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一种抗肿瘤组合物及其制备方法

  • 专利名称
    一种抗肿瘤组合物及其制备方法
  • 发明者
    王正华
  • 公开日
    2011年6月1日
  • 申请日期
    2010年12月23日
  • 优先权日
    2010年12月23日
  • 申请人
    浙江千年春生物技术有限公司
  • 文档编号
    A61K38/51GK102078602SQ201010601600
  • 关键字
  • 权利要求
    1.一种抗肿瘤组合物,其特征在于由氨基酸序在NCBI数据库中登录号分别为Gi 2148169、Gi 114236、Gi 2148173、Gi 8101742、Gi2148175、Gi 157674463、Gi 4533081 的 蛋白a、蛋白b、蛋白C、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g组成2.根据权利要求1所述的抗肿瘤组合物,其特征在于,重量百分组成为蛋白a25 30%、蛋白b ;35 40%、蛋白c 5 10%、蛋白d 1 5%、蛋白e 25 30%、蛋白f 1 5%、蛋白g 1 5%3.根据权利要求2所述的抗肿瘤组合物,其特征在于,重量百分组成为蛋白a25 、蛋白b ;35 38%、蛋白c 5 8%、蛋白d 1 3%、蛋白e 25 27%、蛋白f 1 2%、蛋白g 1 3%4.根据权利要求3所述的抗肿瘤组合物,其特征在于,重量百分组成为蛋白a 26. 84%、蛋白 b 36. 22%、蛋白 c 5. 25%、蛋白 d 2. 85%、蛋白 e 25. 77%、蛋白 f 1. 97%, 蛋白g 1. 1%5.一种权利要求1所述的抗肿瘤组合物的制备方法,包括(1)将大头金蝇消毒后驯化2代以上,得到种蝇;(2)培养基置于培养箱内发酵3 5小时后将种蝇放入培养箱内产卵,控制培养箱内 氨气浓度为50 200ppm,卵孵化后,控制培养箱内温度为沈 35°C,氨气浓度为500 lOOOppm,继续培养M 120小时;(3)将幼虫清洗干净后,冷冻干燥、粉碎,将粉碎物浸入1 15°C的水中30 40小时, 10000转/分下离10分钟,取上清液并进行超滤,去除分子量小于8000KD的组分,即为成6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,卵孵化前,培养箱内一氧化碳浓度小于 30ppm,氧气浓度20 50ppm,二氧化碳浓度3000 6000ppm7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,孵化后,培养箱内一氧化碳浓度小于 IOppm08.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的培养基为青蛙肉、家禽肉、家畜肉、 家畜内脏和淡水鱼肉中的一种或多种9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的培养基重量配比为10 60%的 淡水鱼肉、20 70%猪内脏和10 50%的青蛙肉
  • 技术领域
    本发明涉及肿瘤治疗领域,尤其涉及一种抗肿瘤组合物及其制备方法
  • 背景技术
  • 具体实施例方式
    实施例1驯化野生大头金蝇取自然界的大头金蝇,为避免野生种类的带菌传病之嫌,经过高猛酸钾消毒处理 后,进行2 3代隔离饲养,然后在接近自然的养蝇房内养殖驯化,经过四代后,种蝇驯化完 成,得到种蝇如来年不再驯化种蝇,就需要保存种蝇保种的方法为在9 10月份秋末时,把 蝇蛹放入密封容器内,置于温度为5 10°C的冷藏室内,在该温度下蛹不会死亡也不会孵 化,来年室外温度上升到22°C以上时,取出放进蝇房即可孵化实施例2培养幼虫将20千克培养基(60%的淡水鱼肉、30%猪内脏和10%的青蛙肉)置于培养箱 内培养箱体积0. 14立方米,制作材料可使用金属、塑料、木材、水泥、复合材料等,形状为 长方体或正方体,顶面设有一个可调节大小的通气孔培养基发酵4小时候后,将种蝇放在 培养箱内产卵,并控制培养箱内氨气浓度在50 200ppm,一氧化碳浓度小于30ppm,氧气浓 度20 50ppm,二氧化碳浓度3000 6000ppm,培养大概6个小时左右,卵开始孵化接着把通气孔孔径减小,增加氨气浓度至500 lOOOppm,一氧化碳浓度降低小于 lOppm,继续培养100小时,得到幼虫整个过程中,不再加入新鲜的培养基,当气体浓度超 出上述范围,则将通气孔增大,调整到上述范围内实施例3后处理首先把收集的蝇幼虫活体放置在60目尼龙筛网制成的无盖网箱内,用清水冲洗 30分钟冲洗一次,连续冲洗四次以上,此方法能将幼虫体内的污物彻底清洗干净,真空冷冻 干燥至含水量10%以下取出存放于密封容器内,在1 4°C的环境下保存即可将冻干物粉碎至80目,以水为溶媒,按粉碎物与水1 10的重量比混合,在温度 10°C下浸泡35小时,取出后用离心机分离,离心转速为1000转/min,离心时间为10分钟, 取上清液,在_35°C以下,低温冷冻干燥成含水量小于8%,得到的为结晶状产物,大致占幼虫总重量的25 观%实施例4分离纯化蛋白质将结晶状产物复溶于水配置成重量百分比浓度为50%的溶液,利用分子超滤系统 (法国militon生产)进行超滤,超滤系统参数设置分子筛选范围8000 80000DK ;压差 为2个大气压;流速500ml/小时;将分子量低于8000DK的小分子物质去除,收集截留物溶 于水,-45 °C真空干燥实施例5定性定量(1)取适量实施例4的冻干物样品,加入裂解液(8M Urea, 1 OmMDTT, 150mM Tris) 约lml,超声(80W)裂解,全过程在冰上完成离心,12,000g,45分钟,取上清(2)取上清液使用Bio-fcid protein assay reagent定量,分装成IOug每管,置于 500ul离心管中,低温保存(-800C )(3)电泳上样 20ug,SDS-PAGE 为 12. 5% 的胶(15mA/ 胶 30min,30mA/ 胶至溴酚蓝 离胶下沿0. 5cm)(4)染色考染,分析泳道内条带的光密度扫描值,计算各条带中蛋白质的含量(5)在胶上切下蛋白点,加入8μ 1 IOng/μ 1胰蛋白酶(Trypsin,Roche,美国) 进行胶内消化,然后置于4°C冰箱放置40min使胶片完全吸收酶液,再补加10 μ 1 25mM碳 酸氢铵缓冲液(pH 8.0),于37°C温育12h,胶内蛋白质被酶解成肽段混合物在上述肽段 混合物中加入30-50 μ 1 5% TFA(Merk公司,德国)于40°C提取上述酶切肽段1小时一 次,再用相同体积的50% CAN和2. 5% TFA(Merk公司,德国)溶液于30°C提取1小时一 次,最后用25μ1 CAN(Fischer公司,美国)超声提取一次,合并3次提取液真空干燥, 然后用4μ 1 0. 5%三氟乙酸溶解,将0. 6μ 1溶解物用基质辅助激光解吸离子化飞行质谱 (MALDI-T0F-MS)分析,获得肽质量指纹(P印tide Mass Fingerprint,PMF)图谱,比对得到 每个蛋白的序列、相对分子质量,具体如下表所示
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专利名称:一种抗肿瘤组合物及其制备方法大头金蝇(Chrysomyia megacephala),别名红头苍蝇,是节肢动物门有颚亚门昆 虫纲有翅亚纲双翅目丽蝇科金蝇亚科昆虫的一种。它食物转化率高,生长速度快,繁殖力 高,产卵期长,其虫体的蛋白质含量高,饲养条件和养殖设备相对简单,有利于大规模生产。大头金蝇是一种完全变态的昆虫,生活史包括卵一幼虫一蛹一成蝇4个阶段。大 头金蝇卵为淡黄色,呈香蕉型,长度约一毫米,一克卵大约有7000粒。幼虫呈锥形,前端尖, 后端钝圆,有明显的体节,体长为13 16毫米,一克幼虫约有15条,在适宜的温度环境下, 成熟幼虫1 2天就可以成蛹,蛹经过5天左右,即可羽化出成虫。成虫体长8 11毫米, 金属绿色,身被灰色,复眼红色。CN101032525A公开了 一种从蝇蛆提取分离具有体外抗肿瘤作用的有效组分,该组 份从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得,具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺 癌A549细胞增殖生长的作用,当受试物浓度为250MG/ML时,外源物质诱导的蝇蛆干粉及其 不饱和脂肪酸体外抑制人原髓细胞白血病HL-60增殖生长的效果分别为25. 5 %与96. 2 %, 抑制人肺腺癌A549细胞增殖生长的效果分别为沈.8%与97.0%。该组合物制备方法复杂, 疗效欠佳。
本发明提供了一种抗肿瘤组合物,该组合物对种肿瘤细胞均有抑制活性。一种抗肿瘤组合物,由氨基酸序在NCBI数据库中登录号分别为Gi2148169、Gi 114236、Gi 2148173、Gi 8101742、Gi 2148175、Gi 157674463、Gi 4533081 的蛋白 a、蛋白 b、蛋白C、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g组成。优选的,所述的抗肿瘤组合物重量百分组成为蛋白a 25 30%、蛋白b 35 40%、蛋白c 5 10%、蛋白d 1 5%、蛋白e 25 30%、蛋白Π 5%、蛋白g 1 5%。更优选的,所述的抗肿瘤组合物重量百分组成为蛋白a 25 观%、蛋白b 35 38%、蛋白c 5 8%、蛋白d 1 3%、蛋白e 25 27%、蛋白Π 2%、蛋白g 1 3%。最优选的,所述的抗肿瘤组合物重量百分组成为蛋白a 26.84 %、蛋白b 36. 22%、蛋白 c 5. 25%、蛋白 d 2. 85%、蛋白 e 25. 77%、蛋白 Π. 97%、蛋白 g 1. 1%。本发明还提供了一种上述抗肿瘤组合物的制备方法,包括(1)将大头金蝇消毒后驯化2代以上,得到种蝇;(2)培养基置于培养箱内发酵3 5小时后将种蝇放入培养箱内产卵,控制培养箱 内氨气浓度为50 200ppm,卵孵化后,控制培养箱内温度为沈 35°C,氨气浓度为500 lOOOppm,继续培养M 120小时;(3)将幼虫清洗干净后,冷冻干燥、粉碎,将粉碎物浸入1 15°C的水中30 40小时,10000转/分下离心10分钟,取上清液并进行超滤,去除分子量小于8000KD的组分, 即为成品。优选的,卵孵化前,培养箱内一氧化碳浓度小于30ppm,氧气浓度20 50ppm,二氧 化碳浓度3000 6000ppm。卵孵化后,培养箱内一氧化碳浓度小于lOppm,让幼蝇生长更好。所述的培养基为青蛙肉、家禽肉、家畜肉、家畜内脏和淡水鱼肉中的一种或多种, 这些基料易获得,成本低廉。所述培养基可以选用以下几种配方(1)10 60%的淡水鱼肉、20 70%猪内脏和10 50%的青蛙肉;(2)30 70%的猪内脏和30 70%的青蛙肉;(3) 10 50%的猪肉和10 50%淡水鱼肉及10 50%鸡肉;(4)20 60%的牛肉和30 70%青蛙肉;(5)30 70%的羊肉、10 50%淡水鱼肉及20 60%猪内脏。本发明组合物对多种癌细胞均有抑制作用,制备方法简单,具有较好的市场化前旦ο
本发明公开了一种抗肿瘤组合物及其制备方法,该组合物由氨基酸序在NCBI数据库中登录号分别为Gi 2148169、Gi 114236、Gi 2148173、Gi8101742、Gi 2148175、Gi 157674463、Gi 4533081的蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、蛋白e、蛋白f、蛋白g组成。本发明组合物对多种癌细胞均有抑制作用,制备方法简单,具有较好的市场化前景。



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