专利名称：抗体用于抗癌接种的用途的制作方法如下图1说明体外MAB HE2对小细胞肺癌系SW2的自身粘着的抑制。图2说明体外没有MAB HE2的影响的人小细胞肺癌系SW2的自身粘着作为图1所示实验的对照。图3说明根据ELISA测定的用HE2的F(ab)’2片段对山羊接种之后诱导的抗HE2的抗体免疫应答。图4说明根据细胞-ELISA测定的用HE2的F(ab)’2片段对山羊接种之后诱导的抗Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的抗体免疫应答。图5说明根据细胞-ELISA测定的用HE2的F(ab)’2片段对山羊接种之后不存在抗Ep-CAM阴性人黑素瘤细胞(WM9)的抗体免疫应答，以对于图4所示实验的对照进行。图6说明根据细胞-ELISA测定的用HE2的F(ab)’2片段对山羊接种的山羊血清的亲和纯化的抗体级分对Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的结合。图7说明根据细胞-ELISA测定的自用HE2的F(ab)’2片段接种的山羊血清的亲和纯化的抗体级分对Ep-CAM阴性人黑素瘤细胞(WM9)的结合的不存在，以对于图6所示实验的对照进行。
图8说明根据ELISA测定的用吸附于氢氧化铝的0.5毫克HE2对猕猴接种之后诱导抗HE2的抗体免疫应答。
图9说明根据细胞-ELISA测定的用吸附于氢氧化铝的0.5毫克HE2对猕猴接种之后诱导抗Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的抗体免疫应答。
图10说明根据ELISA测定，与用吸附于氢氧化铝的0.5毫克HE2对一组猕猴接种之后猕猴的毒性研究相关的检测的抗HE2抗体免疫应答的诱导，以及用没有抗原(空白对照剂)的氢氧化铝制剂处理另一组猕猴之后不存在抗HE2的免疫应答。
图11举例说明根据细胞-ELISA测定的与用HE2的猕猴毒性研究相关的检测的抗Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的抗体免疫应答的诱导。
图12说明根据细胞-ELISA测定的，用吸附于氢氧化铝的0.5毫克HE2对患有肠癌的患者反复接种之后抗Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的抗体免疫应答的诱导。
图13说明根据细胞溶解实验测定的，用吸附于氢氧化铝的0.5毫克HE2对患有肠癌的患者反复接种之后抗Ep-CAM阳性人胃癌细胞(KatoIII)的血清细胞毒性的诱导。
下面的实施例是为了进一步详细描述本发明而不应该是对其的限制为了证明鼠类MAB HE2与同嗜性结合中涉及的自身粘着抗原Ep-CAM的表位结合，研究了HE2对人细胞系SW2的自身粘着的能力的影响。此小细胞肺癌细胞系趋向于在前面的一次接种之后几小时之内在体外培养基中形成细胞簇。实施例1中可以看到对该实验的描述。如图1和2所示，通过加入HE2，在很大程度上被预防抑制细胞簇的形成。这证明HE2与该膜蛋白质的同嗜性结合中涉及的Ep-CAM的表位结合。
为了能研究对用鼠类MAB HE2的F(ab)’2片段接种的直接体液免疫应答，用该片段免疫山羊。根据公知方法和用胃蛋白酶裂解HE2所述制备该片段，并纯化。实施例2中描述了山羊的免疫。
首先，与前血清(pre-serum)相比较，对回收并合并的山羊免疫血清研究针对MAB HE2的免疫球蛋白，以测定被接种的山羊的总的免疫应答。借助于ELISA测试进行该项研究，其实验描述在实施例3中给出。图3中给出该项实验的结果由于用MAB HE2的F(ab)’2片段接种，山羊产生了对其的强的免疫应答，而在前血清中没有发现抗HE2抗体。
下面研究是否可能检测山羊免疫血清中的与表达TAA的人癌细胞结合的免疫球蛋白，MAB HE2针对所述TAA(Ep-CAM)。为了该目的，使用了胃癌细胞系KATO III。也试验了与不表达Ep-CAM(WM9黑素瘤细胞)的人细胞系的结合作为对照。借助于细胞-ELISA(cell-ELISA)测试进行该项研究。其实验描述在实施例4中给出。图4和5中给出该项实验的结果山羊免疫血清含有与Ep-CAM阳性KATO细胞强结合的免疫球蛋白，而对于Ep-CAM阴性WM9细胞没有检测到结合。前血清不含有与这些细胞结合的抗体。这个非常出人意料的结果证明通过用HE2-F(ab)’2片段接种产生的抗体确实能将它们自身再次与表达HE2识别的TAA的细胞结合。结果，自身粘着的TAA的功能可以转移给通过用HE2接种产生的抗体，如同前面已经详细描述的。
为了证明由于用HE2的F(ab)’2片段接种而在山羊中产生的针对此MAB的独特型的抗体确实是与KATO细胞结合的那些，借助于原理如(美国国家科学院院刊81(1984)，216)所述的免疫亲和色谱法的顺序从山羊免疫血清特异性纯化这些诱导的抗体的抗独特型部分。纯化步骤的顺序也总结于实施例中。
再次对这些亲和纯化的山羊抗体测定它们与Ep-CAM阳性KATO细胞以及对Ep-CAM阴性WM9细胞的结合。其实验描述在实施例6中给出。图6和7中给出了这些实验的结果针对HE2的独特型的山羊IgG与Ep-CAM阳性KATO细胞强结合，而非特异性山羊IgG几乎不结合。但是，亲和纯化的特异性山羊IgG与Ep-CAM阴性WM9细胞的结合与非特异性山羊IgG没有不同。因此证明由于用HE2的F(ab)’2片段接种而直接产生的并且针对该抗体的独特型的抗体的级分包含与表达HE2识别的TAA的癌细胞结合的抗体。通过该实验，也结论性地证明通过用HE2接种诱导的抗Ep-CAM阳性细胞的抗体不是在一些公开出版物(参见，例如Cancer Immunol.Immunother.42(1996)，81-87)中设定的双自身独特型网络级联的结果，因为这样的抗独特型抗体(Ab3)根本不能通过在Ab1(＝HE2)柱上亲和层析而纯化，因为根据独特型网络，它们不能结合Ab1而只能结合Ab2。
着眼于用HE2的F(ab)’2片段免疫山羊的上述结果，为了证实与人紧密相关的物种中的免疫学结果，也使用猕猴进行了接种研究。对于这些实验，使用完整鼠类MAB HE2作为免疫原。假设作为大的异种蛋白质的鼠类Fc部分也增强抗独特型的免疫应答(载体作用)。为了避免可能的局部副作用，使用氢氧化铝作为温和佐剂。实施例7描述了用于这些接种实验的制剂的制备。
在4只猕猴的背部皮下注射实施例7中描述的制剂(每次接种0.5毫克HE2＝0.5毫升，以4星期的间隔施用两次)。为了回收血清，在几个时间点采取血液。
首先，在ELISA中测定抗HE2的免疫应答。实施例8中给出了该项实验的描述。如图8所示，在第29天就已经测到抗HE2的抗体的显著滴度。
此外研究了通过该接种是否诱导与KATO III细胞结合的抗体。对于这些试验，使用了细胞-ELISA。实施例9中给出了实验描述。如图9所示，所有的动物在第29天就已经诱导了与Ep-CAM阳性KatoIII肿瘤细胞结合的抗体。
下面与使用猕猴的毒性研究相关用吸附于氢氧化铝的HE2对4只动物接种。另外4只猕猴接受了氢氧化铝作为空白对照剂。实施例10和11描述了该制剂的制备。总之，在猕猴的背部皮下注射四次0.5毫升各各制剂(有效物质或空白对照剂)(第1，15，29和57天)。为了回收血清，在开始研究之前和在处理期间不同的时间点取血。
也是首先在ELISA中测定抗HE2的免疫应答。实施例8中给出了实验描述。如图10所示，在一次接种之后所有4只HE2组的猕猴就已经产生了明显的抗HE2的体液免疫应答，通过第二次接种进一步加强，而空白对照剂组的猕猴抗HE2抗体的滴度没有表现出任何增加。
通过HE2组的猕猴的第43天的血清的免疫亲和纯化进一步证实这些发现。实施例12给出了该实验描述。如下面表中所示，在第43天，所有4只猕猴在它们的血清中都产生了强的抗HE2的IgG免疫应答(再次免疫应答)，而IgM部分比得上前血清。
也研究了抗Ep-CAM阳性Kato III细胞的抗体的诱导。再次使用细胞-ELISA用于这些试验。实施例9给出了该实验描述。如图11例示的，在第29天，HE2组的猕猴就已经产生了抗Kato III细胞的抗体。
从山羊和猕猴的上述接种结果来看，在一些情况下，下面用吸附于氢氧化铝的MAB HE2对有转移的肠癌患者(Dukes D)接种。实施例7描述了该制剂的制备。总之，上限用0.5毫升的该制剂(相当于0.5毫克HE2)对患者皮下注射四次(第1，50，78，114)。在每一次接种之前和在第28天为了回收血清而取血。首先，研究通过接种是否诱导了结合KATO III细胞的抗体。对于这些试验再次使用细胞-ELISA。实施例9中给出了实验描述。如图12给出了这些实验的结果。由于接种，该癌症患者体内明显诱导了高滴度的结合KATO III细胞的抗体。
而且，研究了用HE2接种诱导的抗体是否离体介导抗KATO III癌细胞的细胞毒性作用。为了该目的，为了证明诱导的抗体介导补体-依赖性裂解，将KATO III细胞与该癌症患者的前-和免疫血清一起孵育。实施例13中给出了实验描述。
图13给出了结果。用HE2接种诱导的抗体通过自身患者血清中补体-依赖性溶解显然能破坏Ep-CAM阳性Kato III细胞。
上述实验例示性证明，用抗自身粘着TAA的合适的抗体，例如Ep-CAM，或者其和各起始抗体具有相同的独特型的衍生物接种引发体液免疫应答，其在表达该自身粘着TAA的肿瘤细胞上选择性结合。这种诱导的抗体可以表现出抗这样的肿瘤细胞的细胞毒性潜力。用这样的抗体接种因此可以导致对癌症疾病的治疗效果。
实施例使用的材料微量滴定板用于ELISA的Immuno Plate F96 MaxiSorp(Nunc)用于细胞-ELISA的Cell Culture Cluster(Costar；Cat.Nr.3598)细胞系SW2人小细胞肺癌系，Ep-CAM阳性KATO III人胃癌细胞系，Ep-CAM阳性(ATCC HTB 103)WM9人黑素瘤细胞系，Ep-CAM阴性偶联缓冲液 0.1M碳酸氢钠0.5M氯化钠pH值8.0纯化缓冲液APBS def0.2M氯化钠pH值7.2纯化缓冲液B0.1M甘氨酸/HCl0.2M氯化钠pH值2.9培养基ARPMI1640+2g/l碳酸氢钠100U/ml青霉素G100微克/ml硫酸链霉素4mM谷氨酰胺10％胎牛血清(热灭活)结合缓冲液 15mM碳酸钠35mM碳酸氢钠3Mm NaN3
pH值9.6PBS缺陷(PBS deficient)138mM氯化钠1.5mM磷酸二氢钾2.7mM氯化钾6.5mM磷酸氢二钠pH值7.2固定溶液 0.1％的生理氯化钠溶液中的戊二醛洗涤缓冲液A2％氯化钠0.2％Triton X-100在PBS缺陷中洗涤缓冲液B0.05％PBS缺陷中的Tween20封闭缓冲液A5％胎牛血清(热灭活)在PBS缺陷中封闭缓冲液B1％牛血清白蛋白0.1％NaN3在PBS缺陷中稀释缓冲液A2％胎牛血清(热灭活)在PBS缺陷中稀释缓冲液BPBS缺陷染色缓冲液24.3mM柠檬酸51.4mM磷酸氢二钠pH值5.0底物 40毫克邻-苯二胺二盐酸盐100毫升染色缓冲液20微升H2O2(30％)终止溶液 4N硫酸实施例1将体外培养的SW2细胞离心并且将沉淀悬浮于培养基A中，并且调节到7×104细胞/毫升。在LabTek腔室中，0.1毫升的PBSdef与0.3毫升的细胞悬浮液混合或者0.1毫升的PBSdef与40微克HE2混合，然后与0.3毫升的细胞悬浮液混合(HE2的终浓度是100微克/毫升)。就在细胞悬浮液作为最后的成分加入之前，用移液管分开细胞。混合后立即在倒置显微镜(放大100倍)中对各细胞悬浮液照相。接着，在37℃/5％CO2下将细胞悬浮液培养4小时后再次照相。
实施例2各自使用3毫升不充分PBS中1.5毫克F(ab)’2片段与3毫升弗氏完全佐剂(Difco)一起在多个位点皮内接种两只山羊。在第8天，和第1天一样给与第一次加强接种，但是用弗氏不完全佐剂(Difco)。在第29天，以同样的方式给与第二次加强接种。但是，没有加入佐剂。在开始接种之前和第54天取血以回收血清用于产生的免疫应答的分析。
实施例3在37℃下在微量滴定板的孔中将100微升等份的MAB HE2(在结合缓冲液中的10微克/毫升溶液)培养1小时。用洗涤缓冲液A将平板冲洗6次之后，向各孔中加入200微升封闭缓冲液A，并且将平板在37℃下培养30分钟。如上所述冲洗平板之后，在37℃下在1∶100至1∶1000000在稀释缓冲液A中稀释的稀释液中将待测定山羊血清100微升等份孵育1小时。如上所述冲洗平板之后，以在稀释缓冲液A中1∶1000的稀释度向各孔中加入100微升过氧化物酶-偶联的兔抗-山羊-Ig抗体(Zymed)并且在37℃下培养30分钟。平板用洗涤缓冲液A洗涤四次并且用染色缓冲液洗涤两次。通过向各孔中加入100微升特异性底物来检测抗体的结合，并且在大约10分钟之后通过加入50微升中止溶液来中止染色反应。通过在490nm(参考测定的波长是620nm)处测定光密度(OD)进行评价。
实施例4在+4℃下，以浓度为2×106细胞/毫升在培养基A中将含有100微升细胞悬浮液的待测细胞系的微量滴定板的控培养过夜。吸取上清液之后，室温下每孔50微升固定液将平板培养5分钟。吸取上清液之后，向每个孔中加入200微升封闭缓冲液B，并且在37℃下将平板孵育1小时。200微升洗涤缓冲液B洗涤两次之后，以在稀释缓冲液B中稀释1∶10至1∶100在37℃下将100微升等份的待测定山羊血清孵育1小时。用100微升冰冷却洗涤缓冲液B洗涤平板两次之后，以在稀释缓冲液A中稀释1∶1000加入100微升过氧化物酶-偶联的兔抗-山羊-Ig抗体(Zymed)并且在37℃下孵育45分钟。用100微升冰冷却洗涤缓冲液B洗涤平板三次。通过在每孔中加入100微升特异性底物来检测抗体的结合，并且在大约10分钟之后通过加入50微升中止溶液来终止染色反应。通过在490nm(参考测定的波长是620nm)处测定光密度(OD)进行评价。
实施例5纯化原理描述于美国国家科学院院刊81216，1984并且概括如下在第一步中，根据公知方法在DEAE阴离子交换柱上进行山羊血清中含有的总的IgG的纯化。接着，针对HE2的F(ab)’2片段的恒定区的山羊抗体与免疫亲和柱(CH-Sepharose4B，Pharmacia)结合，其中无关的鼠类IgG2a与所述免疫亲和柱偶联，而抗-独特型山羊抗体的级分不与该柱结合。因此，在最后步骤中，该免疫亲和层析的流通物与偶联有HE2的免疫亲和柱(CH-Sepharose4B，Pharmacia)结合。用pH2.8的缓冲液(0.1M甘氨酸/盐酸)洗脱与该柱特异性结合的级分并且中和。用这种方法获得的山羊IgG级分针对HE2的独特型。
实施例6基本上用与实施例4描述的相同的方法进行该细胞-ELISA。不使用血清稀释液，取而代之的是分别使用浓度为100微克/毫升至0.031微克/毫升的免疫亲和-纯化的山羊IgG和非特异性纯化的山羊IgG。
实施例7室温灭菌条件下小心将0.83毫升Alu-Gel的悬浮液(Serva提供的Alu-Gel S，2％悬浮液，品质度用于疫苗制备的佐剂)与0.5毫升的于pH5.5PBS中的10毫克/毫升HE2和3.67毫升PBSdef一起搅拌1小时(HE2的终浓度1毫克/毫升；Alu-Gel S0.33％)。然后，以0.5毫升等份将该悬浮液灭菌装入注射瓶中。
实施例8基本上用与实施例3描述的相同的方法进行该ELISA，除了使用过氧化物酶-偶联的山羊-抗-人-Ig抗体(Zymed)来检测结合的猕猴抗体。使用该试剂可以以和人抗体一样的方法检测猕猴抗体，因为人抗体和猕猴抗体的恒定区的序列同源性是大约98％。
实施例9基本上用与实施例4描述的相同的方法进行该细胞-ELISA，除了使用过氧化物酶-偶联的山羊-抗-人-Ig抗体(Zymed)来检测结合该细胞的猕猴抗体(或人抗体)。使用过氧化物酶-偶联的山羊-抗-小鼠-IgG抗体(Zymed)来检测鼠类HE2作为对照。
实施例10灭菌条件下，3.5毫升的HE2溶液(10毫克/毫升，于PBSdef.中，pH＝5.5中)与0.35毫升硫柳汞溶液(10毫克/毫升；Sigma)以及和27.25毫升生理盐水混合，并且小心搅拌下加入到3.9毫升氢氧化铝悬浮液(3％水溶液；Alhydrogel，Superfos Biosector，Denmark)中。然后在灭菌条件下将用这种方法获得的0.6毫升悬浮液装入去热原玻璃管中，用带有铝盖的橡胶塞密封。
实施例11用与实施例10描述的相同的方法制备空白对照制剂，除了使用0.35毫升生理氯化钠溶液代替抗体溶液和3.5毫升PBDdef pH＝5.5和代替硫柳汞溶液。
实施例121克CH-Sepharose4B(Pharmacia)悬浮于30毫升1mM盐酸中15分钟。然后用1升1mM盐酸和接着用200毫升偶联缓冲液在烧结玻璃AG3过滤器上洗涤该凝胶。对大约0.5升偶联缓冲液透析10毫克HE2(原种溶液10毫克/毫升)。在密封的容器中该溶液与凝胶悬浮液混合。凝胶缓冲液的比例1∶2导致悬浮液适合偶联。室温下将该悬浮液搅拌5.5小时。接着，通过用3×30毫升偶联缓冲液洗涤来去除过量的配体。通过在室温下与1M乙醇胺孵育1小时封闭留下的反应基团。然后在室温下将凝胶与0.1M Tris-HCl缓冲液pH＝8搅拌1小时。最后，用变化pH的缓冲液将凝胶洗涤3个循环。各循环包括0.1M乙酸钠缓冲液pH4和0.5M氯化钠，接着0.1M Tris-HCl缓冲液pH＝8和0.5M氯化钠。凝胶在4℃下保存。
根据下面的说明进行自猕猴的血清的针对HE2的抗体级分的免疫亲和纯化在FPLC系统(Pharmacia)上进行免疫亲和纯化。将根据上述说明获得的1毫升凝胶装入PharmaciaHR5/5柱。用纯化缓冲液A以1∶10稀释0.5毫升血清。以1毫升/分钟的速度将该溶液从柱顶部泵入并且用纯化缓冲液A洗涤直到再次达到检测器的UV基线(280nm)。然后用纯化缓冲液B洗脱结合的免疫球蛋白，并且在用0.5M磷酸氢二钠解吸之后立即中和该级分，并且加入0.02％NaN3。在大小排阻色谱柱(SEC，Zorbax250GF)上分析用该方法纯化的50微升抗体级分，并且定量测定IgG和IgM部分。对于SEC，使用220mM磷酸缓冲液-H7+10％乙腈作为洗脱液。人IgG和人IgM作为SEC标准，为了建立标准校正曲线(峰面积对浓度)对它们以几个浓度各自进行层析。使用标准曲线通过线性回归进行来自猕猴的亲和纯化抗体级分中IgG和IgM浓度的计算。浓度以每毫升使用的猕猴的血清的微克数计(微克/毫升)。
实施例13在进行该试验的前一天，将KATO III细胞转移到新鲜培养基A中并且在37℃/5％CO2下保存在细胞培养瓶中。第2天，第一次用51铬标记细胞。在37℃/5％CO2下，800微升培养基A中与100μCi Na251CrO4一起孵育5×106细胞。接着，用培养基A洗涤细胞，并且调节到2.5×105细胞/毫升的密度。将100微升等份的该细胞悬浮液移取到微量滴定板的孔中。加入100微升等份的待测定患者血清并且在37℃/5％CO2下孵育3小时(为了避免伤害互补物的活性，该血清在-80℃下保存，只是为了该测定而解冻)。使用Skatron-Harvesting-Press回收上清液，并且在γ-计数器中测定。作为结果，获得“实验释放”的值。为了测定“总释放”，如上所述处理细胞，其中用2％SDS，50mM碳酸钠和10mM EDTA代替血清。通过用培养基A代替血清获得“自发释放”的值。如下计算结果％裂解＝(实验释放-自发释放)/(总释放-自发释放)×100该试验进行3次，并且指出单个结果的平均值和标准偏差。


本发明涉及针对人细胞膜抗原的抗体用于抗癌接种的用途。