交叉 污染以及混合迅速等特性，因此基于“bottom up”思想的微流控技术制备的微乳、脂质体以 及生物降解性微球具有形状可控、大小均勻、适用材料多样性等优点。通过将药物、酶和细 胞等引入液滴，产生单分散性微乳、脂质体以及生物降解性微球，提高传统制备方法尺寸无 法统一、目标物包裹率低、重复性差等问题，以期构建一种可以控制药物释放、提高药物生物利用度、保持酶与细胞生物活性，提高药物载体的靶向性，减少药物的系统毒性以及细胞 移植过程中的免疫抑制和同种过敏反应等。
本发明针对各类亲水性药物和脂溶性药物，酶与细胞等制备尺寸均一、分散稳定 的0/W、ff/Ο以及W/0/W等微乳，脂质体以及生物降解性微球，以用于药物的输送、控制与释 放；酶的固载以及活性保持；细胞的培养、功能表达以及靶向移植等。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种可制备单分散性微乳、脂质体和生物降解性微球的微流控芯片装置，包括微 量泵、产生不同尺寸液滴的微流控芯片、液滴接收和储存容器；(1)根据制备微乳的性质， 对芯片微通道进行相应的疏水性或亲水性修饰；如当制备W/0微乳时，可采用由PDMS或玻 璃制成的内壁具有疏水性的微通道；当制备0/W微乳时，需采用聚合物(如聚乙烯醇等)对 PDMS微通道进行表面修饰，使其内壁表现为亲水性质；特别是，通过吸附自组装-热固化 法，采用质量浓度5%丙三醇-2%聚乙烯醇的混合溶液对PDMS微通道进行修饰，可使修饰 后的PDMS表面具有超亲水性。(2)将亲水性药物(或脂溶性药物)溶于水相(或油相)， 然后以水相(或油相)为分散相，油相(或水相)为连续相，剪切成单分散性包裹药物的 单层或多层微乳；C3)根据药物性质制备成相应的溶液，从中间微通道通入，将脂质体或生 物相容性聚合物的溶液通入两侧微通道，然后使用与上述溶液性质相反的连续相将上述溶 液剪切为单分散性包裹药物的液滴，再采用一定的固化方法使液滴固化，得到尺寸均一、分 散稳定的载药脂质体微球或生物可降解微球。在优化条件下，微乳和微球的直径分布系 数(CV值，定义见下式)控制在5%以内，在微通道尺寸确定情况下(本发明以200微米为 例)，通过调节分散相浓度、分散相和连续相的流速可以自由调节实现微乳、脂质体或微球 的直径在10-500微米；用于药物载体时药物包埋率高、储存稳定，在优化条件下包埋率接 近100%。用于包裹酶和细胞时，包裹率高，活性损失小。上述直径分布系数(Coefficientof Variation, CV) = {[Σ ((Ii-(I) 2/Ν]1/2/ d} X 100%式中，Cli为各个微乳、脂质体和聚合物微球的直径，d为所研究微乳、脂质体和聚合 物微球的平均直径，N为用于研究直径的微乳、脂质体和聚合物微球个数，N = 100个。本发明所提供的制备单分散性载药微乳的方法，包括下述步骤以含水溶性(脂 溶性)药物的水溶液(油溶液)作为分散相；以含W/0型(0/W型)乳化剂的油溶液(水溶 液)作为连续相；将所述分散相和连续相分别输送到微流控芯片装置的相应微通道，通过 所述微流控芯片装置制备得到w/o(o/w)微乳，将微乳收集在装有连续相或交联剂溶液的 容器中，得到载药微乳。本发明所提供的制备单分散性载药脂质体的方法，包括下述步骤以含水溶性 (脂溶性)药物和空白脂质体(即不含药脂质体)的水溶液(油溶液)作为分散相；以含 W/0型(0/W型)乳化剂的油溶液(水溶液)作为连续相；将所述分散相和连续相分别输送 到微流控芯片装置的相应微通道，通过所述微流控芯片装置制备得到w/o(o/w)微乳，将产 生的微乳冷冻干燥，得到载药脂质体。本发明所提供的制备单分散性载药微球的方法，包括下述步骤以含水溶性药物(脂溶性)和生物可降解聚合物的水溶液(油溶液)作为分散相；以含W/0型(0/W型)乳 化剂的油溶液(水溶液)作为连续相5 ；将所述分散相和连续相分别输送到微流控芯片装 置的相应微通道，通过所述微流控芯片装置制备得到W/0(0/W)微乳，将微乳收集到装有连 续相或交联剂溶液的容器中，根据所述生物可降解聚合性质来采用不同的固化方式(如 冷冻干燥、加热去除溶剂、加入交联剂聚合等)进行固化，得到载药微球。本发明所提供的制备单分散性包裹酶和细胞的微乳、脂质体以及微球的方法，与 上述方法相同，只是在选择分散相和连续相时应注意使用生物相容性的物质，减少对酶和 细胞的活性影响。本发明制备的微乳中，所包裹药物(酶或细胞)的浓度可通过调节微流道中分散 相和连续相的流量来调节。在制备载药脂质体或载药微球时，脂质体或微球的大小，可通过分散相中脂质体 或生物可降解聚合物的浓度来调节(当其它条件固定时，脂质体或聚合物浓度越大，则产 生的脂质体或微球尺寸越大)，或者通过分散相和连续相的流量来调节(当分散相流量固 定时，连续相流量越小(越大)，产生微球尺寸越大(越小)；连续相流量固定时，分散相流 量越大(越小)，产生微球尺寸越大(越小))。在上述制备载药或包裹酶和细胞的微乳、脂质体或微球的方法中，连续相中表面 活性剂的质量浓度可为0. 5%-10%，优选范围为0. 5%-4%。在制备包裹酶和细胞的微乳、 脂质体或微球的方法中，应选择生物相容性好的表面活性剂。本发明中，所述水溶性药物包括水溶性抗癌药、核酸、RNA、干扰素、各种蛋白、酶以 及多肽药物等，可根据需要一起或单独溶于水相；脂溶性药物包括脂溶性抗癌药、激素以及 其它各种脂溶性药物等。所使用的乳化剂一般使用非离子表面活性剂。本发明制备的单分散性微乳、脂质体或微球药物载体，以及包裹酶和细胞的脂质 体或微球具有以下优点(1)本发明提供的方法可用于制备各种类型微乳、脂质体以及聚 合物微球，可用于包埋多种亲水性和脂溶性药物，例如包埋紫杉醇、吡柔比星、5-氟尿嘧啶 等；也可用于固载酶和细胞的培养、移植等，如固载胰岛素酶用于糖尿病的治疗，包裹重组 脲酶基因的细胞用于研究对体内有害物质的分解，为尿毒症的治疗奠定一定基础；调控微 乳、脂质体和微球的尺寸，可用于皮下注射、静脉注射、口服、动脉栓塞等。(2)本发明提供的微乳、脂质体或微球作为药物载体，由于尺寸均一并且可控，批 次之间重复性好，因此在研究药物释放动力学、以及不同药物及其治疗效果之间的关系显 得更为精确和简单。作为药物载体，其尺寸大小与其在体内的分布位置和时间有着一定的 关系，不同的药物在体内不同位置产生的疗效也不尽相同；因此对不同药物制备一系列单 分散性包裹药物的微乳、脂质体或微球，并分别用药，从而可以找出不同药物在不同尺寸的 用药效果，从而找出不同药物所需的最佳尺寸范围。如果作为药物载体的微乳、脂质体或微 球尺寸不均一，则无法有效地开展相关研究。(3)本发明提供的制备方法，条件温和，可望能够保持多肽、蛋白等生物活性药物 的高活性。(4)本发明提供的微乳、脂质体或微球尺寸均一，可望实现稳定的、重现性好的药 物控制释放。(5)本发明提供的脂质体或微球可用于酶的固载以及细胞培养、移植使用，条件温和，可望保持酶和细胞的活性，实现二者的功能性。本发明的方法解决了搅拌乳化、超声等传统技术制备载药微乳、脂质体和聚合物 微球中的诸如粒径分布不均勻，形态难以控制，药物包埋率低，批次之间有着较大差异等缺 陷。且传统制备微球的方法影响药物的释放行为和降低其靶向性，在临床上无法考察粒径 与不同疾病及治疗效果之间的关系，使其应用大大受到限制。可利用微流控制备的微乳、脂 质体和微球粒径的均一特性，达到稳定的可控的释放药物，精确考察药物释放行为、释放机 理以及动力学模型，为临床应用奠定一定的基础。同时，可望解决血药浓度起伏大问题，减 少药物的的毒副作用，延长药物作用时间，提高药物在体内利用率和治疗效果。该制备方法 工艺简单，操作条件温和，重复性好，容易放大。图1为本发明制备单分散性微乳、脂质体或微球的微流控芯片示意图；其中，图IA 是一种最简单的微流控芯片示意图，由进口 1引入分散相，进口 2和3引入连续相，出口 4 引出微乳或脂质体、聚合物液滴；图IB是一种制备单分散性多功能化微乳、脂质体或微球 的微流控芯片示意图，进口 1引入连续相，进口 2-4可分别引入多组分药物、磁性纳米粒子、 脂质体以及多组分聚合物等，从而实现药物、聚合物多组分以及磁性等多功能化微乳、脂质 体或微球，出口 5引出液滴。图2为实施例1聚乳酸微球的微流控制备示意图；其中，进口 1引入溶有聚乳酸的 氯仿溶液，进口 2-3引入2%聚乙烯醇(PVA)的水溶液，产生单分散性液滴。图3为实施例1中液滴产生的光学显微照片；其中，图3(b)是液滴产生区域的光 学显微照片；图3 (c)是液滴在微通道尾部的光学显微照片( = 0. 20mL/h, Q2 = Q3O. 15mL/ h谇表示分散相流速；Q2 = Q3表示连续相流速，下同)。图4为采用吸附自组装-热固化法对PDMS修饰后的接触角照片(图中接触角是 采用与微流控通道同样修饰方法修饰的PDMS薄片所测数值)，其中，图4 (a)是PDMS的接触 角(120°，疏水)；图4 (b)是PVA修饰的PDMS的接触角(52°，亲水)；图4 (c)是PVA/丙 三醇(Gly)修饰的PDMS的接触角(5°，超亲水)。图5为光学显微照片；其中，图(a-c)为载玻片上聚乳酸液滴的阵列；图(d)是聚 乳酸液滴在容器中固化过程，颜色较深表明已固化，颜色较浅的表明为液滴或半固化(单 色图)；图(e-f)为固化聚乳酸微球。流速条件(a)Gj1 = 0. 15mL/h ;Q2 = Q3 = 0. 35mL/h ； (WQ1 = 0. 20mL/h ；Q2 = Q3 = 0. 15mL/h ； (C)Q1 = 0. 25mL/h ；Q2 = Q3 = 0. 45mL/h ； (d)-(f) Q1 = 0. lOmL/h, Q2 = Q3 = 0. 15mL/h.图中标尺为 100 微米。图6为实施例2制备的不同粒径的载药聚乳酸微球的光学显微照片(a_b)及尺寸 分布图(c)。流速条件(a)Q1 = 0. 15mL/h，Q2 = Q3 = 0. 35mL/h ； (WQ1 = 0. 20mL/h，Q2 = Q3 = 0. 15mL/h，标尺为50微米，内插图片的标尺为25微米。图7为实施例2制备的不同尺寸不同载药量的紫杉醇-聚乳酸微球体外药物释放 图，其中，a)为紫杉醇累积释放图，b)为释放量与释放时间的对数图；S a_b说明S表示样 品，a代表粒径(1表示31微米，2-表示50微米)，b代表理论载药量(1表示1毫克，2表 示2毫克)。图8为实施例3制备的包裹吡柔比星的聚乳酸液滴光学显微照片。图9为实施例4制备的包裹吡柔比星的聚乳酸微球光学显微照片。图10为实施例4制备的不同尺寸不同载药量的吡柔比星-聚乳酸微球体外药物 释放图。图11为实施例5制备的聚乳酸-羟乙酸的液滴和微球光学显微照片。图12为实施例6制备的不同放大倍数的壳聚糖微球光学显微照片。图13为实施例7制备的不同放大倍数的海藻酸钙微球光学显微照片。图14为用于批量生产的微流控装置示意图。
7微图片，其CV值均小于1.5%，表明粒径很均一；图(d)是聚乳酸液滴在容器中固化过程， 图(e_f)为固化聚乳酸微球。流速条件(a) Q1 = 0. 15mL/h ;Q2 = Q3 = 0. 35mL/h ； (WQ1 =0. 20mL/h ；Q2 = Q3 = 0. 15mL/h ； (C)Q1 = 0. 25mL/h ；Q2 = Q3 = 0. 45mL/h ； (d) - (f) Q1 = 0. lOmL/h, Q2 = Q3 = 0. 15mL/h。实施例2、制备包裹紫杉醇的聚乳酸微球将微流控芯片装置如图1所示装配好。配制30mg/mL的聚乳酸(分子量10000)的 氯仿溶液，另称取一定量的紫杉醇溶于上述溶液中，分别制备成含紫杉醇lmg/mL和ang/mL 的溶液作为分散相；配制质量浓度2%的PVA溶液作为连续相。将分散相和连续相通过微量 泵输送到微流控芯片，形成单分散的液滴；将收集的液滴置于40°C水浴中，除去有机溶剂； 将固化好的载药微球过滤，水洗，室温真空干燥或冻干。附图6(a_b)是制备的不同粒径的载药聚乳酸微球的光学显微照片，流速条件 (a)Q1 = 0. 15mL/h, Q2 = Q3 = 0. 35mL/h ； (WQ1 = 0. 20mL/h, Q2 = Q3 = 0. 15mL/h ；图 6(c) 是尺寸分布。取100个微球来进行尺寸的测量，取平均值，两种微球粒径分别为31和50微 米左右，CV值均小于4. 0%，表明粒径很均一。取干燥后的微球Img溶于ImL氯仿中，超声2分钟，加入2mL乙腈/水(1 l,v/v), 涡旋2分钟后进行15分钟静置，相分离后通入氮气除去氯仿；随后加入乙腈/水(1 1， ν/ν)使总体积保持2mL不变；超声5分钟后4000rpm离心10分钟，上清液用高效液相色谱 分析。色谱条件25厘米长的Cw色谱柱，流动相乙腈/水(1 1，ν/ν)，流速ImL/分钟， 检测波长227nm，进样体积20微升。测得的包埋率均高于93%。图7为四种不同粒径尺寸和理论载药量的微球的体外药物释放图，由图可见，紫 杉醇从聚乳酸微球中释放行为分为两步首先是前三小时较快的突释阶段，随后是一个逐 渐和持续的释放过程。且随着微球尺寸和理论载药量的增加，突释现象轻微增大。实施例3、制备包裹吡柔比星的聚乳酸微乳如实施例1，无固化步骤，只将分散相改为含吡柔比星的聚乳酸氯仿溶液，收集的 微乳光学显微照片见图8。实施例4、制备包裹吡柔比星的聚乳酸微球如实施例2，只将分散相改为含吡柔比星lmg/mL的聚乳酸氯仿溶液，收集的包裹 吡柔比星的聚乳酸微球光学显微照片见图9。不同尺寸吡柔比星-聚乳酸微球的体外释放 图见图10。由图可知，小尺寸微球在整个释放过程中均呈缓慢释放，且无明显的突释现象。 大尺寸微球表现出一定的突释现象，而后期同样表现为缓慢释放。实施例5如实施例1，只将分散相改为PLGA(聚(乳酸-羟基乙酸))的氯仿溶液，液滴和微 球的光学显微照片见图11。实施例6、制备亲水性药物壳聚糖微球配制含lmg/mL亲水性药物5_氟尿嘧啶的质量浓度为2%的壳聚糖醋酸水溶液作 为分散相，含有质量浓度5% SpanSO的矿物油(或大豆油)作为连续相，在一定的流速下 产生单分散性液滴，将液滴接入盛有质量浓度为10%多聚磷酸钠(含少量异丙醇)的容器 中，固化2小时后，过滤，二次水洗涤，冻干或低温晾干。微球的平均粒径为44微米，光学显 微照片如图12所示，粒径均一。
实施例7、制备藻酸钙微球如实施例6，分散相改为质量浓度为2%海藻酸钠水溶液，固化剂使用10%的氯化 钙溶液，固化1小时后，轻轻过滤，水洗，晾干。液滴和微球的光学显微照片见图13。实施例8批量生产设计采用图14的设计可批量生产各种微球。


本发明公开了一种基于微流控技术制备单分散性微乳、脂质体和微球的方法。该方法包括以下步骤将亲水性药物(或脂溶性药物)的水溶液(或油溶液)作为分散相，油相(或水相)作为连续相，将分散相和连续相分别输送到微流控芯片装置的相应微通道，剪切为单分散性包裹药物的液滴，然后采用一定的固化方法使液滴固化，得到尺寸均一、分散稳定的载药脂质体微球或生物可降解微球。在优化条件下，微乳和微球的直径分布系数可小于5％，直径在10-500微米。该技术解决了传统超声、搅拌乳化法、薄膜水化分散法制备的载药微乳、脂质体、微球尺寸不均一、包埋率低、分散性差、靶向性差、生物利用度低以及酶与细胞生物活性低，产生免疫抑制等问题。