专利名称：用于转基因玉米Mon810检测的标准质粒分子及其构建方法基因工程技术的出现和应用为农业、医学等领域开辟了一个全新的发展时代。自 1983年首例转基因烟草作物问世以来，基因工程技术发展日新月异，转基因作物新品种不断涌现，在短短20多年时间内得到了飞跃发展，据国际农业生物技术应用署(ISAAA)的最新资料表明，自1996年到2010年，全球的转基因作物种植总面积增加了 87倍，达到了 1.48亿公顷。与此同时，大量的遗传改良农产品涌入我国市场，我国农业转基因生物安全管理办公室已经为棉花、玉米、大豆、油菜四种作物颁发了安全进口证书。转基因玉米有11 个品系允许进口用于加工原料，其中包括转基因玉米Mon810。随着遗传改良作物的广泛种植，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题、转基因产品作为食品、饲料对人类及动物的可能带来健康问题、国际贸易问题、知识产权问题等生物安全性问题已引起世界性的广泛关注，国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。基于核酸的聚合酶链反应(PCR)检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。PCR检测方法建立的主要依据是特异性的扩增遗传改良植物的外源基因片段。在转基因植物中，稳定表达的外源DNA插入片段一般包括启动子、目的基因和终止子三类元件。针对扩增的外源DNA片段差异，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性 PCR检测。筛选PCR检测主要是以转基因植物的通用元件和标记基因作为特异性扩增片段， 由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因植物的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR检测的特异性，但可用于转基因植物检测的初步筛选，检测到这些通用元件也预示着检测样品中存在有转基因成分。基因特异性PCR检测以插入外源基因的特异性 DNA片段作为目的检测片段，相比筛选PCR特异性增强。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达形成新的具有相似农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性PCR检测方法不能异性的区分具有相似农艺性状的转基因植物及其品系。构建特异性PCR检测是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区DNA序列实现的。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因植物及其产品检测中使用较多。但是由于相同的转基因外源表达载体在基因转化过程中，可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性PCR检测不能区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每个遗传改良作物品系，都具有特异性的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，因此品系特异性检测方法具有较筛选、基因特异性和构建特异性PCR检测方法更高的特异性和准确性，能够特异性的检测专一的遗传改良作物品系。虽然，四种PCR检测策略特异性有所差异，但各有所长，目前所建立并应用于转基因作物检测的PCR方法主要围绕这四种策略。在实际检测中，标准物质十分重要。然而，由于专利权和现有技术的限制，遗传改良作物标准物质的获得相对较难。目前，用于转基因检测的阳性标准物质主要是用纯合的转基因植物材料配置的，到目前为止仅得到了十几种遗传改良作物的标准物质在市场上销售。但这类来源于农产品的标准物质，其必须有专门的研究机构来制备，贮存和测定过程受很多因素影响，很难维持恒定的量，而且，这些标准物质的转基因含量范围一般是从0. 1% 到5%，而实际检测的样品中的转基因含量可能会超出这个范围。标准物质的缺乏已成为检测方法建立和应用的瓶颈，阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有转基因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。经验证质粒标准分子在遗传改良作物鉴定检测中是很好的标准物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因和内标准基因，经济高效。近年来，越来越受到各国转基因检测专家和学者们的重视，并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因品系及其加工产品的定量PCR检测。现在文献报道的用于检测转基因玉米的质粒标准分子中，涉及转基因玉米MonSlO的有 pMul5、pMD-ZM、p3SNTM_9和ERM-AD413等，但是它们有的只能用于检测构建特异与筛选特异性，有的只能用于检测品系特异性，不能满足一种标准物质对筛选特异性检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测的要求。
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于转基因玉米MonSlO检测的标准质粒分子及其构建方法，具体涉及转基因玉米MonSlO筛选特异性检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测用标准质粒分子及其构建方法，使其可以代替转基因玉米 MonSlO的阳性标准物质用于遗传改良玉米的定性、定量PCR检测。根据转基因玉米MonSlO的品系特异性序列、构建特异性序列和内标准基因序列， 首先利用重叠PCR反应的原理设计特异PCR引物，经过PCR扩增获得转基因玉米MonSlO的品系特异性序列和构建特异性序列的重组DNA片段，利用分子克隆技术将重组DNA片段克隆到PMD18-T载体中。然后，利用设计的特异性引物扩增玉米内标准基因^的一段序列，按照设计的限制性内切酶酶切位点连接到PMD18-T质粒中重组DNA片段的上游，获得标准质粒分子，命名为PMHZ。本发明构建的标准质粒分子pMHZ可代替转基因玉米Mon810原有的阳性标准物质，用于定性和定量PCR检测，彻底解决转基因玉米MonSlO检测中标准物质缺乏的难题。同时，该质粒含有和序列，可以用于其他含有启动子和(b)的转基因品系的定性和定量检测。本发明所述标准质粒分子pMHZ，同时含有转基因玉米MonSlO的品系特异性序列、 构建特异性序列和内标准基因的一段序列，用以代替转基因玉米MonSlO的阳性标准物质，5可用于转基因玉米Mon810定性和定量PCR检测。本发明所述标准质粒分子pMHZ构建方法，包括如下步骤①利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得转基因玉米MonSlO的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性序列。所述的转基因玉米MonSlO的品系特异性序列，指的是转基因玉米MonSlO外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段DNA序列，其序列如^^ ID No:l所示。所述的构建特异性序列，指的是外源插入载体的#^770和cryIA (b)两个元件的连接区的一段DNA序列，其序列如kq ID No:2所示。所述的玉米内标准基因ζ5^/Λ，指的是编码玉米淀粉合酶异构体^JM II ~2的基因，其在玉米基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数的特点；玉米内标准基因zSSIIb GenBank中登录号为AF019297。所述的玉米内标准基因zSSIIb特异性序列，指的是玉米内标准基因的^6nt-536nt，其序列如kq ID No:3所示。②设计PCR特异引物。所述的PCR特异性引物，指的是与玉米遗传改良品系MonSlO的品系特异性序列、 构建特异性序列和玉米内标准基因基因序列完全相同或互补的寡聚核苷酸链，分别为MT--F,其序列如^^ ID No:4所示，MT--R,其序列如^^ ID No:5所示，用于扩增MonSlO玉米的品系特异性序列；HC-"F,其序列如^^ ID No:6所示，HC--R,其序列如^^ ID No:7所示，用于扩增MonSlO玉米的构建特异性序列；ZB-"F,其序列如^^ ID No:8所示，ZB--R,其序列如％(1 ID No:9所示，用于扩增玉米的内标准基因zSSUb基因的特异性序列。③特异性扩增转基因玉米MonSlO的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因^的特异性序列。所述的特异性扩增，指的是利用设计的PCR引物分别扩增转基因玉米MonSlO的品系特异性序列(Seq ID No: 1)、构建特异性序列(Seq ID No2)和内标准基因zSSUb的特异性序列(Seq ID No:3)。③转基因玉米MonSlO的品系特异性序列和构建特异性序列的拼接。所述的拼接，指的是利用重叠PCR技术将转基因玉米MonSlO的品系特异性序列和构建特异性序列连接融合成一个重组的DNA片段，其序列如％(1 ID No: 10所示。④重组DNA片段及玉米内标准基因^的特异性片段克隆进入pMDIS-T载体首先将上述得到的重组DNA片段用酶切位点I和历^d III连接到质粒载体 PMD18-T (TAKARA公司)中；然后将PCR特异性扩增的玉米内标准基因zSSIIb的DNA片段 (Seq ID No: 11)用酶切位点召a H I和I连接到pMD18_T质粒中重组DNA片段的上游，因此获得将转基因玉米MonSlO的品系特异性序列、构建特异序列以及玉米内标准基因的特异性序列融合在pMD18-T上的标准质粒分子pMHZ，其序列如kq ID No: 12所
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⑤标准质粒分子pMHZ的定性和定量PCR检测方法验证。所述的定性PCR检测方法验证，是指利用标准质粒分子pMHZ构建的品系特异性片段只能在转基因玉米MonSlO基因组DNA中扩展获得，而不能在其他玉米品系，和其他遗传改良作物基因组中扩增得到。所述的定量PCR检测方法验证，是指检测标准质粒分子pMHZ在进行定量PCR分析时的特异性、灵敏度、重复性和重演性等特性，以鉴定该标准分子替代转基因玉米MonSlO 阳性标准物质的能力，以及实际应用于定量PCR检测转基因玉米MonSlO的测定有效性。本发明的有益效果在于，利用重叠PCR和分子亚克隆的方法首次构建了含有玉米内标准基因特异性序列和转基因玉米MonSlO的品系特异性序列和构建特异性序列的标准质粒分子pMHZ。本发明中制备的标准质粒分子pMHZ可以代替转基因玉米MonSlO的阳性标准物质，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题。标准质粒分子 PMHZ对实际样品分析的结果比较准确，检测结果的偏差在ISO遗传改良食品检测标准允许的0-0. 25范围内。因此，本发明中构建的标准质粒分子完全适用于对转基因玉米MonSlO 样品及其加工产品中的遗传改良成分进行定量分析。


图1标准质粒分子pMHZ的示意图中PMD-18T表示构建标准质粒分子的载体；FcoR I表示该位点含有限制性内切酶 EcoR I的酶切位点.,BeuM I表示该位点含有限制性内切酶汉3 H I的酶切位点-’Η η III表示该位点含有限制性内切酶历id III的酶切位点，“zSSnb”表示玉米内标准基因zSSIIb 的一段特异性序列；“品系特异性序列”表示转基因玉米MonSlO外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段DNA序列；“构建特异性序列”表示外源插入载体的/&/770和以OJ两个元件的连接区的一段DNA序列。

1、构建标准质粒分子PMHZ的PCR引物序列设计
根据GenBank中公布的转基因玉米MonSlO外源插入载体与玉米基因组邻接区的基因序列(登录号AF434709 )，外源载体主要元件的序列信息(登录号AY326434 )以及玉米内标基因zSSIIb的序列信息(登录号AF019297)，利用软件I^rimer 5. O设计三对特异性引物 (如表1)，分别为
MT-F,其序列如^^ ID No 4所示，序列3-8碱基对处为汉3 H I的酶切位点， MT-R,其序列如^^ ID No:5所示；MT-F位于玉米基因组上，MT-R位于转基因玉米 MonSlO的外源插入载体的dK 仍启动子序列上，用于扩增MonSlO玉米的品系特异性序列；
HC-F,其序列如^^ ID No:6所示，
HC-R,其序列如^^ ID No:7所示，序列3-8碱基对处为历·/ (! III的酶切位点；HC-F好HsP70序列上，HC-R位于cryIA (b)序列上，用于扩增Mon810玉米的外源插入载体的 HsP70热cryIA 两个元件的连接区的构建特异性序列；
ZB-F,其序列如^^ ID No 8所示，序列3-8碱基对处为I的酶切位点， ZB-R,其序列如^^ ID No:9所示，序列3-8碱基对处为汉3 H I的酶切位点，用于扩增玉米的内标准基因zSSIIb基因的特异性序列。 2、转基因玉米MonSlO内源标准基因序列、品系特异性序列和构建特异性序列的扩增
以转基因玉米MonSlO基因组DNA为模板，利用以下设计的三对引物分别对玉米内标准基因zSSIIb的特异性序列(位于玉米内标准基因zSSIIb 296nt-536nt)、品系特异性序列和构建特异性序列进行PCR扩增。扩增条件均为 PCR反应体积为50 μ 1，包括以下成分 IOXPCR缓冲液5μ1dNTPs
上游引物(20 μ M) 下游引物(20 μ Μ) 模板
Taq DNA聚合酶 (MH9O
4μ 1 1 μ 1 1 μ 1 5 μ 1 0. 5μ 1 33. 5μ 1
PCR反应条件为94°C 5分钟；然后进入以下循环94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 60 秒，共30个循环；最后72°C延伸5分钟。经过PCR扩增后得到了长257bp的玉米内标准基因片段(其序列如kq ID No:10 所示)、长392bp的品系特异性序列片段(其序列如kq ID No: 13所示)和长440bp的外源插入载体的构建特异性序列片段(其序列如^^ ID No:14所示)，将上述PCR扩增得到的品系特异性序列片段和构建特异性序列片段产物分别记为PMT和PHC。对扩增得到的条带进行回收纯化，通过测序分析表明获得的序列与目的扩增片段序列一致。表1.构建标准质粒分子pMHZ的PCR引物序列


本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种遗传改良玉米品系Mon810检测用标准质粒分子及其构建方法。所述的质粒标准分子包含遗传改良玉米品系Mon810的品系特异性序列、构建特异性序列和玉米内标准基因zSSIIb特异性片段；通过对遗传改良玉米品系Mon810的外源插入载体边界序列及Hsp70和cryIA(b)两个元件的连接区的序列分析，设计品系特异性和构建特异性PCR引物，扩增获得遗传改良玉米品系Mon810的品系特异性片段和构建特异性片段，以及玉米内标准基因特异性序列；通过分子克隆的方法构建到一个质粒分子中，获得人工重组质粒分子pMHZ。本发明构建的标准质粒分子完全可以替代遗传改良玉米品系Mon810阳性标准品，用于对遗传改良玉米品系Mon810样品的定量PCR分析和检测。