专利名称：用于治疗人类增生性和炎症性疾病的基于二吲哚基甲烷的药物的制作方法基于源自十字花科族(包括卷心菜、抱子甘蓝、花椰菜和西兰花)的吲哚化合物及其人工合成类似物的药物在当今的医疗实践中被广泛使用。特别地，它们抗癌和抗雌激素的特性说明了这类化合物令人感兴趣的原因，所述特性使得它们适用于治疗伴有增生过程的女性生殖系统器官性疾病及某些激素病理性疾病。在该类疾病中最普遍的疾病包括乳腺病、子宮肌瘤、子宮内膜异位症、子宮腺肌症、各种病因导致的宫颈发育不良和甲状腺增生。 生殖器官的肿瘤在女性肿瘤发病率排行中位于首位，并且其发病率平均每年增加1%。肿瘤在死亡率排行中位于第二，并且其死亡率的“增长率”(28%)保持最高。根据WHO专家介绍，全世界毎年登记的乳腺癌病例约ー百万件，它们中的三分之一具有致命結果。一些研究人员估计，在未来的十年，全世界将有五百万女性会患有这种恶性肿瘤。作为公知常识，生殖器官组织会连续不断地受到各种刺激而使分裂(增生)活跃及诱导特定信号级联的开始的因素的影响。这些因素包括三个主要导致细胞增生活跃的胞内机制(I)激素(或雌激素依赖性)机制；(2)生长因子诱导机制；和(3)促炎细胞因子激活机制。当今公认雌激素參与了激素依赖性组织(乳腺上皮细胞、子宮内膜和宫颈)中肿瘤的发育过程，并且其被视为在肿瘤的形成过程中的主要病因之一。目前，乳腺增生形成过程的发病机制已经研究清楚。显然，通过阻滞刺激乳腺细胞増殖信号的主信号转导通道，我们预期能够成功地预防和治疗由此产生的病理病例。換言之，生殖系统器官的过度增生性疾病的药理矫正能够在所有阶段进行，并且涉及介导关键病理生理功能的所有信号级联。经过多年努力以寻找阻滞激素依赖性组织的增生过程的天然化合物，最終取得了成功。吲哚-3-甲醇(I3C)植物营养素是这些存在于十字花科蔬菜(各种卷心菜)中的化合物之一。I3C由于生物活性谱广而能够预防肿瘤。I3C对各种疾病的临床效果显著地依赖于用药患者的新陈代谢的个体特质，尤其是他们将I3C转化为其各种衍生物的能力，这些衍生物反过来能够产生协同作用和/或拮抗作用(Dalessandri K. M.，Firestone G. L.，等(2004), Pilot Study:Effect of3-Diindolylmethane Supplements on Urinary HormoneMetabolites inPostmenopausa丄 Women with a History of Early-Stage Breast Cancer.Nutritionand Cancer, 50(2)，161-167)。3，3’ - ニ吲哚基甲烷(DM)是由吲哚-3-甲醇经过寡聚产生的衍生物之一。该化合物实质上显示出了吲哚-3-甲醇固有的所有生物效应，包括其积极影响雌激素代谢物比率变化的能力。但是，DIM在人类机体中不会被代谢转化，是ー种稳定的化合物。ニ吲哚基甲烷与吲哚-3-甲醇的这些区别使得DM成为与其它药理活性物质一起制备治疗增生性和增殖性疾病的药物组合物的更加优选的选择。DIM能够用来治疗各种炎症性疾病(W) 2006105196,公布日2006. 10. 5)。 已经发现DM能够干扰新陈代谢从而诱导细胞的前凋亡死亡。特别地，DM激活ー种关键细胞凋亡酶Caspase-8，导致肠癌的转化细胞的死亡(Kim E. J.，Park S. Y.，等(2007), Activation of Caspase_8Contributes to DiindoIyImetnane-InducedApoptosis in Colon CancerCeIIs, J ofNutrition, 137，31-36)。我们假设 DIM激活细胞凋亡机制的能力也能够延伸至细胞内微生物(特别是，沙眼衣原体(ChlamydiaTrachomatis))感染的细胞。沙眼衣原体感染非常普遍，并且按照许多研究人员的观点，其是造成女性不孕的主要病因之一。抗生素是治疗衣原体宫颈炎的ー种传统疗法。然而，在疗程结束后，几乎309Γ40%的病例不能够完全清除感染源，从而导致疾病复发。原因在于沙眼衣原体的生命周期由若干阶段组成，其中之一的“包含体”对抗生素具有抗药性。这解释了为什么抗生素疗法并不充分有效。研究人员一直在尝试去开发出具有高的ニ吲哚基甲烷吸收率的配方。具体地，公布日为2004年2月10日的美国专利第6，689，387号开发出了用于治疗乳腺病和子宮内膜异位症的现有技术药物组合物，该药物组合物由存在于淀粉基质中的I3C或3，3’ - ニ吲哚基甲烷的微粒组成，例如用于ロ服的固体药物配方。这些配方含有309Γ70%的淀粉，其提高了活性剂的溶解性但没有给它们带来足够的存储稳定性。基于聚こニ醇化的维生素E的DM配方在现有技术中已公知(美国专利号6，416，793，公布日2002年7月9日)。TPGS基组合物虽然协助实现非常显著地增加了DM、其类似物及衍生物的生物利用度(不超过509^100%)，但由于这个原因，不能使用这些化合物的治疗潜カ能力。另外，其制备必须在能源密集型エ艺中进行喷雾干燥，从而增加了生产成本。国际申请TO 2009032699(公布日2009年3月12日)描述了与本发明最接近的现有技术，其涉及基于DM、多不饱和脂肪酸(PUFAs)和叶酸的抗增生性组合的药物组合物。这些组合物存在缺陷，因为它们不够稳定，主要组分在存储期间会产生微小晶体沉淀。另外，大多数人缺乏Ω-3脂肪酸，衍生的PUFAs可能只有被夸大的效果。根据最近的调查结果，叶酸的添加对于具有自身免疫型炎症性疾病的小孩是不利的。值得注意的是，吲哚衍生物在儿科实践中已被证明是有效的。特别地，吲哚-3-甲醇和3，3’ - ニ吲哚基甲烷被广泛用来治疗幼儿的呼吸道喉乳头状瘤病(AubornK. J. (2002), Tnerapy for RecurrentRespiratory Papi Ilomato sis, AntiviralTherapy, 7(1), 1-9)。固体药物配方很难分剂服用。临床实践需要能够以每I千克体重I毫克服用准确剂量的液体药物配方。
本发明的目的是(I)开发出基于3，3’-ニ！!引哚基甲烧的药物配方(drugformulation),其能够有效治疗慢性炎症和增生性过程，并且具有最大的生物利用度，且能够使得患者血液中活性剂的浓度在每毫升血液中显著的超过200ng ;和(2)开发出在儿科实践中易于进行分剂服用的液体3，3’ - ニ吲哚基甲烷药物配方。该目的通过3，3’ - ニ吲哚基甲烷的新型药物配方得以实现。该新配方是ー种溶液，含有活性剂3，3’ - ニ吲哚基甲烷、鳕鱼肝油(cod-liveroil)载体和至少ー种聚山梨醇酯(polysorbate),各组分的质量％的比例如下3，3’-ニ吲哚基甲烷1 20鳕鱼肝油10 20 聚山梨醇酯余量。通过以特定的比例选择鳕鱼肝油和聚山梨醇酯作为载体实现了最大生物利用度和存储稳定性。聚山梨醇酯通常是水基药物的表面活性剤，而表面活性剂是脂肪的乳化剂和稳定剂(溶剤)。聚山梨醇酯编号(20、40、60和80)与键合到ー些分子上的脂肪酸的类型有关(聚山梨醇酯20涉及椰子油酸，聚山梨醇酯40和60涉及棕桐油酸，而聚山梨醇酯80涉及橄榄油酸)。根据本发明，可以使用任何聚山梨醇酯或其混合物。但是，优选聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。能够与花生四烯酸共同生物合成大部分具有形成血栓活性较低的血管扩张的前列腺素和白细胞三烯的多不饱和脂肪酸(EPA和DHA)在鳕鱼肝油中没有充分的浓缩，因而不具有疗效，由于这个原因，如果使用它们作为载体提高了 DIM的生物利用度，但并不能产生预期的疗效。所述溶液可以包装在深色玻璃瓶中或胶囊中。传统上将油基药物配方包装于软明胶胶囊中。但是此类胶囊不是气密的，所以DM逐渐被氧化，因而降低了主剂的浓度。因此，优选使用包覆有羟丙基甲基纤维素或其邻苯ニ甲酸酯的固体明胶胶囊。例如，ー种可能的选择是Capsulgel公司开发的Licaps胶囊。可以在氩气中将溶液装入这些胶囊中并用激光密封。该药物也用于治疗人类的增生性和炎症性疾病。可用本发明要求保护的药物处方的疾病的实例包括子宮肌瘤、子宮腺肌症、甲状腺增生、过敏性皮炎、克罗恩病、和其他炎症性肠道疾病、喉乳头状瘤和衣原体宫颈炎。该药物优选的给药率为患者每千克体重使用3，3’-ニ吲哚基甲烷O. 5 2mg。根据疾病的严重程度、年龄、性别和主治病症，可以增加或减少剂量。在以下附图中说明了本发明图I所示为接种了 MCF-7肿瘤的无胸腺小鼠(nu/nu)C57Black/6的生长动态，(~D~)为对照，(■)是胃内给有(intrastomachic administration)所要保护药物的动物，和)是胃内给有基于晶体DIM制剂的动物；图2所示为以200. 0mg/kg(线性坐标)的比率胃内给药DM后实验动物血浆中DIM浓度的平均动态；图3所示为以200.0mg/kg(对数坐标)的比率胃内给药DM后实验动物血浆中DIM浓度的平均动态；图4所示为以0. 10mg/kg(线性坐标)的比率胃内给药高生物利用度的DM胶囊后，实验动物血浆中DIM浓度的平均动态；图5所示为以O. 10mg/kg (对数坐标)的比率胃内给药高生物利用度的DM胶囊后，实验动物血浆中DIM浓度的平均动态；图6所示为治疗前后特应性皮炎患者的外周血淋巴细胞产生的细胞因子；和图7所示为以血清中总IgE水平治疗特应性皮炎患者的效果。

的下述实施例来描述本发明实施例I高生物利用度的3，3’- ニ吲哚基甲烷(DM-高生物利用度(DM-HB))的可溶性药 物配方的生产方法向聚山梨醇酯(或聚山梨醇酯的混合物)中加入鳕鱼肝油，加入的比率为组合物总重量的1(Γ20%，仔细搅拌所得的混合物直至获得均匀液体。按照19Γ20%的比率(每Ig组合物，l(T200mg该物质)向所得溶液中加入3，3’ - ニ吲哚基甲烷，并搅拌直至其完全溶解。将所得的溶液装入特定用途的胶囊中或装入深色玻璃瓶中。实施例2基于3，3’ - ニ吲哚基甲烷的药物配方A.含有IOOmg的3，3’-ニ吲哚基甲烷、IOOmg的鳕鱼肝油和8(T400mg的聚山梨醇
酷的胶囊。B.含有50mg的3，3’-ニ吲哚基甲烷、50mg的鳕鱼肝油和8(T400mg的聚山梨醇酯
的胶囊。C.含有20mg的3，3’-ニ吲哚基甲烷、80mg的鳕鱼肝油和8(T450mg的聚山梨醇酯
的胶囊。D. IOml深色玻璃瓶，含有溶液，每Ig该溶液中含有浓缩的3，3’ - ニ吲哚基甲烷IOmg,10%的鳕鱼肝油和余量为聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯40的混合物。E. 50ml深色玻璃瓶，含有溶液，每Ig该溶液中含有浓缩的3，3’ - ニ吲哚基甲烷IOOmgU5%的鳕鱼肝油和余量为聚山梨醇酯80。实施例3所要求保护的药物的特定药理活性的体内实验研究在将肿瘤细胞接种至无胸腺(nu/nu)的雌性小鼠株C 57Black/6的前一周，在所述小鼠的肩胛下区植入含有O. 72mg雌ニ醇的药丸，该药丸在60天内能够释放激素。为了诱导实体肿瘤，用O. 05%的胰蛋白酶-EDTA(Sigma，U. S.)收集人乳腺癌的肿瘤细胞系MCF-7，并用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)淋洗3次，随之在各实验动物的侧部区域皮下注射含有三百万细胞的O. Iml生理盐水(用台盼蓝(O. 1%)和光学显微镜对活细胞进行计数)。在接种异种哺乳动物肿瘤细胞24小时后，每天给测试组(每组10只动物)中的每只小鼠(通过探针)胃内导入Img当量的实施例2第D项要求保护的药物。向对照动物给用生理盐水。在实体肿瘤出现后，每2或3天测量一次大小。
在System Gold液相色谱议(产自Beckman, U. S.)上使用UV检测器在可变波长下以HPLC方法测量小鼠株C 57Black/6的血浆中DM的量。以20mg的DM/kg当量所要求保护的药物向测试组动物(组中共36只动物)胃内给药(通过探针)，并且按照250mg的DM/kg的比率给药单独的I3C(组中有30只动物)，进而获得血液样品。向对照动物给用生理盐水。在给药所要求保护的配方后O. 25、O. 5,0. 75、I. O、I. 5,2. 0,4. 0,6. 0,12. 0,18. 0,24. O 和 36. O 小时的时间点，以及在给药单独的 DM 后 O. 25,0. 5,0. 75、L O、L 5,2. 0,4. 0,6. 0,12. O 和 24. O 小时后的时间点，用肝素化的注射器从试验动物的尾静脉中提取外周血(每个时间点用3只动物)。每份血样都置于含有肝素的试管中。将血样离心(10，000X g，5分钟)，随后提取I. 5 2. Oml血浆，冷冻并在-20°C保存。即将HPLC分析前，向体积为250 μ I的实验血样中加入内标物4_甲氧基_吲哚
(IS)(2. 5μ I溶液，浓度为O. 4mg/ml)，用涡旋器搅拌，在室温下放置30分钟，然后用叔丁基 甲酷(750 μ I)萃取样品两次。通过离心(2，800Xg, 10分钟)将每个样品中的有机相与水相分离并将有机相转移至新的4ml试管中。将每个实验时间点的样品的有机层合并，有氮气流下蒸发去除酷，向残留物中加入150 μ I洗脱液(こ腈/50mM的Hepes-缓冲液，体积比为40:60，pH为7. 4)，取50 μ I所得样品注入色谱仪中。将对照血浆样品进行相似的处理，向其中在浓度范围O. 05^10. O μ g/ml内加入指定量的ニ吲哚基甲烷。用UV检测器在280nm的波长下在System Gold (Beckman, U. S.)上测定血衆中DIM的量。在室温(22 24°C )用Nucleosil柱C 18. 5 μ m(4. 6X 50mm)进行液相色谱分析。洗脱液(流动相)由水和こ腈(AC)组成。在进行色谱法之前对流动相脱气并过滤。按以下顺序的AC浓度梯度进行洗脱(I)在首先的20分钟内，15% 60%的AC ；⑵第20 40分钟内，60% 65%的线性AC梯度；(3)第40 65分钟，65% 85%的线性AC梯度；以及(4)用15%的AC重复柱平衡5分钟。洗脱总共持续70分钟，洗脱速率为lml/min。在显示有这些物质的浓度与色谱峰面积的关系的校正曲线上测量实验样品的DM浓度。在HPLC分析中所使用的方法的灵敏度为O. 05 μ g/ml。通过测量实验组和对照组动物中实体肿瘤的大小来评价这些化合物的抗肿瘤效力。图I显示，从实验开始至约12天时，没有使用所要保护的药物的对照组动物的实体肿瘤显示出集约型生长。在随后的20天(实验的第1Γ34天)，由人腺癌细胞系MCF-7诱导的肿瘤的平均大小增加了约10倍。在同样的时间内，在使用了所要保护的药物的动物中的平均肿瘤大小仅增加了 5倍。以Img剂量向无胸腺(nu/nu)的小鼠C57Black/6给用所要保护的药品，显著的减缓了通过给动物接种人类哺乳动物肿瘤细胞系MCF-7诱导的实体肿瘤的生长。另外，如果以指定的剂量使用，所要保护的药物既未给肝脏、肾脏和其它重要功能性器官的细胞形态造成任何变化，其也未给实验动物的体重造成任何的影响。
因此，可以得出的结论是在异种移植动物模式上，所要保护的药物在体内针对乳腺癌具有显著的抗肿瘤作用。对动物组织(实验结束后，在こ醚麻醉状态下杀死)的组织学研究表明，所要保护的药物显示出以指定的剂量进行用药既不会给肝脏、肾脏和其它重要功能性器官的细胞形态造成任何变化也不会给实验动物的体重造成任何的影响。实施例4胃内给用200. Omg/kg的3，3’ - ニ吲哚基甲烷物质的实验动物的血浆中3，3’ - ニ吲哚基甲烷的浓度(μ g/ml)表I中显示了胃内给用所述物质的小鼠的血浆中3，3’-ニ吲哚基甲烷物质浓度的測量結果。平均药代动力学曲线如图2和图3所示。表I


本发明涉及药物和化学制药工业领域。所述药物用于治疗人类增生性和炎症性疾病，含有作为活性剂的3,3’-二吲哚基甲烷和含鳕鱼肝油和至少一种聚山梨醇酯的混合物的载体，各组分的质量%的比例如下3,3’-二吲哚基甲烷1~20，鳕鱼肝油10~20，聚山梨醇酯余量。