专利名称：一种用于逆转肿瘤多药耐药性的原位磁热温敏靶向纳米药物载体的制作方法化疗是目前肿瘤治疗中最常见的手段，但是由于癌症的发病机制非常复杂，许多 肿瘤常规化疗效果差，其中肿瘤多药耐药性(MDR)的形成则是肿瘤化疗失败的关键因素。 经一段时间的化疗后.残存的肿瘤细胞对某些化疗药物的敏感性降低从而形成耐受性，同 时又对其它多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药，进而导致化疗的失败。因 此如何逆转肿瘤多药耐药性(MDR)已成为当今医学界研究的热点。当前逆转肿瘤多药耐药性的方法主要是通过两种途径其一是提高肿瘤细胞内化 疗药物的有效浓度。该方法主要通过药物控释载体的肿瘤部位靶向释放和降低耐药性肿瘤 细胞对化疗药物的外排作用实现。另一种方法是提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。为实 现该目标，一般采用结合疗法，将不同的癌症治疗方法同时应用于同一肿瘤部位，而化疗和 热疗的结合是其中比较经典的途径。热疗作为一种独立的肿瘤治疗方法，是指对全身或者局部甚至肿瘤部位进行加 热。热疗产生的高温首先可改变生物膜通透性，直接影响到钠、钾、钙离子和三磷酸腺苷等 多种蛋白质或其他物质的进出，导致细胞膜的破坏。同时，高温还能造成DNA损伤的增加及 DNA损伤修复的抑制。虽然高温不会直接引起DNA链的破坏，但可以改变染色质的结构并 抑制其合成，从而影响DNA的修复。此外，高温还会导致细胞骨架散乱，细胞内蛋白质聚集， 细胞多项生理活动发生改变，最终导致细胞死亡。此外，由于肿瘤组织生长较快，且血管化不全，造成肿瘤细胞普遍处于慢性缺氧 的酸性环境中。而化疗药物在肿瘤部位的分布通常会进一步受到肿瘤部位的血供、血流 差异、电解质平衡、PH值改变所导致的药物溶解性和分布体积的影响。热疗所提供的温度 (40-44°C)可以增加肿瘤组织的血供和血管的渗透性，促进肿瘤组织化疗药物的集中。热疗作为一种通行的癌症治疗方法，在细胞形态、蛋白结构、基因表达几个层次上 都会对肿瘤细胞产生影响，目前一般认为热疗主要通过以下几种机制来实现对肿瘤多药耐 药性的逆转，从而促进化疗药物疗效的发挥① 热疗促进药物进入肿瘤细胞。肿瘤细胞的多药耐药性主要是由跨膜转运蛋白将 药物泵出细胞外造成的，而热疗会改变细胞膜的通透性，可以促进药物通过细胞膜进入细 胞。②热疗促进药物诱发的肿瘤细胞凋亡。很多化疗药物的靶向作用位点为肿瘤细 胞的DNA，或者各种DNA修复蛋白酶。相应的多药耐药性就产生于肿瘤细胞相关DNA修复能 力的加强。而热疗能有效降低DNA的修复能力，从而增加肿瘤细胞对相关抗癌药物的敏感 性。③热疗本身就具有诱导细胞凋亡的能力，可以与化疗协同作用，加速肿瘤细胞 的凋亡。由此可见，将化疗和热疗结合应用于肿瘤多药耐药性的逆转具有很好的应用 前景° 目前相关的石if 究结果证实，doxorubicin、mitoxantrone、cyclophosphamide、 ifosfamide、melphalan、BCNU和gemcitabine等抗肿瘤药物在热疗的作用下，其疗效有明 显的提高；而cisplatin、carboplatin、mitomycin C和bleomycin等药物则与热疗发生协 同作用，其疗效的提升明显大于化疗和热疗单独作用之和。目前临床上使用的热疗主要分为全身热疗和局部灌注热疗，另外还有相应的微波 热疗和红外光疗等方法。在临床中，单独传统的热化疗手段一般都是在静脉或者局部注射 化疗药物后，再做全身性的加热或者局部加热。化疗药物的施加和热疗手段的利用分属于 两套体系，二者间并没有建立有机的联系。而现行有关化疗药物温敏载体研究中，只关注温 敏载体本身的温敏效果，即能在相应的相转变温度下实现药物的突释。虽然与传统的热化 疗相比，热疗导致的局部升温，是在对应的局部诱发化疗药物释放的先决条件，但是药物载 体本身不具有自升温的能力。在临床应用上，实现局部加热的热疗系统与温敏控释系统在 实施手段上仍然各自独立，两者并没有统一起来，其内在联系需要进一步的加强。同时，与一般热化疗不同的是，肿瘤多药耐药性的逆转比单纯对化疗药物的热增 敏要求更高，一般要求化疗药物的热增敏效果达到最大，因此，适用于肿瘤多药耐药性逆 转的原位磁热温敏靶向纳米药物载体还必须满足下述几个条件首先是化疗和热疗作用 的同步性。研究发现，除了抗代谢类药物(比如胞苷)需要给药和加热之间相隔M小时才 能发挥其最大药效外，一般而言，在药物和热疗同时作用于肿瘤部位时才能实现疗效最大 化。其次，不同的药物，其最佳热增敏(thermal enhancement ratio，TER)温度不同。比如 Mleomycin 和 Cisplatin 在 43. 5°C 下比 41. 5 °C 的热增敏更高，而 Melphalan 在 41. 5°C 下 其热增敏已经达到最高值，这就要求热疗系统不仅能升温保证药物的释放和促进药物的疗 效，同时还要能将温度维持某个水平上。再次，热疗的作用时间对于化疗药物的热增敏也是 非常重要的。尽管对MleomyciruCisplatin和Melphalan，其协同热增敏的关键因素是热疗 温度，但是对Ifosfamide，其热增敏的关键因素是加热时间的长短，有研究表明加热90分 钟的热增敏效果是30分钟的两倍多。综上所述，本发明为解决肿瘤多药耐药性所构建的原位磁热温敏靶向纳米药物载 体，同时兼具了自升温和温敏控释药物的功能，可实现热疗与化疗的同步性。同时，由于其 内核具有磁热效应的超顺磁性纳米颗粒，可以通过改变其组分来调节其最高发热温度(居 里点)，从而可以将其居里点控制在化疗药物的最佳TER温度上。进一步地，载体的外层温 敏聚合物，可以调整其低临界溶解温度(LCST)，使其与化疗药物的最佳TER温度相匹配，保 证化疗药物在其最佳TER温度下释放，且同时实现化疗和热烈的同步性。而且，由于内核的 超顺磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下，能一直保持其温度维持在居里点上，其热疗作用 时间长短可控，有助于满足不同药物热增敏效果最大化的不要需求。
本发明的目的是提供一种用于逆转肿瘤多药耐药性的原位磁热温敏靶向纳米药 物载体，即通过设计的原位磁热温敏靶向纳米药物载体，可同时满足化疗和热疗的同步性、药物最佳热增敏温度的可调和热疗时间长短的可控，从而使得化疗药物的热增敏最大化， 提高已经产生耐药性的肿瘤细胞对药物的敏感性，最终逆转肿瘤的多药耐药性。为了实现上述目标，本发明提供的技术方案为一种用于逆转肿瘤多药耐药性的原位磁热温敏靶向纳米药物载体，所述的纳米载体 是采用两亲性温敏共聚物形成的一种核壳结构，其内核层由疏水性聚乳酸片段形成，外壳 层由亲水性温敏聚合物片段形成，疏水的超顺磁性纳米颗粒和抗肿瘤药物被包裹于内核层 中；所述纳米药物载体的粒径为5(T250 nm，所述的超顺磁性纳米颗粒的粒径为5 30 nm。 所得纳米药物载体可以实现在肿瘤部位原位加热且同时控制药物的释放，使得已经具有耐 药性的肿瘤细胞在热疗和化疗的双重作用下重新对化疗药物敏感，从而实现对肿瘤细胞多 药耐药性的逆转。本发明中，所述两亲性温敏共聚物，其疏水链段由可降解的聚乳酸组成，亲水性链 段由以N-异丙基丙烯酰胺为主体的温敏聚合物组成，且亲水性链段的分子量大于疏水性 链段的分子量。本发明中，所述的组成亲水性链段的以N-异丙基丙烯酰胺为主体的温敏聚合物， 其低临界溶解温度(LCST)控制在40°C 60°C之间，通过优化可调节聚合物的LCST与内载 化疗药物的最佳热增敏(TER)温度相匹配。本发明中，所述的超顺磁性纳米颗粒能够在外界交变磁场作用下发热且能控制其 最高升温温度(居里点)，保持在4o°c ^eo0C，通过优化可调节超顺磁性纳米颗粒的居里点与 化疗药物的TER温度相匹配。本发明中，所述的超顺磁性纳米颗粒的居里点、外壳层温敏聚合物的LCST和化疗 药物的最佳TER温度三者相匹配时，可以使其满足化疗和热疗的同步性，并实现对肿瘤细 胞多药耐药性的逆转。相对于现有的技术，本发明的优点在于1、克服了原有热化疗模式中，化疗药物和热疗无法同步作用于肿瘤组织的缺陷。2、相比于现有的温敏药物载体，本发明载体系统中引入的磁热分子，不仅可以用 于靶向显影肿瘤组织，还可以在肿瘤组织处原位升温控制温敏聚合物载体中药物的释放。3、相比于现有常见的热疗分子，本发明载体内核所采用的磁性纳米粒子可以通过 调节组分控制其居里点，将其最高升温温度与药物的最佳TER温度相匹配，有助于实现药 物热增敏的最大化。4、另外，通过控制内核层超顺磁性纳米颗粒的居里点和外壳层温敏聚合物的 LSCT,使之同时与药物的最佳TER温度相匹配，使得药物的化疗和热疗在其TER最佳温度下 同步性进行。5、而且，该纳米载体系统中所引入的超顺磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下，可 长期将升温温度维持在居里点上，从而现实了热疗作用时间长短可控，有助于满足不同药 物热增敏最大化的不要需求。正是由于该原位磁热温敏靶向纳米药物载体相比于现有的热化疗手段和温敏载 体系统，能实现化疗药物热敏增效的最大化。因此，该载体能够有效地提高耐药细胞对化疗 药物的敏感性，在逆转肿瘤多药耐药性方面具有很大的应用潜能，从而克服耐药性对化疗 的不利影响，保证化疗的效果。
称取50 mg聚乳酸与聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-二甲基丙烯酰胺)组成的共聚物、 100 mg粒径约25 nm的超顺磁性纳米颗粒、以及10 mg的抗肿瘤药物Melphalan，其中药物 Melphalan的最佳TER温度为41. 5°C，通过调节组成使得共聚物的LCST和磁性纳米粒子的 居里点均达到41. 5°C，加入60 mL四氢呋喃，室温下超声10 min，使聚合物、磁性纳米粒子 和药物充分分散和溶解，形成透明的有机相；将制得的有机相溶液置于透析袋中，然后在1 L的水中透析M小时，每3小时换透析液一次。透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束 水溶液，然后冷冻干燥20小时，得到粉末状固体。用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分 布，多分散性为0.038。TEM照片显示纳米颗粒的平均粒径为102 nm，粒子呈球形，分散比较 均勻。实施例2
称取400 mg聚乳酸与聚(N-异丙基丙烯酰胺-CO-N-羟乙基丙烯酰胺)组成的共聚物、 100 mg粒径约15 nm的超顺磁性纳米颗粒、以及30 mg的抗肿瘤药物顺钼，其中顺钼的最佳 TER温度为43°C，通过调节组成使得共聚物的LCST和磁性纳米粒子的居里点均达到43°C， 加入140 mL四氢呋喃，室温下超声10 min，使聚合物、磁性纳米粒子和药物充分分散和溶 解，形成透明的有机相；将制得的有机相溶液置于透析袋中，然后在1 L的去离子水中透析 24小时，每4小时换透析液一次。透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，然后 冷冻干燥48小时，得到粉末状固体。用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布，多分散性 为0.042。TEM照片显示纳米颗粒的平均粒径为124 nm，粒子呈球形，分散比较均勻。实施例3
称取200 mg聚乳酸与聚(N-异丙基丙烯酰胺-co- 二甲基丙烯酰胺)组成的共聚物、50 mg粒径约19 nm的超顺磁性纳米颗粒、以及50 mg的抗肿瘤药物阿霉素，其中顺钼的最佳 TER温度为43°C，通过调节组成使得共聚物的LCST和磁性纳米粒子的居里点均达到43°C， 加入100 mL四氢呋喃，室温下超声20 min，使聚合物、磁性纳米粒子和药物充分分散和溶 解，形成透明的有机相；将制得的有机相溶液置于透析袋中，然后在1 L的去离子水中透析 24小时，每4小时换透析液一次。透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，然后 冷冻干燥48小时，得到粉末状固体。用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布，多分散性 为0.032。TEM照片显示纳米颗粒的平均粒径为114 nm，粒子呈球形，分散比较均勻。实施例4 原位磁热温敏靶向纳米药物载体在体外对多种耐药肿瘤细胞株的增殖 抑制作用
选用顺钼作为化疗药物的模型，按照实施例2制备相关原位磁热温敏靶向纳米药物载 体。选用多种耐药细胞株CH0、RIF-I、EAT、SCC-25/CP、GLC4-cDDP作为体外的耐药逆转模 型。各细胞株的起始浓度为IX IO6个/mL，于96孔板内培养M小时后，按照药物以10μβ/ mL的浓度梯度加入各细胞组，在37°C下培养细胞1小时作为对照。实验组则采用原位磁热温敏靶向纳米药物载体，在磁场作用下，载体自生温到43 °C，且其具有保温能力，在43°C下 培养1小时。然后测得对照组和实验组的细胞凋亡情况，以对照组的凋亡率为作为基准，算 出实验组的细胞凋亡率与对照组相比的倍增率。(表格线条用黑色)


本发明涉及一种用于逆转肿瘤多药耐药性的原位磁热温敏靶向纳米药物载体，这种纳米药物载体可以实现在肿瘤部位原位加热且同时控制药物的释放，使得已经具有耐药性的肿瘤细胞在热疗和化疗的双重作用下重新对化疗药物敏感，从而实现对肿瘤细胞多药耐药性的逆转。所述纳米载体是采用两亲性温敏共聚物形成的一种核壳结构，内核层由疏水性聚乳酸片段形成，外壳层由亲水性温敏聚合物片段形成，疏水的超顺磁性纳米颗粒和药物被包裹于内核层中。本发明公开的这种逆转肿瘤多药耐药性，解决了现有热疗化疗联合逆转肿瘤多药耐药性时，化疗药物肿瘤组织分布低的缺陷，且同时满足了热化疗效果最大化的两个关键因素化疗和热疗的同步性以及热化疗最佳温度的可控性。本发明可以很好的应用于原发性和获得性的肿瘤多药耐药性。