专利名称：用于治疗精神分裂症和双相型障碍的组织激肽释放酶的制作方法精神分裂症是使人衰弱的精神疾病，其总共影响世界人口的大约(Lang et al，Cell Physiol Biochem. ,2007,20 :687_702)。这种复杂的慢性脑疾病表现出很多症状， 所述症状被归类为阳性、阴性或认知损伤类型，并且在青春期或者成年早期出现。研发来治疗精神分裂症的第一种药物——被称作典型抗精神病药——是高亲和性多巴胺D2受体拮抗剂，其防止过高水平的多巴胺，多巴胺通常被认为是形成所述疾病的精神病阳性症状的主要原因。该类药物最终不再受人欢迎，原因是它们普遍的不良副作用 (嗜睡、倦睡和锥体束外症状，如迟发性运动障碍)，其导致不依从和精神病复发的可能性增大(Lieberman et al, Am JPsychiatiy, 2003,160 1396-1404) ； (Asher-Svanum et al, BMC Psychiatry,2006,6 8) ； (Lieberman et al, NEngl J Med.，2005，353 1209-23)。非典型抗精神病药被设计为通过减少对多巴胺D2受体的亲和性或者增加对5-羟色胺受体靶向的亲和性而减少副作用。这类药物表现出锥体束外症状副作用减少，但其缺点是有其他副作用，包括体重增加和糖尿病发作(Leiberman et al.，2005)。此外，非典型抗精神病药不能充分地减轻阴性和认知损伤症状(Leiberman et al.，2005)。精神分裂症的另一种治疗方法是使用情绪稳定剂，例如锂。情绪稳定剂治疗所述疾病的躁狂(阳性症状)和抑郁(阴性症状)。然而，锂必须是以几乎对身体有毒的剂量使用。因此，需要持续监测以防止能够致命的肾毒性、脱水、抽搐和震颤。此外，锂还有常见的不良副作用，例如麻木、眩晕感和倦睡。一篇广泛的综述表明单独的锂治疗对精神分裂没有作用(Leucht et al. , Cochrane Database Syst Rev.，20073 :CD001258)。双相型障碍(BP)被认为影响美国2. 6 %的人口(Muzina et al.，Ann Clin Psychiatry 2007,19(4) :305_12)。然而，因为缺乏一致性的诊断，受该疾病影响的实际人数可能更高。双相型障碍的特征是一段时期的抑郁和一段时期的躁狂，两者都极大地干扰日常生活。双相型障碍能被分为两类(I型双相型障碍和II型双相型障碍)，这两类都有抑郁和躁狂的症状。躁狂被定义为思绪飞快、语言急速、活力水平升高和激动不安以及高涨的自负感，而抑郁阶段包括自我认同缺乏、孤独、悲伤、挫败感，并且可能包括自杀想法。这种使人衰弱的病症需要医疗介入，通常包括使用控制所述症状的药物。3常见的治疗包括情绪稳定剂、抗躁狂剂、抗惊厥剂和抗癫痫剂，它们可包括，例如锂、氯丙嗪、氨基苯基吡啶酮、阿立哌唑(aripiprazole)、奥兰扎平(olanzapine)和氟西汀(fluoxetine)。如前所述，这些药物有一些不良副作用。特别是已知锂能够引起恶心、 呕吐、震颤和腹泻。在躁狂期治疗时经常需要住院治疗(Muzina Prim Care 2007，34 (3) 521-50)。目前可用于精神分裂症和双相型障碍的治疗远不足以令人满意。不良副作用和不能充分减轻症状的问题仍然存在，因此，需要更好的治疗方法(Javitt et al. , Biol Psychiatry. 1999,45 :668_679)。对精神分裂症的进一步研究已经揭示在其起因下的其他机制。不适当的谷氨酰胺信号传递是一个关键因子，而非多巴胺，现在多巴胺被认为是不适当谷氨酰胺信号传递的结果(Buchanan et al.，Schizophr Bull,2007,33 1120-1130)； (Depoortere et al, NearopsvchopharmacoloRY, 2005, 30 1963-1985)。在动物模型中使用苯环己哌啶(phencyclidine，PCP)，一种N-甲基D-天冬氨酸 (NMDA)受体(NMDAR)拮抗剂，可通过防止谷氨酰胺与脑细胞中NMDA受体的NR2部分的结合再现精神分裂症的所有症状(阳性、阴性和认知损伤MJavitt et al.，1999)。犬尿喹啉酸(kynurenic acid)(天然存在的NMDA受体拮抗剂)被发现在患有精神分裂症的人中水平异常高，并且与记忆问题有关(Chess et al.，Schizophr Bull，2007，33 :797_804)。此夕卜，高达80%的系统性红斑狼疮患者患有与抗-DNA抗体(与脑中NMDA受体的NR2部分交叉反应)引起的精神分裂症类似的精神病和认知损伤。这种表现型可通过在动物模型中将人 SLE 抗 DNA 抗体转入脑而重现(DeGiorgio et al.，Nat Med.，2001，7 1189-93)。NMDA受体拮抗作用的分子分析显示在PI3K/Akt/GSK_3 β途径中Akt和 GSK-3 β 的磷酸化减少(Lei et al.，Neuropsychopharmacology, 2007, doi 10. 1038/ sj. npp. 1301511)。与正常个体相比，精神分裂症患者表现出Akt活性下降(Emamian et al. ,Nat Med.，2004，36 131-137)，这样它对GSK-3 β的抑制性调节可能受损。GSK-3 β是导致神经元变性和凋亡的一种丝氨酸_苏氨酸激酶，其可导致神经元突触连接性和体积的丧失。在精神分裂症中，这造成相关的阴性和认知损伤症状(Benitez-King et al. ,Curr. Drug Targets CNS Neurol Disord.，2004，3 :515_33)。值得注意的是，诱发暂时性幻觉阳性样症状的精神活性药物破坏神经元细胞骨架(变性)(Benitez-King et al.，2004)，而 β-联蛋白(P-cateninM—种受GSK_3i3活性抑制的转录因子)的过表达引起类似于锂治疗的情绪稳定(Gould etal.，NeuropsvchopharmacoloRY, 2007，32 :2173_83)。Rowe等证明当给予锂以治疗双相型障碍时锂调节GSK-3 (Rowe etal.，Neurosci Biobehav Rev. 2007,31(6) :920_31)。这表明锂可有效治疗双相型障碍以及由GSK(P13K/ Akt/GSK-3i3)调节途径机能障碍引起的其他病症。其他分子分析表明神经营养蛋白(neurotrophin)例如神经生长因子(NGF)的水平在精神分裂症患者中下降。成熟的神经营养蛋白通常通过与它们合适的Trk受体结合 (这还引起它们表达增加)而活化所述PI3K/Akt/GSK-3i3途径。神经营养蛋白因它们提供神经保护、诱导轴突生长和关联的突触连接性以及神经发生的能力而闻名。本文公开的治疗方法将解决在目前治疗精神分裂症和双相型障碍的方法中没有发现的所述疾病的多种症状。图1-3显示被认为引起精神分裂症和双相型障碍的生物化学途径和KLKl的可能作用路径的简图形式。
本发明包括治疗受P13K/Akt/GSK_3i3途径影响的精神疾病的方法，包括给予组织激肽释放酶(KLKl)，其变体或活性片段。精神疾病可以是精神分裂症、精神分裂症谱系的相关病症或双相型障碍。本发明的一个方面提供治疗精神分裂症和相关病症的症状的方法，包括给予组织激肽酶、其变体或活性片段。另一方面，精神分裂症的症状可以是阳性症状、阴性症状或认知症状。阳性症状可以包括但不限于妄想、幻觉和紧张症行为。阴性症状可以包括但不限于缺乏情感、不喜爱活动、低能量、对生活缺乏兴趣、失语症、不适当的社交技能、不能交朋友和与世隔绝。认知症状包括但不限于注意力/信息处理、感觉门控、问题解决、处理速度、 语言和视觉的学习和记忆以及工作记忆的损伤。在另一个方面，本发明包括治疗双相型障碍或者精神分裂症第一次发作的前驱期或复发时的方法，包括给予KLKl或其变体或活性片段。本发明的一个实施方案包括治疗双相型障碍的症状，包括给予KLKl或其变体或活性片段。双相型障碍的一个症状可以是连续情绪混乱，其包括抑郁和躁狂两个时期。在另一个方面，本发明包括通过给予KLKl或其变体或活性片段来增加对脑细胞的神经保护的方法。神经保护可以包括但不限于神经营养蛋白(例如NGF)的增加和/或 GSK-3 β活性的下降。在另一个方面，本发明包括通过给予KLKl或其变体或活性片段来防止脑中细胞凋亡的方法。防止凋亡的方法包括但不限于增加例如NGF的神经营养蛋白和/或降低 GSK-3 β 活性。在另一个方面，本发明提供通过给予KLKl或其变体或活性片段来防止脑中的神经变性。防止神经变性的方法包括但不限于增加例如NGF的神经营养蛋白和/或降低 GSK-3 β 活性。在本发明的另一个方面，可口服给予KLKl或其变体或活性片段。口服给药可以是经肠给药。口服制剂可以是液体、丸剂、溶液剂、片剂、缓释胶囊、肠溶衣胶囊或糖浆。口服治疗剂量可以是范围为每天约1至约1000国际单位(IU)的最大剂量。在本发明的另一个方面，KLKl或其变体或活性片段能够鼻内给药。用于鼻内给药的制剂可以是软膏剂、膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂和油剂等。鼻治疗剂量是每天约1至约5000IU的最大剂量。本发明的另一个方面包括如本文所述的治疗和预防方法，还包括同时给予可用于治疗精神分裂症或双相型障碍的治疗性化合物。可用于治疗精神分裂症和/或双相型障碍的治疗性化合物包括但不限于典型和非典型抗精神病药以及例如锂和丙戊酸的情绪稳定剂。本发明的另一方面包括为口服给药配制的药物组合物，包含约1至1000IU的KLKl 或其变体或活性片段，还可选地包含可药用赋形剂，并且还可选地包含如上所述的其他治疗性化合物。本发明的另一个方面包括为鼻内给药配制的药物组合物，包含约1至约5000IU的 KLKl或其变体或活性片段，可选地包含可药用赋形剂。

组织激肽释放酶多肽具有以下序列NP 001001911 GI :50054435 野猪(Sus scrofa)1-17 信号肽18-24 前肽25-263 成熟肽>gi I 50054435 | ref | NP_001001911. 11 组织激肽释放酶 1 [野猪]MWSLVMRLALSLAGTGAAPPIQSRIIGGRECEKDSHPWQVAIYHYSSFQCGGVLVDPKWVLTAAHCKNDNYQVWLGRHNLFENEVTAQFFGVTADFPHPGFNLSLLKNHTKADGKDYSHDLMLLRLQSPAKITDAVKVLELPTQEPELGSTCQASGWGSIEPGPDDFEFPDEIQCVELTLLQNTFCADAHPDKVTESMLCAGYLPGGKDICMGDSGGPLICNGMWQGITSWGHTPCGSANKPSIYTKLIFYLDWINDTITENP(SEQ ID NO 1)另一个实施方案包括NP_002248 GI 4504875 人(Homo sapiens)1-18 信号肽19-24 前肽25-262 成熟肽>gi I 4504875 | ref | NP_002248. 11 组织激肽释放酶 1 前蛋白原[人]MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGF匪SLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCV⑶SGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ ID NO 2)术语“活性片段”是指保留有全长KLKl多肽活性的KLKl多肽的较小部分。
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初始或参考多肽的“变体”或“突变体”是具有以下性质的多肽1)其氨基酸序列不同于所述初始或参考多肽的氨基酸序列，并且2)其是通过天然或人工(人为的)突变从所述初始或参考多肽衍生而来的。这样的变体包括它的氨基酸缺失、插入、取代或它们的结合。本文中变体氨基酸是指与初始或参考多肽序列(例如源抗体或抗原结合片段的序列)的相应位置上的氨基酸不同的氨基酸。可以制造缺失、插入和取代的任何结合来实现最终的变体或突变体构建体，条件是所述最终的构建体具有所需要的功能特点。所述氨基酸变化还可以改变所述多肽的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量和位置。美国专利 No. 5，534，615描述了产生多肽的氨基酸序列变体的方法，其以引用的方式明确地纳入本文。“野生型”或“参考”序列或者“野生型”或“参考”蛋白质/多肽的序列可以是通过引入突变而从中衍生出变体多肽的参考序列。总之，给定蛋白质的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是自然界中最常见的基因的序列。可通过天然方法或通过人工诱导方法将突变引入“野生型”基因(从而引入其编码的蛋白质)。这样的方法的产物是初始“野生型”蛋白质或基因的“变体”或“突变体”。对于本文中指出的多肽，“氨基酸序列同一性百分比(%)”被定义为在比对候选序列和参考序列并——如果必要的话——引入空位以实现最大序列同一性百分比后，并且不将任何保守取代考虑为序列同一性的一部分的情况下，所述候选序列中与参考序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可通过本领域技术中的各种方法来实现以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对，所述方法例如，使用公众可获得的计算机软件，如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定度量比对的合适参数，包括在被比对序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。ALIGN-2程序可通过加利福尼亚南圣弗朗西斯科的Genentech公司公开获得。 对于本文目的，给定氨基酸序列A对于、与或相对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其还能够被表述为对于、与或相对给定氨基酸序列B具有或包括一定％氨基酸同一性的给定氨基酸序列A)计算如下100X 分数 X/Y，其中X是在A和B的程序比对中由序列比对程序计为相同匹配的氨基酸残基的数目，Y是B中氨基酸残基的总数。应理解当氨基酸序列A的氨基酸长度不等于氨基酸序列B 的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。“核酸序列同一性百分比(％ ) ”被定义为在比对候选序列和参考多肽编码核酸序列并——如果必要的话——引入空位以实现最大序列同一性百分比后，所述候选序列中与参考多肽编码核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。可通过本领域技术中的各种方法来实现以确定核酸序列同一性百分比为目的的比对，所述方法例如，使用公众可获得的计算机软件，如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign (DNASTAR)软件。可通过已知方法确定度量比对的合适参数，包括在被比对序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。对于本文目的，给定核酸序列C对于、与或相对给定核酸序列D的％核酸序列同一性(其还能够被表述为对于、与或相对给定核酸序列D具有或包括一定％核酸同一性的给定核酸序列C)计算如下
IOOX 分数 W/Z，其中W是在C和D的程序比对中由序列比对程序计为相同匹配的核苷酸的数目， 并且其中Z是D中核苷酸的总数。应理解当核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度时，C对D的核酸序列同一性％会不等于与D对C的核酸序列同一性％。在本领域中，“同源序列”，例如与已知序列具有80%同一性的序列，具有与所述已知序列相似的功能是很常见的。术语“氨基酸”以其最广义含义使用，意欲包括天然存在的La _氨基酸或残基。本文使用常用的天然存在氨基酸的单字母和三字母缩写(Lehninger，A.L. , Biochemistry, 2d ed.，pp. 71-92，(1975)，WorthPublishers, New York)。所述术语还包括所有 D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物，天然存在的但通常不被纳入蛋白质的氨基酸，例如正亮氨酸，以及具有本领域已知为氨基酸所特有性质的化学合成化合物。例如，氨基酸的定义中包括可使肽化合物具有与天然苯丙氨酸或脯氨酸相同构象限制的Phe或Pro类似物或模拟物。这样的类似物或模拟物在本文中被称为氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他实例由 Roberts 禾口 Vellaccio 在The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, Eds.，Vol. 5 ρ 341，Academic Press, Inc, N. Y. 1983 中列出，其以引用方式纳入本文。术语“蛋白质”具有比肽长的氨基酸序列。“肽”包含2至约50个氨基酸残基。术语“多肽”包括蛋白质和肽。蛋白质的实例包括但不限于抗体、酶、凝集素和受体；脂蛋白和脂多肽；以及糖蛋白和糖多肽。“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中每个部分是具有不同特性的多肽。特性可以是生物学特性，例如在体外或在体内的活性。特性还可以是简单的化学或物理特性，例如与目的抗原的结合，对反应的催化等。所述两个部分可通过单个肽键直接连接或者通过包含一个或多个氨基酸残基的肽连接物连接。所述两个部分和所述连接物一般会互相处于阅读框中。所述融合多肽的两个部分优选来自异源或不同的多肽。 术语“治疗有效量”是指能够有效“减轻”或“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或障碍的组合物的量。总的来说，减轻或治疗疾病或障碍涉及减少与所述疾病或障碍相关的一个或多个症状或医学问题。在一个实施方案中，“治疗有效量”是治疗精神分裂症和精神分裂症相关的症状、精神分裂症第一次发作的前驱期、复发、精神分裂症谱系的相关病症和双相型障碍的量。术语“治疗”是指抑制、减轻和治愈疾病和病症或其症状。“治疗”是指治疗性治疗和预后性或预防性措施，其中目的是预防或者减缓(减少)目的病理病症或障碍。治疗包括对患有精神分裂症或双相型障碍的患者给予KLKl或其变体或活性片段，包括“治疗有效量”，所述“治疗有效量”包括预后性的量(例如，足以减轻或治愈上述疾病或其症状的量)。 可通过精神病学评估来评价所述疾病的成功治疗和改善。术语“预防(防止)”是指预后(prophylaxis)，即使得疾病、疾病病症、疾病病理和/或疾病症状不发生。可通过给予治疗有效量KLKl或其变体或活性片段来预防精神分裂症和双相型障碍。本文使用的“治疗有效量”包括预后量(例如，有效预防上述疾病或其症状的量)。可通过精神病学评估来评价对所述疾病的成功治疗和改善。
术语“精神分裂症”是指一种慢性心理/精神障碍，其特征是精神病(与现实失去联系)、幻觉(错误感知)、妄想(错误信念)、紊乱的语言和行为、感受平淡(情绪范围受限)、认知缺陷(理解和解决问题受损)以及职业和社交功能障碍。精神分裂症的症状可由专业医生基于病史、面谈、身体检查和实验测试来归类。本文使用的术语“精神分裂症” 包括所有的精神分裂症亚型，包括但不限于混乱型、紧张型、妄想型、残余型和未定型(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，2006)。与精神分裂症相关的障碍包括a)短暂精神障碍，b)妄想障碍和C)情感分裂性精神障石尋(schizoaffective disorder)。术语“双相型障碍”或“BP”或“躁狂抑郁病”是指一种慢性心理/情绪疾病，其特征是有显著的情绪变化，包括抑郁期和兴奋躁狂期。BP由专业医生基于个人或病史、面谈和身体检查来诊断。术语“躁狂”或“躁狂期”是指个体表现出以下部分或全部特征的时期思绪飞快、 语言急速、活力水平升高和激动不安以及高涨的自负感、兴奋、判断力差、失眠、注意力受损和侵略性。术语“抑郁”是指个体情绪低落的时期，所述情绪低落是指产生包括但不限于悲伤和沮丧感的精神状态，其能够引起破坏性行为。术语“第一次发作的前驱期”是指在完全发展的疾病中特征性表现可见之前的疾病的早期症状和迹象。在精神分裂和双相型障碍中，这代表潜隐精神失常期(period of prepsychotic disturbance)或者惯常行为失常的发作和显著精神病症状首次出现之间的间隔期。前驱期可以在精神分裂症患者或患有双相型障碍的个体的首次行为发作之前，或者是所述发作复发之前的时期。术语“精神分裂症复发”是指以前患过精神分裂症的健康个体的症状退化至他们患有精神分裂症时的状态，这由精神科医生诊断。术语“双相型障碍复发”是指以前患过双相型障碍的健康个体的症状退化至他们患有双相型障碍时的状态，这由精神科医生诊断。术语“增加神经保护”或“增加的神经保护”是指抑制神经元损伤和死亡。术语“同时给药”和“同时给予”是指混合地给予KLKl和治疗性化合物。例如，药物组合物可以是相继、同时或在不同的时间给予的各自的化合物或各自的药物组合物。优选同时给予KLKl和治疗性化合物。术语“其他治疗性化合物”是指KLKl或其变体或片段以外的用于治疗精神分裂症或双相型障碍的治疗剂。用于治疗精神分裂症或双相型障碍的其他治疗性化合物包括但不限于典型和非典型抗精神病药和情绪稳定剂，例如锂和丙戊酸。术语“精神分裂症谱系”是指密切相关的精神病病症，其通常共有多种症状，但严重程度不一，从轻微到严重。精神分裂样人格障碍在所述谱系中属于轻度，精神分裂型人格属于中度，而精神分裂症在所述谱系中属于重度。在整个谱系中存在的常见症状和认知损伤可归因于共有的遗传和环境事件，其导致与正常个体相比暂时性的异常脑构造。所述谱系的较严重情况，慢性精神分裂症，表现出脑构造的额外异常，例如额叶缺陷，其可造成更严重的症状，而所述谱系的较轻微情况，精神分裂样人格障碍，没有这样的额外异常并且有可能更好地补偿所述暂时性缺陷，因此症状较轻微。
术语“阳性症状”是指但不限于妄想、幻觉、思维紊乱和紧张症运动行为 (catatonic motor behavior)0术语“阴性症状”是指但不限于缺乏情感、不喜爱活动、精力少、对生活缺乏兴趣、 失语症、avolition、不适当的社交技能、不能交朋友和与世隔绝。术语“认知症状”是指但不限于注意力/信息处理、感觉门控、问题解决、处理速度、语言和视觉学习以及记忆和工作记忆的能力。治疗精神分裂症和双相型障碍的方法本发明提供用于治疗精神分裂症、精神分裂症谱系的相关病症和双相型障碍的方法。一个实施方案包括通过将组织激肽释放酶或其变体或活性片段给予哺乳动物以治疗所述哺乳动物的精神分裂症、精神分裂症谱系的相关病症或双相型障碍的方法。可口服或鼻内给药。精神分裂症、精神分裂症谱系的相关病症或双相型障碍的病理学包括脑细胞和其他神经组织的凋亡。给予KLKl会提供神经保护，S卩，KLKl会抑制脑细胞的凋亡。KLKl活化缓激肽B2受体，致使PI!3K/Akt/GSK-3i3途径的活化。Akt的这种活化防止凋亡，并且藉此产生神经保护效应。KLKl引起的缓激肽B2受体的活化还活化对GSK-3i3的调节性抑制。 该过程在图2中以图示方式显示。此外，对GSK-3i3的抑制会防止/抑制β-联蛋白磷酸化，其之后防止/抑制遍在蛋白依赖的联蛋白降解。联蛋白的活性能够改善由给予锂实现的情绪稳定能力。该过程在图1中以图示方式显示。与锂同时给予KLKl或其变体或活性片段进一步改善情绪稳定。KLKl或其变体或活性片段还能够与神经营养蛋白相互作用以产生免于凋亡和神经变性的神经保护，促进轴突生长并且提高神经元突触连接性。给予KLKl或其变体或活性片段能够修饰神经营养蛋白，例如NGF，以提供神经保护效应，从而治疗精神分裂症、精神分裂症的病症和双相型障碍。NGF的前体形式由KLKl切割进行翻译后修饰，成为成熟形式， 这样NGF之后就能够通过Trk A活化PI!3K/Akt/GSK-3 β途径。该过程在图3中以图示方式显示。NGF与Trk A结合致使Akt活化，该结合仅能在NGF被切割为其成熟形式时发生。 给予KLKl或其变体或活性片段还通过KLKl修饰神经营养蛋白而治疗精神分裂症、精神分裂症谱系病症和双相型障碍。药物组合物本发明的药物组合物包括可口服或鼻内给予的制剂。适于鼻内给药的制剂包括粉末剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、软膏剂、膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油剂等。 可通过常规方法将本发明的溶液剂或悬浮剂直接施用于鼻腔，所述常规方法例如使用点滴器、移液管或喷雾器。可以以单剂量或多剂量形式提供制剂。溶液剂可以是无菌、等渗或低渗的，或者适于通过注射或其他方式给药，并且可包含合适的佐剂、缓冲剂、防腐剂和盐。例如鼻滴剂的溶液剂可包含抗氧化剂、缓冲剂等。粉末或颗粒形式的药物组合物可与溶液结合，以及与稀释剂、分散剂和/或表面活性剂结合。用于气雾给药的制剂包括为鼻内给药设计的制剂。活性成分可提供于含有合适喷射剂的加压容器，所述喷射剂例如含氯氟烃(CFC)(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其他合适气体。气雾剂还可包含表面活性剂，例如卵磷脂。药物剂量可由计量阀控制。或者，活性成分可以以干粉的形式提供，例如，在合适的粉末基质中的所述化合物的粉末混合物，所述粉末基质例如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(例如羟丙甲基纤维素)和聚乙烯吡咯烷(PVP)。所述粉末载体可在鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式存在于例如胶囊或由诸如明胶制成的药包或者可借助吸入器从中给予所述粉末的吸塑包装。配制用于鼻内给药的药物组合物包含约1至约5000IU的KLKl或其变体或活性片段，可选地还包含可药用赋形剂。KLKl或其变体或活性片段的鼻内剂量可以是以下剂量 每天约1至约5000IU、每天约1至约4000IU、每天约1至约3000IU、每天约1至约2500IU、 每天约1至约2000IU、每天约1至约1000IU、每天约1至约750IU、每天约1至约500IU、每天约1至约400IU、每天约1至约300IU、每天约1至约250IU、每天约1至约200IU、每天约 1至约150IU、每天约1至约100IU、每天约1至约75IU、每天约1至约50IU、每天约1至约 50IU、每天约1至约25IU、每天约1至约20IU、每天约1至约15IU、每天约1至约10IU、每天约1至约5IU、每天约5至约1000IU、每天约10至约1000IU、每天约15至约1000IU、每天约20至约1000IU、每天约25至约1000IU、每天约50至约1000IU、每天约75至约1000IU、 每天约100至约1000IU、每天约150至约1000IU、每天约200至约1000IU、每天约250至约 1000IU、每天约300至约1000IU、每天约400至约1000IU、每天约500至约1000IU、每天约 750至约1000IU、每天约10至约100IU、每天约10至约250IU、每天约10至约500IU、每天约50至约250IU、每天约50至约500IU、每天约100至约250IU、每天约100至约500IU或每天约250至约750IU。适于口服给药的制剂包括液体剂、丸剂、溶液剂、片剂、缓释胶囊、肠溶衣胶囊或糖浆。配制用于口服给药的药物组合物包含约1至1000IU的KLKl或其变体或活性片段，可选地还包含可药用赋形剂。KLKl或其变体或活性片段的口服剂量可以是以下剂量每天约1 至约1000IU、每天1至约750IU、每天1至约500IU、每天1至约400IU、每天1至约300IU、 每天1至约250IU、每天1至约200IU、每天1至约150IU、每天1至约100IU、每天1至约 75IU、每天1至约50IU、每天1至约50IU、每天1至约25IU、每天1至约20IU、每天1至约 15IU、每天1至约10IU、每天1至约5IU、每天5至约1000IU、每天10至约1000IU、每天15 至约1000IU、每天20至约1000IU、每天25至约1000IU、每天50至约1000IU、每天75至约 1000IU、每天100至约1000IU、每天150至约1000IU、每天200至约1000IU、每天250至约 1000IU、每天300至约1000IU、每天400至约1000IU、每天500至约1000IU、每天750至约 1000IU、每天10至约100IU、每天10至约250IU、每天10至约500IU、每天50至约250IU、 每天50至约500IU、每天100至约250IU、每天100至约500IU或每天约250至约750IU。药物组合物的给药治疗脑疾患的常规给药方式包括口服以及静脉内给药途径。这些方式并不总是理想的。化合物的口服给药导致生物利用率有限(溶解性、第一轮肝脏降解、血脑屏障限制) 以及可能引起不利肠胃副作用的延时释放问题。但是，组织激肽释放酶(KLKl)似乎能够穿过并且可能绕过血脑屏障从而对脑起作用。静脉内(i.v.)给药需要受训医疗工作人员，这对于卫生保健系统是耗费时间并且昂贵的，它还可能引起患者顺应性问题。还存在与静内脉给药相关的风险(例如注射部位的感染)。鼻内给药可使药物“迅速作用”，因为药物能够以更直接的途径到达脑。鼻内给药
11方便并且实际上消除了患者顺应性问题。粘膜和粘膜下层上皮细胞是选择透过性的。因此， 通过鼻内途径，例如KLKl的蛋白质可以穿过和绕过血脑屏障。鼻内给予KLKl可直接对脑起作用，从而使外周作用最小化，这归因于鼻通路上部嗅区的参与。鼻内给药的物质可行进两种可能的途径——神经元内途径和神经元外途径。神经元内途径是肽被摄入嗅神经元内，在此肽沿着轴突移动以绕过血脑屏障。通过嗅区上皮细胞的独特细胞间隙是可使肽扩散进入蛛网膜下隙的神经元外途径。神经元外途径是更优选的，因为通向脑更迅速，避免了神经元内途径中涉及的蛋白水解降解(Born et al. . , Nat. Neurosci. 2002,5(6) :514-6)，并且可在脑的多个位点迅速引起生物学效应(Throne et al. ·，Neuroscience,2004，127(2) :481-96)。尽管能够经口递送，然而优选的给药途径是鼻内给药，因为鼻内给药能将KLKl更直接地递送至脑中所需的作用位置。药物组合物可通过口服或鼻内给药。适于鼻内给药的制剂包括软膏剂、膏剂、洗齐U、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、油剂等。可通过常规方法，例如用点滴器、移液管或喷雾器将溶液剂或悬浮剂直接施用于鼻腔。制剂可以以单剂量或多剂量的形式提供。对于点滴器或移液管，可以给予患者合适的、预定体积的溶液剂或悬浮剂。喷雾剂可通过计量雾化喷射泵给予。用于气雾给药——特别是给至呼吸道的气雾给药——的制剂包括鼻内给药。活性成分可以提供于带有合适喷射剂的加压容器中，所述喷射剂例如含氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，或者二氧化碳或其他合适气体。气雾剂还可包含合适的表面活性剂，例如卵磷脂。药物剂量可由计量阀控制。或者，活性成分可以以干粉的形式提供，例如所述化合物在合适的粉末基质中的粉末混合物，所述粉末基质例如乳糖、淀粉或淀粉衍生物(例如羟基丙基甲基纤维素)和聚乙烯吡咯烷(PVP)。所述粉末载体可在鼻腔内形成凝胶。所述粉末组合物可以以单位剂型存在，例如胶囊、明胶药包或吸塑包装。可通过吸入器来给予粉末剂。本发明的一个方法包括将化合物通过跨神经元逆向和顺向转运机制运送至脑的患病区域。通过所述转运系统将神经学试剂运送至脑能够以数种方式实现。一种技术包括将KLKl单独递送至鼻腔。在这种情况下，KLKl的化学特性可便于其转运至脑的患病神经元。辅助物质能够将KLKl递送至周围感觉神经元并且/或者沿着神经途径至脑的功能障碍区域。可使用嗅神经途径的周围神经细胞将KLKl运送至与嗅球连接的大脑区域的受损神经元。本发明的一种方法将KLKl运送至哺乳动物的鼻腔。优选将KLKl递送至鼻腔内上三分之一的嗅区，特别是嗅上皮，以促进所述试剂被运送至周围嗅神经元，而不是呼吸上皮内的毛细血管。通过神经系统而不是循环系统将KLKl转运至脑，这样KLKl可被递送至脑中的受损神经元。为向嗅神经元递送KLKl，可将KLKl单独地或以药物组合物的形式与其他物质结合给至位于鼻腔内上三分之一的嗅区。组合物可以以粉末或液体喷雾剂、鼻滴剂、凝胶剂或软膏剂的形式通过软管或导管、通过注射器、通过packtail、通过拭子或者通过粘膜下层灌注来鼻内给药。口服给药包括溶液剂、片剂、缓释胶囊、肠溶衣胶囊和糖浆的经肠给药。
KLKl能够与载体和/或其他佐剂结合以形成药物组合物。可能的佐剂包括但不限于GM-1、磷脂酰丝氨酸(PQ和例如聚山梨醇酯80的乳化剂。其他的添加性物质包括但不限于亲脂性物质，例如神经节苷脂和磷脂酰丝氨酸(PS)。可将KLKl单独地或者与可用于治疗精神分裂症或双相型障碍的第二种治疗性化合物结合给至鼻腔。可用于治疗精神分裂症或双相型障碍的第二种治疗性化合物包括但不限于三氟拉嗪(trifluoperazine)、二盐酸三氟噻吨(f luanxol)、洛沙平 (Ioxapac)、琥珀酸洛沙平(Ioxitane)、茶碱(etrafon)、羟哌氯丙嗪(trilafon)、盐酸氯丙嗪(thorazine)、氟哌唆酉享(halopoidol)、轻哌氟丙嗪(f luphenazine decanoate)、 阿立哌唑(aripiprazole)、氯氮平(clozapine)、齐拉西酮(ziprasidone)、利斯哌酮 (resperidone)、questiapire、奥兰扎平(olanzapine)、伊潘立酮(iloperidone) (Titan/ Novartis), DTA 20 IA(Knoll)、DV 127090 (Solvayl Lundbeck)、ORG 5222 (Organon)、 奥沙奈坦(Osanetant)(Sanofi-Synthelabo)禾口 MEM 3454(Memoray Pharmaceuticals Corp.)。可用于治疗双相型障碍的第二种治疗性化合物包括但不限于阿立哌唑、阿塞纳平(asenapine)(研究的)、酰胺咪嗪(carbamaz印ine)、氟西汀(fluoxetine)和 alanzapine、拉莫三嗪(Iamotrigine)、锂、奥兰扎平、奥卡西平(oxcartaz印ine)、喹迪平 (quetiapine)、维思通(risperidone)、托吡酯(topirimate)、丙戊酸、丙戊酸、双丙戊酸钠 (divalproex sodium)禾口齐拉西酮(ziprasidone)。在本发明的一个实施方案中，KLKl能够与由亲脂物质制成的微团结合。微团能够改变鼻膜的透过性并且增强所述试剂的吸收。亲脂微团可包含神经节苷脂，尤其是GM-I神经节苷酯和磷脂酰丝氨酸(PS)。一旦KLKl穿过鼻上皮，KLKl即沿着嗅神经途径运送。KLKl能够在嗅系统中移动。 具体地，神经营养物质和神经发生(neuritogenic)物质已经被证明容易进入神经细胞膜并且对神经细胞受体部位有亲和性。实施例实施例1 大鼠中用KLKl治疗后对惊跳(startle)的前脉冲抑制缺陷的防止在正常大鼠中，在前的前脉冲减弱惊跳脉冲反射，但是，在用PCP处理的大鼠中， 缺乏感觉运动门控导致前脉冲抑制缺陷，因此惊跳脉冲反射更强烈。这种惊跳的前脉冲抑制缺陷见于精神分裂症。将在室温下自由饮食和饮水的适应的雄性Sprague-Dawley或Wistar大鼠分为5 个处理组a) 10皮下给予溶媒(vehicle)和鼻内给予溶媒b) 10皮下给予PCP和鼻内给予溶媒c) 10皮下给予PCP和腹膜内给予氯氮平(Clozapine)
d) 10以剂量I的KLKl处理14天后皮下给予PCPe) 10以剂量II的KLKl处理14天后皮下给予PCP使用的剂量为PCP 0. 5至3. Omg/kg，氯氮平1至15mg/kg以及KLK10. 01至 1000IU. KLKl在前脉冲抑制测试前1小时给予。氯氮平在前脉冲抑制测试前 30分钟给予。PCP在前脉冲抑制测试前 15分钟给予。将动物逐个置于标准惊跳室中，令其在所述惊跳测试开始前在所述室中适应2-5
13分钟的时间。以伪随机的方式对每只动物进行10-15次非惊跳脉冲(仅背景噪音)试验， 10-15次惊跳脉冲试验(100-120dB)，10-15次低前脉冲(50_90dB) +惊跳试验，10-15次中前脉冲(50-90dB) +惊跳试验和高前脉冲(50-90dB) +惊跳试验，试验间间隔为10-30秒。通过室传感器以惊跳脉冲反射来测量运动并记录为惊跳振幅。前脉冲抑制被定义为在存在前脉冲的条件下的惊跳振幅与无前脉冲条件下的振幅相比的百分比减少(100-(100X平均前脉冲(低、中或髙)+惊跳/平均惊跳)。用PCP处理之后，仅PCP处理载体组与非PCP处理小组相比显示出前脉冲抑制百分比的统计学显著的下降。作为阳性对照的氯氮平处理组与PCP处理载体组相比显示出前脉冲抑制百分比统计学显著的升高。用KLKl处理使PCP处理后的前脉冲抑制恢复，因此与仅PCP处理载体组相比，前脉冲抑制百分比有统计学显著的提高。^MM 2 :KLK1处理减Φ强i白游泳测Ii式中PCP 曾加的静I卜时间将适应的Sprague-Dawley大鼠分为对照组和处理组(3组)。两个处理组各自接受腹膜内注射10mg/kg/天的PCP，为期14天，而对照组接受盐水。在第15天，其中一个处理组接受0. 01-1000IU的KLKl 30-60分钟。强迫游泳试骑当被放置在充满水的玻璃杯中没有可能逃跑时，啮齿动物就静止不动了，这是非条件性应激反射(还被称作“行为绝望”)。Noda等证实重复PCP注射诱导该反射(Br. J. Pharmacol, 1995，116 :2531-2537)。用于治疗精神分裂症、特别是阴性症状的治疗剂减少了该反射。通过将大鼠放置在加了 30cm的25°C水的Plexiglas 圆筒(高60.5cm，直径 29cm)中使其进行为期六分钟的强迫游泳试验。记录静止时间以确定该组的平均值。KLKl能够减少以PCP处理的小鼠的静止时间。因此，PCP+KLK1组与仅PCP处理组相比显示出平均静止时间的意料之外的和显著的减少。实施例3 =KLKl减少新物体识别(NOR)任务中亚慢性PCP诱导的认知缺陷新物体识别(NOR)任务依赖于动物探索新物体而不是熟悉物体的自然倾向。探索新物体标识学习和记忆(认知)。与未受影响的对照相比对新物体的探索时间减少标识认知损伤。将适应的雌性Hooded-Lister大鼠分为对照组和处理组。两个处理组接受腹膜内注射10mg/kg/天的PCP，为期7天，而对照组接受盐水，之后的7天所有组都不处理。在第 15天所述PCP处理组之一接受0. 01-1000IU的KLK130-60分钟。将大鼠各自放置在带有黑壁的开放Plexiglas 盒(52cm L ；52cm W ；31cm H)中， 其中放置有两个高度接近的物体。然后将大鼠从所述盒中移出一小会儿时间(1分钟)并放回去，其中一个物体已经被新物体代替。确定所述动物对每个物体的探索时间。探索时间包括闻、舔、触摸、站或坐在所述物体上花费的时间。在该测试之前将大鼠引入所述盒中，这样它们会对该环境熟悉，因此这样的刺激不会影响实验结果。每当从所述盒中将大鼠移出就将所述物体和盒本身用10%的酒精清洗以除去残留的嗅觉信息。所有试验均由不清楚所述处理组的实验者拍摄并分析。仅PCP处理组因PCP诱导的认知损伤而不能够区分所述熟悉物体和所述新物体之间的差异。同样地，对所述熟悉物体和新物体的平均探索时间之间也没有发现统计上显著的差异。PCP+KLK1处理组显示出KLKl能够抑制PCP诱导的认知损伤，因为观察到对所述新物体的平均探索时间与对所述熟悉物体的平均探索时间相比出乎意料地并且显著地增加。该结果表明KLKl能够减少认知缺陷样症状，其被认为是对神经疾病认知缺陷的再现。实施例4 =KLKl处理防丨h PCP-诱导的通过GSK-3B活化的神经变件使用不含Mg2+或Ca2+的冷Hanks平衡盐溶液(HBSS)解离Sprague-Dawley大鼠胚胎前脑细胞(E18-E19)，以IOX IO5细胞/ml重铺在聚赖氨酸(5mg/ml)包被的多孔板上，并在添加了 0. 05mM L-谷氨酰胺和 10% B27 (Invitrogen)的 Neurobasal (Invitrogen， Carlsbad, CA)培养基中在37°C和5% CO2下培养。每四天更换培养基。14天之后，将细胞用ΙμΜ PCP处理如下不同的时间0、1、3、6、12、对和48小时。 在所述具体时间点的最后用PBS冲洗所述细胞，并用RIPA缓冲液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)裂解。在20000Xg下离心所述细胞提取物，收集上清液，使用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)确定蛋白质浓度。使用30 μ g的蛋白质细胞提取物，对每个时间点进行蛋白质印迹以确定磷酸化GSK-3i3S9(失活的)和活化的胱天蛋白酶_3(17kDa)的存在并定量。将每个时间点的相对带密度与对照(非PCP处理细胞裂解物)相比并以相对于对照的百分比标绘在密度图中。所述图显示，在仅PCP处理的细胞中，磷酸化GSK-3i3S9的水平随时间下降而活化的胱天蛋白酶_3(17kDa)的水平随时间增加，一直到M小时时间点。这表明PCP处理致使GSK-3i3活化，其导致活性GSK-3i3引起的下游胱天蛋白酶_3的活化。这种趋势标识经由胱天蛋白酶-3活化的神经细胞死亡，其是精神病疾病中观察到的神经变性的标志。对用PCP (ΙμΜ)和KLKl (在0.001至1000IU的剂量范围内)处理的细胞重复此相同过程如下不同时间0、1、3、6、12、对和48小时。得到的图显示加入KLKl防止PCP诱导的神经变性。GSK-3 β S9磷酸化随时间下降和活性胱天蛋白酶-3随时间增加的趋势被KLKl 减弱。实施例5 在小鼠中用KLKl处理后防止惊跳缺陷的前脉冲抑制将室温下自由饮食的适应的雄性小鼠分为5感染处理组a) 10皮下给予溶媒和鼻内给予溶媒b) 10皮下给予PCP和鼻内给予溶媒c) 10皮下给予PCP和腹膜内给予氯氮平d) 10以剂量I的KLKl处理14天后皮下给予PCPe) 10以剂量II的KLKl处理14天后皮下给予PCP使用的剂量为PCP 1. 0至10. 0mg/kg,氯氮平1至15mg/kg和KLK10. 01至 1000IU. KLKl在前脉冲抑制测试前1小时给予。氯氮平在前脉冲抑制测试前 30分钟给予。PCP在前冲抑制测试前 15分钟给予。将动物逐个放在标准惊跳室中，令其在所述测试开始前在所述室中适应2-5分钟的时间。以伪随机的方式对每只动物进行10-15次非惊跳脉冲(仅背景噪音)试验，10-15 次惊跳脉冲试验(100-120dB)，10-15次低前脉冲(50_90dB) +惊跳试验，10-15次中前脉冲 (50-90dB) +惊跳试验和高前脉冲(50-90dB) +惊跳试验，试验间间隔为10-30秒。通过室传感器以惊跳脉冲反射来测量运动并记录为惊跳振幅。前脉冲抑制被定义为在存在前脉冲的条件下惊跳振幅与无前脉冲条件下的振幅相比的百分比减少(100-(100X平均前脉冲^ Mm+惊跳/平均惊跳)。 用PCP处理之后，仅PCP处理载体组与非PCP处理小组相比显示出前脉冲抑制百分比统计学显著的下降。作为阳性对照的氯氮平处理组与PCP处理载体组相比显示出前脉冲抑制百分比统计学显著的升高。用KLKl处理使PCP处理后前脉冲抑制恢复，因此与仅 PCP处理载体组相比，前脉冲抑制百分比有统计学显著的提高。


本发明包括治疗精神疾病的方法，所述精神疾病包括精神分裂症、精神分裂症谱系相关的病症和双相型障碍，所述方法包括给予组织激肽释放酶(KLK1)、其变体或活性片段。本发明包括包含KLK1、其变体或活性片段的组合物。