端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用制作方法

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一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用制作方法

专利名称

一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用制作方法
发明者

王国杰, 赵敏, 杨领叶, 张瑞辰
公开日

2013年4月3日
申请日期

2012年7月16日
优先权日

2012年7月16日
申请人

北京科技大学
文档编号

C12Q1/68GK103012639SQ201210245819
关键字

基为阳离水溶性基团荧光
权利要求

1.一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质的制备方法，所述的方法步骤包括 (1)合成原子转移自由基聚合引发剂的溴代反应将芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反应容器中，冰水浴中冷却到0-5摄氏度；逐滴加入1-2当量的2-溴-异丁酰溴和四氢呋喃的混合溶液，在室温下回流反应8个小时；反应完成后，两次抽滤掉不溶物溴胺盐，旋蒸除去大部分的四氢呋喃溶剂，剩余物质用二氯甲烷稀释，并用饱和碳酸钾溶液萃取，有机相通过无水硫酸镁干燥过滤后旋蒸得到粗产物，用无水甲醇重结晶，真空干燥得淡黄色固体； (2)采用原子转移自由基聚合制备端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯将步骤(I)中得到的原子转移自由基聚合引发剂置于四氢呋喃溶剂中；再加入催化齐U，配位剂，聚合单体，在70摄氏度下进行原子转移自由基聚合1. 5小时，用中性氧化铝柱层析提纯，旋蒸除去溶剂，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固体； (3)端基为荧光基团芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯的季铵盐反应将步骤(2)中得到的端基为芘荧光基团的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶剂中，逐滴加入6当量的季胺化小分子,在85摄氏度下回流反应24个小时；用四氢呋喃沉淀出产物，并索氏提取12个小时，四氢呋喃作提取剂，真空干燥得白色固体2.按照权利要求1所述端基为芘荧光基团的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，所用的聚合单体为丙烯酸芘甲酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它们的任意混合物3.按照权利要求1所述端基为芘荧光基团的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，聚合所用的催化剂为氯化亚铜、溴化亚铜或是碘化亚铜；所用的配位剂为1，1,4, 7，10，10-六甲基三亚乙基四胺或是N，N，N，N，N-五甲基二亚乙基三胺4.按照权利要求1所述端基为芘荧光基团的新型水溶性阳离子聚电解质的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，所用的季胺化小分子为卤代烷烃包括溴代丁烷、碘甲烷5.根据权利要求1所述方法制备的一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质，其结构通式如下6.利用权利要求5所述的端基为芘荧光基团的新型水溶性阳离子聚电解质的特异性识别核酸分子碱基序列结构的应用方法，所述方法步骤如下 (I)用磷酸盐缓冲溶液将端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质配置成ιοΛιο /L的稀溶液； (2)将冷冻储存的不同种类的DNA引物离心后溶解在适量磷酸盐缓冲溶液配置成DNA稀溶液所述的DNA引物种类及碱基序列如下 DNAl—发夹结构 DNAO^CA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)； DNA2—与 DNA I 互补的直链 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNA3—与 DNA 2 互补的直链 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNAa—碱基全是 A 的直链 DNA (AAA AAA AAA AAA AAA AAA)； DNAc—碱基全是 C 的直链 DNA (CCC CCC CCC CCC CCC CCC)； DNAt—碱基全是 T 的直链 DNA (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)； (3)取适量聚电解质溶液、适量不同类型的DNA引物溶液和磷酸盐缓冲液混配成样品溶液所述的样品溶液可分为两个系列系列a (聚电解质和发夹结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA1、聚电解质+DNA1+DNA2、聚电解质+DNAI+DNAa、聚电解质+DNAI+DNAc和聚电解质+DNAI+DNAt样品溶液；系列b (聚电解质和直链结构DNA)聚电解质、聚电解质+DNA2、聚电解质+DNA2+DNA3、聚电解质+DNA2+DNAa、聚电解质+DNA2+DNAc和聚电解质+DNA2+DNAt样品溶液； (4)对样品溶液进行加热处理80摄氏度下加热10分钟后自然冷却到室温，测定样品溶液的荧光发射光谱根据荧光强度变化来识别靶向DNA的碱基序列其中所用到的狭缝宽度是2. 5nm，激发波长是344nm ； (5)将DNAl和DNA2互补的DNA双链溶液1、DNA2和DNA3互补的DNA双链溶液2和聚电解质分别与DNAl和DNA2互补的DNA双链及DNA2和DNA3互补的DNA双链混配得到混合溶液3和4进行如步骤(4)所属的加热处理，然后测定4种溶液的圆二色谱； (6)向步骤(3)混配得到的系列a和系列b样品溶液中分别加入适量碘化钾溶液，并在波长为344nm的光激发下，测得各混合溶液的荧光发射光谱，得到不同样品溶液的荧光淬灭效率
技术领域

本发明涉及一种荧光高分子聚合物及其制备方法，尤其涉及一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及制备方法，并通过与DNA相互作用后的荧光性能变化实现对核酸分子碱基序列结构的高效、稳定、特异性识别，属于功能高分子，材料及荧光传感等技术领域
背景技术

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权力要求
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法律状态

专利名称：一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及其制备方法及应用的制作方法核酸分子碱基序列的定量分析和特异识别对生物医学领域的发展具有重要意义。核酸的检测方法多种多样，其中，荧光检测系统因其选择性好、灵敏度高而被广泛应用。特别是荧光高分子在检测生物大分子方面的研究已引起国内外科学工作者的密切关注。芘由于能通过多种方式进行化学修饰，荧光量子产率较高以及其荧光强度受环境因素如溶剂，核酸碱基等影响较大而被广泛应用到核酸检测中。荧光基团芘以共价键连接的核酸分子探针由于其在与碱基序列互补的核酸分子杂化形成复链后荧光性能发生改变而被用于荧光探针特异性识别核酸分子。同时它也能克服一些小分子荧光染料如吖啶、菲啶类染料和菁类染料对核酸分子的序列不能特异识别的不足。比利时鲁汶大学研究人员设计合成了一类新型荧光探针，芘修饰的以HNA、RNA和DNA为骨架的寡核苷酸荧光探针，探针分子与靶向分子杂化后，芘的单体态荧光(380nm)大大增强而激基复合物荧光(480nm)消失 (ChemBioChem. 2009, 10, 1175-1185)。美国Hrdlicka教授等研发的芘修饰的寡核苷酸荧光探针，可通过杂化诱导荧光增强和特异性鸟苷酸荧光淬灭机制有效地来识别单核苷酸多态性(Chem. Commun. 2010, 46，4929-4931)。日本 Yamana 等合成了一种芘修饰的 RNA 和 DNA 荧光探针，发现RNA探针在与靶向RNA杂化后荧光大大增强，而DNA荧光探针在与靶向DNA杂化后荧光并未有明显的变化(Nucleic Acids Res. 2005，33，5887-5895)。还有一类发夹式荧光探针，其分子具有发夹结构，荧光功能基团A和B位于探针分子的两端，即发夹结构分子的茎部。美国佛罗里达大学的Tan等对发夹式分子信标检测DNA/RNA核酸分子进行了广泛深入研究。但是这些标记型荧光探针需要将荧光基团通过共价键连结到寡聚核酸分子链上以实现特异性识别核酸分子，其中的合成与操作较繁杂，花费较高。近年来，共轭聚电解质作为荧光探针检测蛋白质、核酸等生物大分子的研究倍受青睐。这种共轭聚电解质可与生物大分子形成静电组装体，通过荧光共振能量转移或电子转移等机制使其荧光性能改变，进而对生物大分子进行检测。加州大学的Bazan教授，中国科学院化学研究所，中国科学院长春应用化学研究所的研究人员对共轭聚电解质荧光检测生物大分子进行了深入研究，取得了重要科研成果。Bazan等利用碱基序列互补的DNA核酸分子与固定在基片上的电中性肽核酸靶向杂化形成复链，阳离子共轭聚电解质通过静电吸附连结到核酸复链，从而使基片显示共轭聚电解质的荧光(Chem. Commun. 2004，2508-2509)。这种技术为无标记荧光探针特异性识别核酸分子开辟了新的研究方向。但这项技术的制备较复杂，且被固定的肽核酸是单分子膜，会限制杂化复链吸附荧光聚电解质的数量，从而使检测的荧光强度受限
本发明的目的在于提供一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质，其结构通式如下本发明涉及一种荧光高分子聚合物及其制备方法，尤其涉及一种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质及制备方法，并应用于检测核酸分子碱基序列。这种端基为荧光基团芘的水溶性阳离子聚电解质和单链寡聚核酸分子(发夹结构DNA和直链结构DNA)之间的静电吸附和疏水作用使其形成一个新型复链荧光探针。当遇到与之碱基序列结构互补的核酸分子时，通过Watson-Crick碱基配对原则杂化，由于端基荧光基团芘插入DNA双螺旋结构中，使得碱基对芘荧光的淬灭能力增强，导致其荧光强度相比于与非靶向核酸分子作用显著降低；从而通过芘荧光聚电解质的荧光性能差异实现对核酸分子碱基序列结构的特异性识别。

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