专利名称：聚精氨酸纳米胶囊的制作方法活性成分的物理化学性能在能够进一步确定其疗效的这些分子的药物研发中是决定性特征。更具体地，很多活性成分在水中的低 溶解度使其配方变得复杂，通常需要使用赋形剂，而赋形剂在治疗中能够导致严重的副作用和并发症。另外，大亲水分子难以通过生物屏障，而且其降解的稳定性由于有机体的防御机制而受损。必须解决这些困难，从而活性分子到达治疗靶点并从而得到有效治疗。活性成分在纳米尺寸系统中的掺入有助于改进这些分子的配方局限，同时提高其治疗潜力。活性成分的溶解度改进、防护降解或更好的渗透是活性分子纳米胶囊封装的一些优势。此外已知的是，这些系统穿过外部屏障并获准进入有机体的能力取决于其大小和组成。相对于较大尺寸的颗粒，小颗粒会提高传输度直径小于I U m的纳米系统符合此标准。如果由天然、生物相容和生物可降解的聚合物制备它们，这就增加了纳米系统通过已知的传输机制天然地传输通过有机体黏膜而不改变上皮生理的可能性。卵磷脂是天然物质，其主要组分是磷脂酰胆碱(中性磷脂)，其次要组分是磷脂酰肌醇、磷脂酸(负电荷磷脂)、其他磷脂如磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱，以及其他组分如生育酚或甘油三酯。聚精氨酸(PArg)是亲水阳离子聚氨基酸，其由于胍基的强碱性在几乎全部pH范围中保持正电荷。这种均聚物包含于所谓的蛋白质转导域(PTD)家族中。PTD分子具有有效穿过生物细胞膜的能力并用于在其化学修饰后提高蛋白质和较大分子的细胞摄取。因此，实施的用于获得由作为免疫刺激剂的聚精氨酸聚氨基酸组成的肝炎C疫苗的临床研究显示通过T细胞增加了免疫应答,但未观察到通过聚合物的抗原性(Mattner等,Cancer Res.(2002)62 1477)。这种内在化能力还用于修饰脂质体以承载获得的siRNA高转染水平的基因治疗(Zhang 等，J. Control. Release. (2006) 112(2) :229)。不同研究也说明了用于吸收聚精氨酸的启动子能力，其用于穿过鼻粘膜的荧光标记的通道(Miyamoto等，Eur. J. Pharm. Biopharm(2001) 52⑴21)、心钠素或降I丐素的通道(Natsume 等，Drug Deliv. Syst. (1999) 14:21)。文件 US2003215491 还描述了作为启动子的聚精氨酸用于通过形成脂类基质吸收穿过鼻子的生物活性分子的能力，该脂类基质由磷脂或油组成。文件US005716614A1还使用脂肪酸和聚精氨酸的组合以用于形成活性分子释放系统，如指向中枢神经系统的胶团、囊泡或脂质体。从聚精氨酸制定的其他系统在文件US2006269606和W02006116546中公开，其中描述了微胶囊通过包覆聚精氨酸聚氨基酸以承载活性分子的核形成。而今，可以很方便地指出旨在形成微粒或微胶囊的微胶囊封装技术普遍与用于形成纳米系统的纳米工艺技术不同。同样的，通过两种工序获得的胶体系统在其尺寸以及其行为和后续应用方面都具有非常不同的特征。另外，精氨酸是众所周知的氧化氮前体，重要的血管舒张剂；因此聚精氨酸作为治疗剂用于包覆心血管植入物。同样的，文件US2006062821描述了聚合物核心用聚精氨酸包覆以获得脂质体、微球体或包覆乳化剂以形成在心脏病学中的可植入装置。因此，越来越需要为目前存在的系统提供可选择的活性成分释放系统。特别地，方便的是提供稳定的纳米系统以作特定应用，其适用于封装不同溶解度的分子，而且其在生物表面上将进一步具有良好的内在化和吸收性能。
本发明的作者已经开发了容易通过不同实验方法获得的纳米胶囊系统，其中纳米胶囊包含盐形式的聚精氨酸和相应地包含油和负磷脂组分的油核(oily core) 0所述纳米胶囊系统允许活性成分的有效结合(不管其亲水性/疏水性)和在合适介质中的后续释放。缩小尺寸的所述纳米胶囊，直径小于lum，使它们穿过粘膜并通过细胞将它们内在化。同样的，聚精氨酸包覆的存在便于对它们的吸收，并给予纳米胶囊稳定性，另外赋予其高正表面电荷，其允许与负电荷有机体，如粘膜或肿瘤细胞的生物表面相互作用。因此，本发明的第一方面涉及施用包含直径小于Ium的纳米胶囊的活性成分的系统，该纳米胶囊包含聚精氨酸盐、负磷脂和油。在另一方面，本发明涉及包含如上述定义的系统的药物组合物。在另一方面，本发明涉及包含如上述定义的系统的化妆品组合物。同样的，本发明涉及所述系统在制备药品中的用途。在一个特别的实施方案中，所述用途涉及癌症治疗。在另一方面，本发明涉及获得如上述定义的系统的方法，其包含a)制备聚精氨酸盐的水溶液；b)制备负磷脂和油的有机溶液；c)边搅拌边混合步骤a)和b)中制备的溶液，自发获得纳米胶囊；和d)任选地，完全地或部分地从先前步骤中获得的混合物中蒸发有机溶剂到定容。根据特殊实施方案，通过加入到步骤a)或步骤b)或甚至在纳米胶囊形成时，取决于所述活性成分的溶解度，封装活性成分。在更特殊的实施方案中，疏水活性成分加入到步骤b)的有机溶液中。在另一个更特殊的实施方案中，如果活性成分是亲水的，优选地将其在水中溶解加入到步骤b)中。根据另一个特殊的实施方案，亲水活性成分能够通过将相同成分并入步骤d)中获得的纳米胶囊的方式合并。在另一其他方面，本发明涉及获得如上述定义的系统的方法，该方法包含用聚精氨酸盐通过聚精氨酸盐水溶液的培养过程包覆至少由负磷脂、油和水相组成的纳米乳化剂。根据一个特殊的实施方案，该方法进一步包含加入活性成分。根据一个更特殊的实施方案，如果活性成分是亲水的，将所述活性成分优选地溶解于水，之后加入到纳米乳化剂中。根据另一个更特殊的实施方案，如果活性成分是疏水的，将所述活性成分优选地溶解于乙醇，之后加入形成纳米乳化剂的过程中。根据另一特殊的实施方案，活性成分通过吸收之前形成的纳米胶囊的方式合并。根据之前方法的特殊的实施方案，辅助组分加入到在步骤b)中制备的溶液或纳米乳化剂中，其优选为疏水聚氧乙烯衍生物，而且更优选为聚乙烯二醇硬脂酸盐。这种辅助组分允许调节系统纳米胶囊的表面电荷，并为它们提供防护盾以改进它们在生物流体中的稳定性。 图I示出了分别为3% w/w和6% w/w的聚精氨酸(PArg)纳米胶囊系统的TEM图像。图2示出了通过电泳以不同电荷比例(3、10和30% )与聚精氨酸纳米胶囊系统(NC)结合的pDNA度的评估。该研究的系统是-游离pDNA-聚精氨酸/pDNA纳米胶囊系统-聚精氨酸/pDNA纳米胶囊系统+肝素图3示出了 DNA/聚精氨酸复合物在水中和在磷酸盐缓冲液中的大小。图4示出了与pDNA/聚精氨酸纳米胶囊系统、pDNA/聚精氨酸-PEG纳米胶囊系统和pDNA/聚精氨酸复合物结合的pDNA度的评估。图5示出了聚精氨酸纳米胶囊系统的多烯紫杉醇(DCX)释放剖面图。图6示出了在4°C至37°C储存的3% w/w聚精氨酸纳米胶囊系统制剂的颗粒尺寸的评估(尺寸(rim)对时间(月))。图7示出了在4°C至37°C储存的6% w/w聚精氨酸纳米胶囊系统制剂的颗粒尺寸的评估(尺寸(rim)对时间(月))。图8示出了在冻干过程后海藻糖对聚精氨酸纳米胶囊系统(以5和10% w/v)的颗粒尺寸的防冷冻效果(以5和10% w/v)。图9示出了聚精氨酸纳米胶囊系统细胞增殖抑制能力研究。针对聚精氨酸NC、溶液中的DCX、聚精氨酸/DCX NC描述了在不同浓度的DCX下细胞活力的百分比。图10示出了聚精氨酸纳米胶囊系统细胞摄取研究。比较从聚精氨酸纳米胶囊系统获得的细胞入口值(cell entry values)与纳米乳化剂和游离突光标记。图11示出了在纳米系统中取决于聚精氨酸量的聚精氨酸纳米胶囊系统细胞摄取研究。细胞入口值从3和6% w/w聚精氨酸纳米胶囊系统制剂中获得。

并入系统中的活性成分的比例能够达到系统组分总重量的大约50% (以重量计)。然而，在每个实例中，合适的比例将取决于并入的活性成分、所使用的指征和施用效率。在特殊的实施方案中，活性成分的比例能够达到大约IOwt优选地达到大约5wt%。在合并作为活性成分的多核苷酸，如DNA质粒或干扰RNA的具体实例中，其在所述系统中的比例能够达到大约30wt%,优选地达到大约IOwt%。在特殊的实施方案中，上述定义的系统能够将辅助组分并入它们的胶囊结构中，其改进它们在生物流体中的稳定性并通过免疫系统(单核吞噬细胞系统)减少它们的摄取。这种辅助组分将优选地是疏水聚氧乙烯衍生物，更优选地是聚乙二醇硬脂酸盐。
获得纳米胶囊系统的方法是简单的方法，其防止如高温这样的极端条件。实施任何类型的化学反应来获得同样物质也是不必要的，因为正如所指出的，获得系统的方法是通过离子相互作用。因此，并入系统的分子的完整性(其易受降解的影响)就这样保存。为了在理想的尺寸范围内形成纳米胶囊，形成由油组成并由负磷脂包覆的油核；同时产生磷脂和聚精氨酸聚氨基酸之间的静电相互作用，其将导致获得聚精氨酸纳米胶囊。因此这是一个溶剂乳化-扩散过程，其以可控的方式发生并将为系统提供稳定性，不需要在组分之间形成共价键。获得本发明系统的特殊方法包含a)制备聚精氨酸盐的水溶液；b)制备负磷脂和油的有机溶液；c)边搅拌边混合步骤a)和b)中制备的溶液，自发获得纳米胶囊；和d)任选地，完全地或部分地从先前步骤中获得的混合物中蒸发有机溶剂到定容。本发明的系统能够通过可选择的方法来制备，该方法包含通过聚合物水溶液培养过程使用聚精氨酸盐包覆纳米乳化剂。在特殊的实施方案中，培养过程包含将纳米乳化剂与聚精氨酸的水溶液混合。在更特殊的实施方案中，培养过程包含将纳米乳化剂与聚精氨酸的水溶液以优选的4 1(纳米乳化剂PArg溶液)比例混合，立刻产生涂层。所述纳米乳化剂至少由负磷脂、油和水相组成。水相优选的是重蒸馏水，尽管其可以含有表面活性剂、盐和其他辅助试剂。制备所述纳米乳化剂的方法在本领域中是已知的，并可以包含扩散、超声处理或均化过程(Prego 等，J. Nanosci. Nanotechnol. (2006)6 I ；Tadros 等，Adv. ColloidInterface Sci. (2004)109 :303)。获得纳米乳化剂的特殊方法包含i)制备负磷脂和油的有机溶液；ii)边搅拌边向水相加入步骤i)中获得的溶液以形成纳米乳化剂；iii)任选地，全部地或部分地蒸发有机溶剂至定容。获得纳米乳化剂的另一个特殊方法包含i)制备负磷脂和油的有机溶液；ii)向水相加入步骤i)中获得的溶液，并超声处理大约I分钟；iii)使用水以大约I : 10的比例稀释步骤ii)中获得的乳化剂；iv)任选地，全部地或部分地蒸发有机溶剂至定容。
获得纳米乳化剂的另一个特殊方法包含i)制备负磷脂和油的有机溶液；ii)向水相加入步骤i)中获得的溶液，并均化大约5分钟；iii)使用水以大约I : 8的比例稀释步骤ii)中获得的乳化剂，并均化大约10分钟；iv)任选地，全部地或部分地蒸发有 机溶剂至定容。根据之前方法的特殊实施方案，将由疏水聚氧乙烯衍生物组成的辅助组分加入到步骤b)或步骤i)的溶液中。优选地，组分是聚乙二醇硬脂酸盐。在更优选的实施方案中，聚乙二醇硬脂酸盐大约比例在I至2% w/v之间(聚乙二醇硬脂酸盐的重量/制剂的体积)。根据之前方法的特殊实施方案，如果活性成分是疏水的，就将所述活性成分加入步骤b)或步骤i)的有机溶液中。优选地，将所述疏水活性成分溶解在乙醇中加入。根据其他特殊的实施方案，如果活性成分是亲水的，就将所述活性成分加入步骤b)或步骤i)的溶液中。优选地，将所述亲水活性成分溶解在水溶液中加入。一旦纳米胶囊形成，还可能通过吸收步骤d)中获得的纳米胶囊悬浮液或在培养过程后合并它。纳米胶囊通过以不同比例混合所述溶液来形成。因此，相对于油核，纳米胶囊将具有组合物恒值，聚精氨酸的比例在大约1% w/w至27% w/w (聚精氨酸的重量/制剂的重量)之间改变。优选地，聚精氨酸盐的水溶液通过0. Img至60mg的聚精氨酸形成。有机溶液的溶剂优选的是乙醇/丙酮混合物，还更优选的比例在大约1/15至1/20之间，或其他有机溶剂如二氯甲烷。在特殊的实施方案中，油将加入到磷脂溶液中。根据上述第一个方法的获得本发明纳米胶囊系统的特殊实例包含a)制备IOml体积的聚精氨酸盐水溶液，其中溶解Img至30mg的聚精氨酸；b)制备由卵磷脂(20mg)的乙醇/丙酮(0. 25 4. 7mL)溶液和任选地PEG硬脂酸盐(48-96mg)(向其中加入62. L的Miglyol 812)形成的油相。如果需要的话,溶解在小容量水相(25UL)中的亲水活性成分能够并入此步骤中；c)边搅拌边混合在步骤a)和b)获得的溶液，自发获得纳米胶囊；d)任选地，蒸发之前步骤中获得的有机溶剂至定容。制造聚精氨酸纳米胶囊系统的方法能够包括另外的冻干步骤，以在其储存过程中对其保存，以使得它们的初始特征得到保全。为了冻干系统，加入糖来发挥防冷冻作用是必要的。用于实施冻干的糖是，例如海藻糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、麦芽糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。以冻干的形式，能够长时间储存纳米胶囊，并能够通过简单地加入最佳容量的水来轻易再生(如有必要)。根据这个另外的步骤，本发明还涉及冻干形式的聚精氨酸纳米胶囊系统。本文描述的纳米胶囊系统在悬浮液和冻干形式具有合适的稳定性，因此它们能够长时间储存。另外，还研究了它们在确定的生物流体中的稳定性，其确保它们在施用于有机体、人类或动物后会维持纳米胶囊形式。本发明的聚精氨酸纳米胶囊系统相比用于施用和/或释放药物的其他系统更具优势，因为与其他纳米系统，例如与复合物比较，其改进了在生物流体中的稳定性。由于改进了系统稳定性，将活性成分如PDNA封装到本文所述的聚精氨酸纳米胶囊中，这比pDNA/聚精氨酸复合物是更优选的。此外，纳米胶囊载体的存在为系统提供了更大的均一性，并且更有可能将其他组分如活性成分或赋形剂封装到纳米胶囊核中。由于所述聚氨基酸具有的强大的细胞内在化能力，将它们转化成如药物或化妆品系统这种非常有用的系统，本发明的纳米胶囊系统(在其组合物中包含聚精氨酸)已经显示其具有良好的吸收促进性能。因此，在特殊实施方案中，本发明涉及一种包含上述纳米胶囊系统的药物组合物和任选地一个或多个药学上可接受的赋形剂。特别地，活性成分并入本发明的纳米胶囊中产生系统，它们组合物的确定特征，其性能 和形态赋予它们在治疗领域上的很大的潜力。并入本发明系统中的活性成分将根据配方想要的治疗应用具有合适的药物疗法性能。在特殊的实施方案中，活性成分选自肽、蛋白、脂类或亲脂性化合物、糖类化合物、核酸或核苷酸化合物如寡核苷酸、多核苷酸或所述分子的组合。在优选的实施方案中，活性成分是多烯紫杉醇。在另一个优选的实施方案中，活性成分选自核酸，如寡核苷酸、干扰RNA、DNA质粒或多核苷酸，优选活性成分是DNA质粒。所述药物组合物能够通过不同途径，如通过粘膜、局部或肠道外施用，而且在它们之中，通过粘膜施用是最优选的。并入系统中的活性成分的比例能够达到纳米胶囊系统组分总重量的大约50%(以重量计)。然而，在每个实例中，合适的比例将取决于并入的活性成分、所使用的指征和施用效率。在特殊的实施方案中，活性成分的比例能够达到大约IOwt %，优选地达到大约5wt % o在作为活性成分并入多核苷酸，如DNA质粒或干扰RNA的具体实例中，其在所述系统中的比例可以达到大约30wt%,优选地达到大约IOwt%。由于其在皮肤上或穿过皮肤施用的良好性能，以及其长久的稳定性，本发明的纳米胶囊系统还适用于化妆品。因此，在另一个方面，本发明涉及包含如上述纳米胶囊系统和一个或多个化妆品上可接受的赋形剂的化妆品组合物。根据本发明的化妆品组合物包括任何流体组合物(纳米胶囊悬浮液或分散体)或以凝胶、乳霜、软膏或香膏形式存在的用于局部施用的任何组合物。所述化妆品组合物能够应用于人类或动物身体的多个表面部分，如皮肤、毛发系统、指甲、嘴唇和外生殖器，以及人类或动物身体的牙齿或粘膜。在本发明的特殊实施方案中，化妆品组合物具有卫生和美学目的，或用于中和或去除外寄生物，或用于散发香味、修饰皮肤外观和/或纠正身体气味和/或保护它们或使它们保持在良好状态。在本发明的变种中，化妆品组合物还能够并入亲脂性和亲水性的活性成分，尽管它们不具有疗效，它们具有作为化妆剂的性能。能够并入纳米胶囊系统的活性成分描述如下润肤剂、防腐剂、芳香物质、抗粉刺剂、抗真菌剂、抗氧化剂、防臭剂、止汗药、抗头皮屑剂、脱色剂、抗皮脂溢药剂、染剂、青铜色洗液、UV吸光剂、酶、芳香物质，等等。如上所述，在本发明中描述的纳米胶囊系统可能合并一个以上活性成分，其可以溶解在相同的溶液中或单独溶解，这取决于并入的分子的性质，阻止它们之间任何其他类型的相互作用(化学或物理相互作用)存在。为了更好地理解本发明的特征和优势，将参考以下一系列的实施例，其说明性地完成了先前的描述，但并不以任何方式局限于相同的描述。具体实施例
将使用一系列缩写来解释以下实施例PArg =聚精氨酸PArg纳米胶囊=使用此术语旨在使实施例和附图中涉及纳米系统的描述简单化，该纳米胶囊包含PArg、Miglyol 812和卵磷脂。PArg-PEG纳米胶囊=使用此术语旨在使实施例和附图中涉及纳米系统的描述简单化，该纳米胶囊包含PArg、Miglyol 812、卵磷脂和PEG硬脂酸盐.
DCX=多烯紫杉醇pDNA =质粒脱氧核糖核酸用于以下实施例的PArg盐是具有5000至15000Da分子量的聚-L-精氨酸盐酸盐。实施例I根据聚合物暈评估PArg纳米胶囊和PArgrPEG纳米胶囊的生理化学特征实施例I. I.根据用于在一个步骤中稀释溶剂的方法制备由PArg包覆的油核组成的纳米胶囊a)制备PArg盐酸盐的水溶液(IOmL),其中溶解I至30mg PArg ；b)制备由卵磷脂(20mg)的乙醇/丙酮(0. 25 4. 7mL)溶液形成的油相，向其中加入62. 5 ii L Miglyol 812。任选地，能够将PEG硬脂酸盐(48_96mg)并入此步骤中以分别产生I % w/v和2% w/v的PArg-PEG纳米胶囊；c)在5分钟内，在磁力搅拌下混合从步骤a)和b)中获得的溶液，自发获得纳米胶囊;d)有机溶剂蒸发至定容。当在此方法的实施方案中，当纳米胶囊由2. 5mg和5mg的PArg盐酸盐组成时,分别获得3% w/w和6% w/w的PArg纳米胶囊。一旦制备，测量它们的平均直径、多分散性指数以及它们的表面电荷(zeta电位)，并通过透射电子显微镜对纳米胶囊摄像。表I和图I示出了从根据步骤a)的水溶液中PArg量的所述参数获得的值。表I


本发明涉及施用包含直径小于1μm的纳米胶囊的活性成分的系统，所述纳米胶囊包含聚精氨酸盐、负磷脂和油。本发明还涉及获得所述纳米胶囊系统的方法，其药物和化妆品组合物，以及其在医药，特别是在治疗癌症的药物的制备中的用途。