专利名称：检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和试剂盒的制作方法猪繁殖与呼吸综合征(porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是危害当今养猪业的主要疫病之一，给世界养猪业造成巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综 合征的控制一直是养猪生产国家所面临的艰巨任务，即使在养猪业发达的美国及西欧国家，也是一大难题。在我国，PRRS的危害也日益严重，自1995年传入至今，我国几乎所有的省市都时有PRRS的发生。历年来的流行病学和血清学调查结果表明，在我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的感染率非常高。PRRSV还是猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的一个主要原发性病原。在饲养管理水平低、卫生条件差的猪场，常与PCV2、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪伪狂犬病毒、猪附红细胞体、链球菌等混合或继发感染，这样的猪群死亡率高，且多数猪场伴发母猪繁殖障碍。在PRRS暴发中或暴发后，不少猪场的种猪和成年猪继发弓形体病，呈暴发性、地方性流行或散发性发生。2006年，我国爆发的“猪高热综合症”给养殖业带来灾难性的打击，现已经查明主要病因是兰耳病高变异毒株。PRRSV在造成严重经济损失的同时也给疾病防疫带来巨大困难。PRRSV感染后引起的病理及组织学变化往往不易与其他传染病区分，因此PRRS的确诊必须依赖于实验室手段。目前本病的检测方法主要包括病毒分离鉴定，血清学检测方法以及分子生物学检测方法。其中病毒分离方法需要时间长，对病料要求高，因此不利于大量临床样品的快速诊断。检测病毒的血清学方法有荧光抗体染色和免疫酶测定技术。这些检测方法技术性较强，操作烦琐，也不适用基层诊断和大规模的流行病学调查。随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于临床样品的诊断，检测的目标通常是针对PRRSV基因组的保守区0RF7，0RF6或ORFlb。PCR技术直接检测临床样品中PRRSV的基因组RNA，省去了细胞培养和病毒分离的过程，所以比病毒分离省时，且敏感性要高于病毒分离，特异性也非常高。可用于PCR检测的样品包括血清、精液、肺组织以及胎儿。PCR方法可以在较短时间内得到结果(24h 48h)。国内外很多学者都建立了检测PRRSV的RT-PCR方法或套式RT-PCR检测方法。PCR方法在PRRS诊断以及群体监测上可以发挥很大作用，比如用于后备种猪的筛选，持续性感染猪的诊断以及用于猪群的净化工作。荧光定量PCR检测技术是近年来发展起来的一种新技术，与传统诊断方法比较具有很多突出的优点，引物与探针可以大量合成并长期保存，检测速度快(仅需2 4h)，结果可靠，不易污染，避免散毒，而且敏感性要高于常规的PCR检测方法，通过探针设计还能区分不同的毒株亚型，因而具有广阔的应用前景。在本研究中，我们采用TaqMan荧光RT-PCR方法建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的检测技术，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化。建立了灵敏、特异，能够应用于临床样品的诊断和检测的试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，包括引物序列和TaqMan水解探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)检测试剂盒。 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和3’端非编码区的特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50% -60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。探针的长度在25个碱基左右，采用TaqMan修饰，并标记荧光基团。一组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列，如下I) 5’ -GCATGATGGGCTGGCATTC-3’ (SEQ ID NO 1)2) 5，-CCCACACGGTCGCCCTAAT-3，(SEQ ID NO 2)3) 5’ -[FAM]-ATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-[TAMRA 或BHQl]-3’ (SEQ ID NO:3)其中序列I)和2)分别为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的正义引物和反义引物，序列3)为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的TaqMan修饰的荧光探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM (6-carboxy-荧光素)，3’端标记淬灭基团TAMRA或BHQl。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。由于使用RT-PCR固体酶颗粒体系与使用反转录酶M-MLV+Taq酶体系都能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)，所以两种体系均可以应用于检测。使用RT-PCR固体酶颗粒体系成本较高但操作简单，使用反转录酶M-MLV+Taq酶体系操作较复杂但成本比较低。可以根据需要，选择检测试剂盒的组成。本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)检测试剂盒A，由以下组分组成I)裂解液购自INVITR0GEN公司；2) RT-PCR反应液，表I为反应液配方；表I反应液配方本发明公开了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和试剂盒，该检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1至SEQIDNO3所示，其中序列SEQIDNO1和SEQIDNO2分别为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO3为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好的特点。