抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统及其制备方法与应用的制作方法技术领域：】，公开了一种抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统的制备方法和应用，它以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，同时装载化疗药物和CD44单克隆抗体。本发明还首次公开了CD44单克隆抗体IM7对多药耐药乳腺癌细胞具有的抑制作用，进一步将CD44单克隆抗体IM7装载到纳米给药系统上可以加强对多药耐药乳腺癌细胞的抑制作用，同时装载化疗药物和CD44单克隆抗体IM7的纳米给药系统可以明显增加化疗药物在多药耐药乳腺癌组织内的滞留量，有效抑制多药耐药乳腺癌生长，显著提高对多药耐药乳腺癌的疗效。技术领域：】[0001]本发明涉及乳腺癌治疗领域，具体涉及一种能够抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统及其制备方法与应用。【背景技术：】[0002]乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康[1]。因此迫切需要乳腺癌治疗的有效方法。乳腺癌多药耐药是化疗失败的主要原因，并可导致复发与转移，成为肿瘤治疗的最大障碍。乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞的耐药机制复杂，涉及多种耐药相关蛋白，其中⑶44(clusterofdifferentiation44)分子是乳腺癌耐药的关键分子。⑶44,是一种由单基因编码的细胞表面黏附分子，CD44分子高表达于多种耐药的肿瘤细胞和肿瘤干细胞的细胞膜[2]，CD44分子不仅有助于多药耐药蛋白MDRl将化疗药物从细胞内泵出，减少药物在肿瘤细胞内的有效剂量[3];还有助于耐药肿瘤细胞的转移和扩散[4]，造成临床肿瘤患者的治疗无效和预后不良气目前在耐药肿瘤的治疗方面还没有应用CD44分子的单克隆抗体进行肿瘤治疗的研究。【
发明内容】[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统。[0004]本发明还要解决的技术问题是提供上述纳米给药系统的制备方法。[0005]本发明最后要解决的技术问题是提供上述纳米给药系统的应用。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:[0007]一种抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统，它以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，同时装载化疗药物和CD44单克隆抗体。[0008]其中，所述的介孔二氧化娃纳米粒子粒径为20_200nm,形貌为球形、椭圆形或圆柱形。[0009]其中，所述的介孔二氧化硅纳米粒子可以自己制备也可以直接从市场上购买，只要满足上述粒径和形貌要求即可。若自行制备，制备方法可以是以硅烷化试剂在催化剂的催化下相互缩聚形成的均匀连续、高度有序的介孔材料。调节不同的组成成分、添加试剂及其比例可得到不同尺寸、形貌的介孔二氧化硅纳米粒子，形貌为可以为球形，椭圆形，圆柱形等不拘，具有介孔孔道作为药物储纳空间。可参考文献[6]来制备。[0010]其中，所述的化疗药物为乳腺癌化疗药物。[0011]其中，所述的化疗药物为阿霉素、紫杉醇和顺钼中的任意一种或几种的组合。[0012]其中，所述的⑶44单克隆抗体为⑶44单抗頂7。[0013]上述抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统的制备方法，该方法包括如下步骤:[0014](I)制备或者购买单分散的介孔二氧化硅纳米粒子，粒子粒径为20_100nm，形貌为球形、椭圆形或圆柱形，；[0015](2)将步骤⑴得到的介孔二氧化硅纳米粒子表面进行氨基或羧基官能团修饰；[0016](3)将步骤(2)修饰后的介孔二氧化硅纳米粒子进行CD44单克隆抗体的装载，制备偶联CD44单抗的纳米给药系统；[0017](4)将步骤(3)得到的偶联CD44单抗的纳米给药系统装载化疗药物，制备得到抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统。[0018]步骤(1)中，所述的单分散的介孔二氧化硅纳米粒子可以自己制备也可以直接从市场上购买，只要满足上述单分散性、粒径和形貌要求即可。若自行制备，制备方法可以是以硅烷化试剂在催化剂的催化下相互缩聚形成的均匀连续、高度有序的介孔材料。调节不同的组成成分、添加试剂及其比例可得到不同尺寸、形貌的介孔二氧化硅纳米粒子，形貌为可以为球形，椭圆形，圆柱形等不拘，具有介孔孔道作为药物储纳空间。可参考文献Μ来制备。[0019]步骤(2)中，采用3-氨丙基三乙氧基硅烷对介孔二氧化硅纳米粒子表面进行氨基修饰；或者采用戊二酸酐对介孔二氧化硅纳米粒子表面进行羧基修饰。[0020]步骤(3)中，利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化体系将CD44单抗頂7上的羧基活化，然后与氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子通过缩合反应进行抗体頂7的连接；或者利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化体系将羧基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子活化，然后与CD44单抗頂7上的氨基通过缩合反应进行抗体頂7的连接。[0021]步骤(4)中，利用偶联CD44单抗的纳米给药系统和化疗药物(如阿霉素)之间存在的静电作用和氢键键合作用进行载药。[0022]上述抑制多药耐药乳腺癌生长的纳米给药系统在制备抑制多药耐药乳腺癌细胞生长药物中的应用。[0023]在逆转肿瘤细胞多药耐药的研究中，发现纳米载药系统应用于肿瘤治疗，可增加化疗药物在肿瘤内的浓度，克服肿瘤耐药。其作用机制可能是纳米载药系统改变了药物原来进入肿瘤细胞的途径，从而避免了多药耐药相关的蛋白的识别、结合及外排，使药物在细胞内的蓄积增加m。我们制备的偶联CD44单克隆抗体IM7携载化疗药物的纳米给药系统，利用了受体(CD44)和配体(IM7)结合具有特异性好、亲合力强的优点，纳米给药系统与耐药乳腺癌细胞结合，可以将药物准确递送至耐药乳腺癌细胞，达到加强耐药乳腺癌细胞对化疗药物的摄取，减少对正常组织的毒副作用的目的。更重要的是，以纳米粒子作为给药平台，一方面加强了CD44抗体的封闭作用；另一方面增强化疗药物对耐药乳腺癌细胞的杀伤效果。本发明的纳米给药系统多重作用于耐药乳腺癌细胞，提高了治疗的靶向性和敏感性，降低了毒性化疗药物的用量，显著增强了治疗耐药乳腺癌的疗效。[0024]参考文献:[0025][I]SiegelR,MaJ,ZouZ,JemalA.Cancerstatistics,2014.CACancerJClin.2014.64(1):9-29.[0026][2]CainJW,HauptscheinRS,StewartJK,BagciT,SahagianGG,JayDG.1dentificationofCD44asasurfacebiomarkerfordrugresistancebysurfaceproteomesignaturetechnology.MolCancerRes.2011.9(5):637-47.[0027][3]BourguignonLY，PeyrollierKjXiaWjGiladE.Hyaluronan-CD44interactionactivatesstemcellmarkerNanog，Stat-3—mediatedMDRlgeneexpression,andankyrin-regulatedmultidrugeffluxinbreastandovariantumorcells.JBiolChem.2008.283(25):17635-51.[0028][4]BourguignonLY，SpevakCCjWongGjXiaWjGiladE.Hyaluronan-CD44interactionwithproteinkinaseC(epsilon)promotesoncogenicsignalingbythestemcellmarkerNanogandtheProductionofmicroRNA—21，leadingtodown-regulationofthetumorsuppressorproteinPDCD4，anti—apoptosis，andchemotherapyresistanceinbreasttumorcells.JBiolChem.2009.284(39):26533-46.[0029][5]ChengY，TaoL，XuJ，etal.CD44/cellularprionproteininteractinmultidrugresistantbreastcancercellsandcorrelatewithresponsestoneoadjuvantchemotherapyinbreastcancerpatients.LID-10.1002/mc.22021[doi].MolCarcinog.2013.。[0030][6]M.YujL.Zhou,J.Zhang,P.Yuan,P.Thorn,W.GujandC.Yu，Asimpleapproachtopreparemonodispersemesoporoussilicananosphereswithadjustablesizes.J.ColloidInterfaceSc1.376，67—75(2012).[0031][7]WangX，TengZG，HuangXYjLuGM.Mesoporoussilicananoparticlesforcancertheranosticdrugdelivery.YaoXueXueBa0.2013.48(I):8-13.[0032]图1用于给药的介孔二氧化硅纳米粒子的电镜照片。[0033]图2介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)、氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-NH2)和装载单抗頂7的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN-1M7)的傅里叶红外光谱谱图。[0034]图3比较偶联⑶44单抗的纳米给药系统(MSN-M7)和⑶44单抗頂7对耐药乳腺癌细胞的生长抑制作用。A图表明耐药乳腺癌细胞株MCF-7/MDR1具有比亲本乳腺癌细胞株MCF-7更高的耐药性。B图表明制备的纳米粒子具有良好的生物相容性，对耐药乳腺癌细胞的毒性微弱，起到载药平台的作用。C图比较单纯的⑶44单抗頂7和偶联了⑶44单抗頂7的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN-M7)的细胞生长抑制作用。[0035]图4比较对照组(Control)、阿霉素组(DOX)、仅装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN)和偶联頂7并装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN-M7)在治疗裸鼠耐药移植瘤后，四组肿瘤切片的荧光强度比较。[0036]图5比较对照组(Control)、阿霉素组(DOX)、仅装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN)和偶联IM7并装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN-M7)组在治疗裸鼠耐药移植瘤后，四组移植瘤切片的凋亡细胞的比较。[0037]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。[0038]实施例1:载药纳米粒子的制备。[0039]采用十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)为表面活性剂，利用模板法在乙醋酸钠和水的混合相中制备介孔二氧化硅纳米粒子。具体为首先将6.24g十六烷基三甲基氯化铵溶入0.3gNaAc.3H20和53.4g水的混合液中，在60°C下搅拌2h，逐滴加入4.35mL的正硅酸乙醋。继续在60°C下400RPM搅拌24h。然后在20，000RPM离心10min去除上清，清洗3遍后，650°C下煅烧样品5h。得到的介孔二氧化硅纳米粒子形态规则，粒径约60nm。[0040]纳米材料制备完成后利用透射电子显微镜对制备的二氧化硅纳米颗粒进行表征:将颗粒悬浮在适量的水中，于超声波中超声Imin将颗粒充分分散，然后将其滴于福尔马膜铜网上，自然干燥后用透射电子显微镜进行拍照，结果见图1，图中的介孔二氧化硅纳米粒子大小均一，尺寸约60nm，分散性良好，表面具有介孔结构。[0041]实施例2:构建装载⑶44单抗頂7的纳米给药系统。[0042]I)首先采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对介孔二氧化硅纳米粒子表面进行氨基修饰，利用傅里叶红外光谱分析对其进行表征，检测纳米粒子上是否连接有的氨基集团。具体操作为:在100mL无水乙醇反应体系中，超声波中超声2-5min将颗粒充分分散，加入l-2mlAPTES室温400RPM搅拌24h后，以13000rpm速度离心5min，真空干燥备用。傅里叶红外光谱谱图见附图2的MSN-MH2具有-NH2基团(峰3463.6nm处)。[0043]2)在此基础上，利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化体系将CD44单抗頂7上的羧基活化，然后与氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子通过缩合反应进行抗体頂7的连接，再利用傅里叶红外光谱分析对其进行表征，检测纳米粒子上是否偶联上CD44单抗頂7。具体操作为:取0.1-1mgEDC,0.3_3mgNHS,在Iml的0.1M2-吗啉乙磺酸MES溶液中搅拌溶解，将20-50μg人源⑶44抗体頂7加入，室温磁力搅拌搅拌15min活化抗体的羧基；再将在IOml磷酸盐缓冲液反应体系中加入活化的抗体和5-10mg介孔二氧化娃纳米粒子,室温磁力搅拌2h后终止反应，以13000rpm速度离心5min弃上清；最后,加入阿霉素l_2mg在磷酸盐缓冲液5_10ml反应体系中避光磁力搅拌24h,以13000rpm速度离心5min弃上清,磷酸盐缓冲液清洗。傅里叶红外光谱谱图见附图2的MSN-頂7上具有抗体的羰基基团(峰1377.2、1458nm处)和-CH(峰2959.8,2923.7nm处)，从而验证了偶联CD44单抗的纳米给药系统的构建是有效的[0044]3)介孔二氧化硅纳米粒子表面具有硅醇键，带负电荷；化疗药物阿霉素具有羟基、胺基、醌基，带正电荷，故可以利用介孔二氧化硅纳米主体材料和客体分子阿霉素之间存在的静电作用和氢键键合作用进行载药。载药过程避免高温或者强酸强碱等剧烈条件，确保已连接的抗体保持活性。采用紫外分光光度计检测载药后的溶液上清，计算载药量出8.9%,完成偶联CD44单抗IM7并共载化疗药物的纳米给药系统的构建。[0045]实施例3:比较MSN-頂7和頂7对耐药乳腺癌细胞的生长抑制作用。[0046]细胞毒性实验可以检测处理后耐药肿瘤细胞生存率的变化。首先对亲本乳腺癌细胞株和其耐药乳腺癌细胞株进行细胞毒性实验，验证受试细胞株MCF-7/MDR1为耐药乳腺癌胞株；然后对单纯纳米粒子进行细胞毒性实验，说明纳米粒子本身无毒，纳米给药系统的细胞毒作用是来自于给药系统中的药物释放；最后，比较MSN-M7和頂7对耐药乳腺癌细胞的生长抑制作用，说明以纳米粒子为载药平台，明显加强了CD44单抗頂7对耐药乳腺癌细胞的生长抑制作用。[0047]以磺基罗丹明B(SRB)法检测药物对人乳腺癌耐药细胞MCF-7或MCF-7/MDR1生长增殖的影响。取对数生长期肿瘤细胞，接种于96微孔培养板，细胞数为5XIO3/孔，在37°C、5%CO2，孵箱中培养12小时后，分组加药，每个浓度设立平行孔，阴性对照孔加生理盐水，48小时后，每孔加10%三氯乙酸4°C固定lh，再加SRB染色15min，醋酸洗涤5遍干燥，Tris溶解，在515nm下测每孔光密度(OD)值。结果如附图3:A图表明耐药乳腺癌细胞株MCF-7/MDRl具有比亲本乳腺癌细胞株MCF-7更高的耐药性。B图表明制备的纳米粒子MSN具有良好的生物相容性，即使在高浓度ΙΟΟΟμg/ml时，对耐药乳腺癌细胞基本无毒，是良好的载药平台。C图比较单纯頂7和偶联頂7的介孔二氧化硅纳米给药系统(MSN-M7)的细胞生长抑制作用，细胞毒性实验显示MSN-1M7加强了IM7对耐药乳腺癌细胞的抑制作用。当含IM7浓度为2μg/ml时的MSN-頂7可以使耐药乳腺癌细胞活力降至74.1%，而单纯的頂7浓度达到15μg/ml时，才能使耐药乳腺癌细胞活力降至71.7%。与空白对照比较，乍〈0.05。因此，抗体IM7具有对耐药乳腺癌细胞的生长抑制作用；而以纳米粒子为载药平台以装载上⑶44单抗頂7，可以进一步加强頂7的抑制作用。[0048]实施例4:比较对照组(Control)、阿霉素组(DOX)、仅装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN)和偶联IM7并装载阿霉素的纳米给药系统组(DMSN-M7)治疗裸鼠耐药移植瘤的效果。[0049]首先建立人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/MDR1的裸鼠移植瘤模型，然后随机分为对照组(Control)、阿霉素(DOX)给药组、装载阿霉素的介孔二氧化硅纳米给药系统(DMSN)给药组和靶向⑶44克服肿瘤耐药的介孔二氧化硅纳米给药系统(DMSN-M7)给药组。对照组给予生理盐水，其他三组分别瘤内注射阿霉素、含有等量阿霉素的DMSN或DMSN-頂7。采用荧光成像系统得到不同治疗条件下乳腺癌耐药移植瘤切片的荧光图像。通过ImageProExpress系统检测阿霉素的荧光强度，比较各组耐药肿瘤中阿霉素的含量。结果显示DMSN-M7给药组的肿瘤组织切片上的阿霉素量多且分布广泛，而DOX组的荧光多分布在肿瘤周围间质，DMSN组的荧光在肿瘤实质内有部分分布。实验说明由于纳米给药系统DMSN-1M7偶联了頂7，直接靶向高表达⑶44的耐药乳腺癌细胞，使阿霉素在耐药肿瘤组织中滞留量增大且分布广，见附图4，根据阿霉素具有自发荧光的特点，比较阿霉素的荧光强度，即比较阿霉素在耐药乳腺癌移植瘤组织中的滞留量。采用荧光成像系统得到四组不同治疗条件下乳腺癌耐药移植瘤切片的荧光图像。图中显示DMSN-M7组的荧光强度最强并且在移植瘤内分布最广泛，说明纳米给药系统DMSN-M7明显增加阿霉素在耐药移植瘤中的滞留量。[0050]以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL)检测四组耐药肿瘤组织中细胞凋亡情况，结果显示在400倍光镜下DMSN-M7给药组的肿瘤组织切片上凋亡的耐药肿瘤细胞最多，棕褐色胞核皱缩、浓染。这与DMSN-M7给药组的阿霉素在肿瘤内含量最多结果一致。实验说明由DMSN-M7诱导乳腺癌耐药细胞凋亡的作用最强，见附图5。[0051]以上所述为本发明的优化实施例而已，并不用以限制发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。王昕,朱飞鹏,卢光明,王守巨,周显光,王春艳,史东宏,吴江,刘莹,黄嘉逸,滕兆刚,唐玉霞申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院