专利名称：用于恢复面部或身体所选区域中年龄相关组织损失的方法和组合物的制作方法用于恢复面部或身体所选区域中年龄相关组织损失的方法和组合物 发明领域 本发明涉及恢复面部或身体所选区域中年龄相关组织损失的方法。更具体而言，这种方法注射自体干细胞，所述自体干细胞恢复面部或身体所选区域中的年龄相关组织损失。相关申请 本申请要求2009年5月4日提交的第61/175，275号美国临时申请的优先权权益，其在此通过引用全部而并入。 皮肤由表皮和真皮组成。皮下组织位于这些层下面，其通常未被归类为皮肤的层。皮下组织也通常被称为皮下脂肪层或者皮下组织。最外的表皮由带有下面基底膜的复层扁平上皮组成。其不包括血管，并且通过扩散从真皮获得营养。构成表皮的主要细胞类型是角质形成细胞。也存在黑素细胞和朗格汉斯细胞。该层皮肤负责将水保持在身体中并且阻止有害的化学品和病原体进入。真皮位于表皮下，并且包括许多结构，包括血管、神经、毛囊、平滑肌、腺体和淋巴组织。真皮(或者真皮层)通常是3-5毫米厚，并且是人体皮肤的主要组分。其由结缔组织的网络、主要是提供支持的胶原纤维和提供弹性的弹性组织组成。主要细胞类型是成纤维细胞、脂肪细胞和巨噬细胞。皮下组织位于真皮下面。它的目的是将皮肤附着在下面的骨骼和肌肉上以及向其供应血管和神经。其由疏松结缔组织和弹性蛋白组成。主要细胞类型是成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞。皮下组织包括50%的身体脂肪。脂肪对身体起衬垫和隔离作用。面部老化由于几个因素而发生皮肤内的固有变化，重力的影响，作用于皮肤的面部肌肉(动态纹)，软组织损失或移位以及骨损失和组织弹性的损失。当表皮开始变薄、引起与真皮的连接破坏(flatten)时,皮肤老化。胶原蛋白随着人变老而减少并且使皮肤饱满的胶原蛋白束变得更松散和失去强度。当皮肤失去弹性时，其抵抗拉伸的能力下降。加上重力、肌肉牵拉和组织变化，皮肤开始起皱。水损失和细胞之间的连接破坏也降低皮肤的屏障作用，其可以弓I起皮肤的毛孔大小增加。当人变老时，面部失去容量、软组织和脂肪。下颌垂肉和褶皱的出现通常由面部组织的下垂和下面肌肉附着于皮肤的区域的折皱引起。随着软组织的部分减少，面部变得更加凹陷。更具体地说，在各种面部区域，例如前额、眼部、鼻子、面中部和下面部中，与老化相关的变化已得到充分证明。在前额区，前额和眉随着时间的过去下垂，这使眉毛降低，并且引起上眼睑皮肤起皱。当一个人试图保持眉和眼睑向上来抵抗这些变化时，前额纹出现。众所周知眼部经常是显示老化迹象的第一面部特征。与面部其它区域相比，眼部周围的皮肤变化更早发生，这是因为眼部周围的皮肤更薄。这里的皮肤包括更少的腺体，并且经受不断的眨眼、斜视、摩擦以及牵拉。当面颊开始下垂、引起鼻唇沟褶皱时，面中部老化。鼻唇沟褶皱是从鼻侧延伸至嘴角的纹。已经用面部填充剂处理这些褶皱。在鼻子区域，随着人老化，鼻子拉长。拉长的通常原因是软组织的变薄和弹性的丢失，这引起"鼻尖的下垂"以及骨骼的暴露，产生新的隆起。在下面部区域，随着面部老化，面部组织下降。这导致所谓的〃笑纹〃。已经用面部填充剂处理该区域中的褶皱和纹。在面部的更下方，嘴角可能下垂以及下颌的下降可产生经常被称为"牵线木偶"纹的褶皱。而且，当面颊沿着面部肌肉附着于颌骨之处的下颌的固定点周围凹陷时，下颌垂肉形成。面部肌肉继续向下至颈中，作为称为颈阔肌的片。这一肌肉通常在颈中心分开，产生两个带。各种注射剂已用于恢复面部中的组织损失。自20世纪80年代，注射胶原蛋白已被用作软组织填充剂，以填充面部上的皱纹、纹(line)和疤痕。胶原蛋白是天然存在的蛋白质，其支持身体的各个部位，包括皮肤、肌腱和韧带。脂肪注射已使用多年，以增加容量，填补皱纹、纹，以及增强嘴唇。脂肪注射涉及从患者身体的一部分(腹部、大腿或臀部)获取脂肪并将其重新注射到面部皮肤下。肉毒杆菌毒素已被用于颈部痉挛、颅神经障碍和眼部痉挛。随着近期FDA批准Botox在眉间区域中的美容应用，该药物被用于抚平皱纹。当注射面部肌肉时肉毒杆菌毒素阻断神经冲动，暂时麻痹肌肉并抚平皱纹。透明质酸是最常用的美容真皮填充剂之一，它增加容量，以最小化皱纹和纹。透明质酸是线性多糖，其天然存在于所有活生物中并且是身体组织细胞外空间的通用组分。所有物种和组织中透明质酸的相同结构使这一多糖成为在健康和药物中用作生物材料的理想物质。透明质酸存在于人体中的许多部位。它为皮肤提供容量，为眼部提供形状并且为关节提供弹性。最高浓度发现于结缔组织中，并且大部分透明质酸(约56%)发现于皮肤中。各种形式的透明质酸由许多制造商商业化地提供。最常用的透明质酸是澄清凝胶形式的非动物稳定化透明质酸(NASHA)，由链球菌属(streptococci)细菌的细菌发酵产生。与动物衍生透明质酸不同，非动物衍生透明质酸不含动物蛋白。这限制了基于动物的疾病传播或对动物蛋白产生过敏反应的风险。最知名的非动物稳定化透明质酸是由Q-med，Seminariegatan, Uppsala制造的，并且可以以商品名Restylane 得到。从其1996年商业化开始，据估计全球已经进行了超过250万次处理。其他非动物稳定化透明质酸产品包括来自Q-med的Per lane ,其与Restylane 相比具有较大的颗粒，以及来自Genzyme公司的Captique 0另一个常用的填充剂是Genzyme公司生产的乙酰透明质酸,并且可以以商品名Hylaform Plus得到。Hylaform Plus是由乙酰透明质酸交联分子组成的无菌、无热源、粘弹性、澄清、无色、透明的凝胶植入物。尽管透明质酸及其衍生物是最常用的真皮填充剂，但它们的活力有限。需要每4-12个月或甚至更短的时间重新注射。据报道，皮肤可以注射生长因子以通过增加真皮中的脂肪量来恢复皮肤的外观。用特定的生长因子刺激前体脂肪细胞(preadipocyte)诱导未定向细胞加速分化为脂肪细胞，导致在注射部位脂肪的局部增加。这些生长因子包括胰岛素、胰岛素样生长因子、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)和视黄酸。如由此通过引用全部并入的美国专利7，414，021所教导的，注射组合物可以包括 透明质酸作为载体和至少一种生长因子，所述生长因子充当细胞间的信号分子并促进细胞的分化和成熟。这种生长因子的作用类似于激素。用作注射组合物一部分的合适激素是甲状腺激素和雌激素。美国专利7，414，021陈述，许多不同的生长因子可用于刺激前体脂肪细胞并诱导其在注射部位向成熟脂肪细胞的加速分化；然而，特定的生长因子如雌激素在注射到真皮后刺激弹性蛋白和胶原蛋白产生。在真皮层和下面的皮下组织层中实现的效果的结合导致处理部位处年龄相关组织损失的恢复虽然在过去的50年中，各种注射剂已被开发并在临床用于恢复面部中的年龄相关组织损失，但由于材料或与组织的相容性中的各种限制，恢复组织损失中的长期效果有限。期望开发改进的注射剂和处理方法，以提高在恢复面部或身体所选区域如颈部和手部中年龄相关组织损失中的整体效果。本发明提供了改进的注射剂和递送它们的方法。改进的注射剂包括自体干细胞，尽管也可使用来自该个体以外的来源的干细胞。递送干细胞的新方法包括微磨疗法(microabrasion therapy)的应用。干细胞和干细胞衍生物的应用已经在医学研究中引起增加的兴趣，特别是在提供用于处理组织损伤的试剂领域，所述损伤无论是遗传缺陷、损伤和/或疾病过程引起的。理想地，能够分化成受影响细胞类型的细胞可以被移植到需要其的受试者中，在该受试者中它们将与器官微环境相互作用并供应所需的细胞类型来修复损伤。申请人首次认识到，这种干细胞可用于恢复面部和身体所选其它区域中的年龄相关组织损失。申请人:还认识到创造环境使注射干细胞保持和旺盛生长的需要。因此，申请人在注射干细胞前在皮肤上进行微磨皮(microdermabrasion)。通过这些描述，包括上述相关技术的描述，在此描述的任何和所有可公开获取的文件，包括任何和所有的美国专利，特别地在此通过引用全部并入。上述相关技术的描述并非意图以任何方式认可，本文任何描述的文件、包括未决的美国专利申请是本公开的现有技术。此外，本文中与所述产品、方法和/或装置相关的任何缺点的描述并非意图限制公开的实施方案。事实上，本公开的实施方案可包括所述产品、方法和/或装置的某些特征，而不遭受其所述缺点。发明概述 本发明涉及恢复人面部或身体所选区域中年龄相关组织损失的处理方法。在一个实施方案中，该处理方法包括下列步骤提供包含干细胞和载体的组合物，并且将组合物注射到人面部的一个或多个区域或者人身体所选区域的真皮或者皮下组织中，以刺激胶原蛋白、弹性蛋白或者脂肪细胞产生，由此恢复人面部或身体所选区域中的年龄相关组织损失。在本发明的另一个实施方案中，处理方法还包括最初重复处理时期(treatmentsession)大约两次,两个时期之间的时间间隔为大约一周。在本发明的又一个实施方案中，处理方法还包括每两个月重复处理时期一次，进行一年。在本发明的另一个实施方案中，组合物可以包括透明质酸作为载体。另外，处理方法也可以与和特定生长因子组合的透明质酸注射相结合。透明质酸随着时间在真皮或者皮下组织中吸收，由此提供组合物中生长因子向真皮或者皮下组织中的延时释放(timerelease)。可以用于本发明方法的生长因子包括胰岛素、胰岛素样生长因子、甲状腺激素、成纤维细胞生长因子、雌激素、视黄酸或者其组合。在本发明的另一个实施方案中，注射组合物可以包括脂肪细胞。脂肪细胞可以通过充当衬垫行使它们在整容中的传统作用；然而，脂肪细胞还能够创造使得被注射的多能细胞自身定向成为脂肪细胞的环境。在另一个实施方案中，本发明涉及用于在引入干细胞前准备皮肤的方法，这允许干细胞在注入皮肤之后保持和旺盛生长。通过进行微磨皮促进细胞修复来处理皮肤，这创造使得被注射干细胞茁壮成长的环境。根据一些实施方案，提供包括干细胞以及作为载体的透明质酸的组合物，其中所述干细胞是外周血干细胞、骨髓衍生干细胞或者间充质干细胞。优选地，干细胞是自体干细胞。根据一些实施方案，提供用于恢复人面部或身体所选区域中组织容量的处理方法，包括向人受试者施用包括干细胞和作为载体的透明质酸的组合物，其中所述干细胞是外周血干细胞、骨髓衍生干细胞或者间充质干细胞，并且其中所述组合物通过注射到面部的一个或多个区域的真皮或者皮下组织中施用，由此恢复所述人身体的所述所选区域的组织容量。优选地，干细胞是自体干细胞。在一些实施方案中，组合物还包括脂肪细胞或者前体脂肪细胞。在一些实施方案中，组合物还包括胰岛素、胰岛素生长因子、甲状腺激素、成纤维细胞生长因子、雌激素、视黄酸或者其组合。甲状腺激素可以是三碘甲状腺氨酸钠、左旋甲状腺素钠或者其组合。在一些实施方案中，面部的一个或多个区域是眶周区域、唇、颧骨区域、鼻唇褶、唇-下颌褶、颈部或者手。在一些实施方案中，本公开的干细胞组合物还包括视黄酸。在一些实施方案中，本公开的干细胞组合物还包括氘减少的水。
为了更好地理解本发明，参考下列描述并结合附图，其中相同的参考字符自始至终指相同的部分。图I显示人间充质干细胞向前体脂肪细胞或者脂肪细胞的体外分化。发明详述
为了促进对本发明原理的理解，现在将参考图中示例说明的实施方案，并且将使用特定语言对其进行描述。但应该理解，不意图由此限制本发明的范围，在示例说明设备中的这种变化和进一步的修改、以及如本文示例说明的本发明原理的这种进一步应用对于本发明相关领域技术人员来说将被视为是通常可想到的。注射组合物
一方面，本发明提供包括干细胞(例如，多能干细胞)的注射组合物，用于注射到真皮或者皮下组织(皮下组织)中以恢复面部和身体所选区域如颈部和手中的年龄相关组织损失。根据一些实施方案，干细胞是自体干细胞。根据一些实施方案，干细胞是自体外周血干细胞。根据一些实施方案，干细胞是自体间充质干细胞(MSCs)。根据一些实施方案，干细胞是自体极小胚胎样(VSEL)干细胞。本发明的干细胞可以使用任何可用的载体(例如，药学可接受的载体)配制成可注射的皮下制剂。盐水是合适的载体，如同任何无菌生理缓冲剂一样。干细胞
包括多能干细胞的根据本发明的干细胞通过本领域众所周知的方法分离。任何未定向的多能或全能细胞可用作本发明的一部分，包括来自胚胎和成体来源的干细胞。来自许多不同组织的干细胞已 经被分离用于再生医学中。例如，在此通过引用全部并入的授予Tsukamoto等人的美国专利第5，750，397号公开了人造血干细胞的分离和生长,所述造血干细胞被报告能够分化为淋巴、红细胞和骨髓单核细胞谱系。在此通过引用全部并入的授予Bruder等人的美国专利第5，736，396号公开了在合适的生长和/或分化因子的影响下分离的人间充质干细胞的谱系定向分化方法。然后衍生细胞可以被引入宿主中用于间充质组织再生或修复。本发明考虑多种干细胞的应用。例如，间充质干细胞(MSCs)是一种这样的细胞类型。MSCs已显示具有分化为几个谱系的潜能，包括骨(Haynesworth等(1992) 13Bone 81_88)、软骨((Mackay 等(I"8) 4 Tissue Eng 41 5_28 ;Yoo 等(I"8) 80 JBone Joint Surg Am 745-57)、脂肪组织(Pittenger 等(2000) 251 Curr Top MicrobiolImmunol-11)、腱(Young 等(1998) 16 J Orthop Res 406-13)、肌肉以及间质(Caplan 等(2001) 7 Trends Mol Med 259-64)。也可应用 Ratajczak (WO 2007/067280)鉴定的极小胚胎样(VSEL)干细胞，其在此通过引用全部并入。提供同质人间充质干细胞组合物，其作为用于所有间充质细胞谱系的祖先。通过用独特单克隆抗体识别的特异性细胞表面标记鉴定MSCs。同质MSC组合物通过粘附骨髓或者骨膜细胞的阳性筛选而获得，它们没有与造血细胞或者分化的间充质细胞相关的标记。这些分离的间充质细胞细胞群显示仅与间充质干细胞相关的表位特性、具有在培养中再生而不分化的能力、并且具有在体外诱导或置于体内损伤组织位点时分化为特定间充质谱系的能力。为了获得受试者人间充质干细胞，从骨髓中的其他细胞或其他MSC来源中分离稀有的多能间充质干细胞是必要的。骨髓细胞可以从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或者其他骨髓腔获得。人间充质干细胞的其他来源包括胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青年皮肤以及血液。它们的分离方法包括下列步骤提供包括间充质干细胞的组织样品；将来自组织样品的细胞加入培养基，所述培养基包含刺激间充质干细胞生长而不分化的因子，并且允许培养时仅间充质干细胞选择性地粘附到基底表面；培养样品-培养基混合物；和从基底表面除去未粘附物质。另一方面，本发明涉及用于从组织样品中分离人间充质干细胞的培养基，其中培养基包括刺激间充质干细胞生长而不分化的因子，并且允许培养时仅间充质干细胞选择性地粘附到基底表面。在另一个方面，本发明涉及用于培养-扩增分离的和/或纯化的间充质干细胞的方法，例如骨髓、血液、骨膜或者真皮衍生的间充质干细胞。该方法包括下列步骤提供包括间充质干细胞的组织样品；将来自组织样品的细胞加入培养基，所述培养基包含刺激间充质干细胞生长而不分化的因子，并且允许培养时仅间充质干细胞选择性地粘附到基底表面；培养组织样品-培养基混合物；通过用相同组成的新鲜培养基替换培养基从基底表面除去未粘附物质；和允许分离的粘附间充质干细胞培养扩增。已经发现，在特定条件下、在培养扩增期间，培养扩增的间充质干细胞的分化和/或修复潜能得以保持。用于获得人间充质干细胞的方法在美国专利第5，486，359号中描述，其在此通过引用全部并入。另一细胞群，多潜能成体祖细胞(MAPCs)，也已从骨髓中纯化(BM; Reyes等(2001) 98 Blood 25261 5-2625 ；Reyes &Vetfaillie (2001) 938 Ann NY Acad Sci 231-235)。已经显示，这些细胞能够在体外扩增超过100群体倍增数而没有端粒变短或者核型异常的产生。还已显示，MAPCs能够在确定培养条件下分化为30种的各种间充质细胞(例如，成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和骨骼肌肌细胞)、内皮、神经外胚层细胞，以及更近期地分化为肝细胞(Schwartz 等(2000) 109 J Clin Invest 1291-1302)。另外，造血干细胞(HSCs)已报告能够分化为许多细胞类型。BM造血干细胞已报告能“转分化”为表达早期心脏(Orlic 等(2003) 7 Pediatr Transplant 86-88; Makino等(1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & Blau (2002) 111 Cell589-601; Corti 等(2002) 277 Exp Cell Res 74-85)、神经(Sanchez-Ramos (2002) 69Neurosci Res 880-893)、肝脏(Petersen 等(I 999) 284 Science I 168-1 170)或胰腺细胞(Lanus 等(2003) 111 J Clin Invest 843-850; Lee & Stoffel (2003) 111 JClin Invest 799-801)标记的细胞。人中的体内实验也证明⑶34 +外周血(PB)干细胞的移植导致供体衍生的肝细胞(Korbling等(2002) 346 N Engl J Med 738-746)、上皮细胞(Korbling 等(2002) 346 N Engl J Med 738-746)以及神经元(Hao 等(2003) 12 JHematother Stem Cell Res 23-32)的出现。另外，人BM衍生细胞已显示有助于梗塞心肌白勺再生(Stamm 等,(2003) 361 Lancet 45-46)。干细胞富集或分选
可以根据与干细胞有关的细胞表面标记对干细胞进行分选。因为对干细胞进行富集是本发明的一个实施方案，用于细胞分选的有用标记无需唯一地在干细胞中表达。但不是唯一地在干细胞中表达的细胞标记在干细胞的富集中会具有效用。还应该注意到，分化细胞的标记也用于本发明的方法，因为这些标记可以用于例如选择性地移除分化细胞，并且因而在其余细胞群中富集干细胞。可用于本发明的任何过程的细胞表面或者其它处的标记包括至少下列，


本发明涉及用于恢复面部和身体其他所选区域中年龄相关组织损失的干细胞组合物和方法。在第一实施方案中，组合物包括干细胞和作为载体的透明质酸，其中干细胞是外周血干细胞、骨髓衍生血液干细胞或者间充质干细胞。