专利名称：免疫接种的方法对象的疫苗接种是ー种针对所选病原体产生保护性免疫应答的方法。疫苗接种可以是预防性的，即在对象暴露于该病原体之前进行，和/或治愈性的，即在暴露后进行，以便增加、扩大或刺激对象针对致病体的免疫防御。常规疫苗接种包括将抗原胃肠外、鼻道或经ロ给予对象。大多数疫苗接种程序包括将对病原体特异性的所选抗原(重复的)胃肠外给予(例如注射)到对象，由此诱导或放大对象针对该病原体的免疫系统。常规疫苗接种也可以经ロ或经鼻(给药)。疫苗接种通常包括重复给药方案，包括启动给药，接着是ー个或多个加强给药。在大多数情况下，这样的启动-加强疫苗接种，其需要多于一次的免疫化，多次利用相同疫苗作为同源增强剂来进行。而且，在常规疫苗接种程序中，抗原通常联合一种或多种佐剂使用，以便产生适当免疫应答。Wu等人(2005)描述了ー种常规异源启动-加强方法，其中所述启动通过注射第一抗原(编码抗原的质粒DNA)进行并且加强通过注射第二制剂(编码该相同抗原的复制-缺陷型腺病毒载体)进行。这种方法已在针对大量病毒性病原体(包括HIV、丙肝病毒、埃波拉病毒和委内瑞拉马脑炎病毒)的疫苗的开发中进行测试。DNA启动后腺病毒加强也已被评价为用于针对细菌病进行免疫化的方法(McConnell et al.，2007)。常规疫苗接种已经利用不同种类的抗原例如蛋白、肽、细胞、失活病原体、类毒素、病毒样颗粒等进行考察。也已经提出疫苗制剂在皮肤上的局部施用。尤其是，Partidos et al.2003已经证实,免疫应答可以通过表皮途径引起,经过特定给药条件，使用特定佐剂和皮肤的预处理。US 7，378，097还涉及在预处理皮肤上施用加佐剂的抗原组合物的疫苗接种。Mishra et al, 2006提出ー种使用新型囊状构建体、促融囊质体的经皮免疫化的系统，其经由局部给药递送抗原。然而，这种囊状系统是液体、非封闭性系统，并且需要在水合皮肤上与佐剂一起施用抗原。 Hammond et al, 2001还提出一种经皮免疫化的方法，加佐剂的抗原液体溶液通过该方法局部地施用于水合皮肤。所有上述方法需要施用佐剂以引起免疫应答。而且，它们施用液体制剂，并且引发的免疫应答的特性既没有控制也没有进行分析。W02007/122226和W02009/080933公开了表皮免疫化，其使用施用于完整皮肤上的无佐剂的抗原制剂。这种施用表明，可以在没有添加佐剂下且没有皮肤预处理下通过抗原的皮肤施用而获得保护性应答。尽管有用于疫苗接种或保护哺乳动物对象的上述策略和阳性应答，但在本领域仍然需要改进的免疫化方法，其对于患者更方便并且诱导合适且有效的免疫应答以预防或治疗诸如传染病的疾病。
本申请提供ー种在哺乳动物对象中针对病原体形成免疫性的新方法。更具体地，本发明提供使用表皮抗原施用来放大和/或定向对象中的先存免疫。如将在本申请中公开的，这种方法导致强的THl-定向免疫·应答并且比当前疫苗接种方案显著更方便。尤其是，本发明表明皮肤加强引起先存免疫应答放大和免疫应答的THl极化，这特别适于有效疫苗接种。因此，本发明的ー个目的在于ー种用于在哺乳动物对象中刺激和/或THl-定向针对病原体的先存免疫应答的方法，该方法包括在针对病原体具有先存免疫应答的对象的皮肤上施用对该病原体特异性的抗原，所述皮肤施用导致所述应答的刺激和THl-定向。本发明还涉及ー种对病原体特异性的抗原的制剂，其通过将所述制剂施用于哺乳动物对象的皮肤而用于放大和/或THl定向该对象针对所述病原体的先存免疫应答。优选地，该抗原制剂是干的和/或未加佐剂的。优选地，抗原制剂施用于对象的完整皮肤。而且，在ー个优选实施方式中，抗原制剂使用封闭性斑贴装置而施用于对象的皮肤上。本发明还涉及对于病原体特异性的抗原的制剂用于制备药物的用途，所述药物通过将所述制剂施用于对象的皮肤而用于放大并且优选地Thl-定向哺乳动物对象中针对所述病原体的先存免疫应答。优选地，所述抗原是干的和/或未加佐剂的。如将在本申请中进一步公开的，先存免疫力可以由对象针对所述病原体的先前常规疫苗接种、对象针对所述病原体的先前常规免疫启动、和/或对象对所述抗原的先前天然暴露导致。因此，本发明的另ー个目的涉及ー种针对所选病原体对哺乳动物进行疫苗接种的方法，该方法包括:(i)向哺乳动物常规给予对所述病原体特异性的抗原以引起或刺激对所述病原体的免疫应答，和(ii)在该哺乳动物的皮肤上随后施用对该病原体特异性的抗原。如将记载的，这样的皮肤施用允许免疫应答的放大和Thl定向。步骤(ii)可以在步骤(i)之后立即进行，或者在以后进行，只要针对病原体的免疫力仍然在对象中存在。步骤(ii)通常由1、2或3个加强处理构成，其彼此可以以不同时间间隔进行，取决于例如致病体，典型地在1-18个月之间。因此，本发明的另ー个目的涉及ー种用于针对所选病原体对哺乳动物进行疫苗接种的抗原制剂，所述抗原首先常规地给予该哺乳动物以引起或刺激对所述病原体的免疫应答，井随后施用于该哺乳动物的皮肤上。本发明的另ー个目的是ー种加强针对病原体免疫化的哺乳动物对象中的免疫应答的方法，该方法包括在所述对象的皮肤上施用对该病原体特异性的抗原，优选在干燥的未加佐剂的制剂中。更优选地，该抗原制剂是未加佐剂的并且施用于对象的完整皮肤区域。本发明的另ー个目的涉及ー种放大和Thl-定向预先免疫化哺乳动物对象中针对病原体的免疫应答的方法，该方法包括在所述预先免疫化对象的完整皮肤上施用对病原体特异性的抗原，优选在干的和/或未加佐剂的制剂中。本发明还涉及对病原体特异性的抗原(优选在干的和/或未加佐剂的制剂中)，通过将该抗原施用于对象的皮肤而用于放大和Thl-定向预先免疫化哺乳动物对象中针对所述病原体的免疫应答。本发明还涉及ー种用于诱导或刺激哺乳动物对象中的病原体特异性、Thl-定向的免疫应答的方法，该方法包括向该哺乳动物常规给予对病原体特异性的抗原以引起或刺激针对所述病原体的免疫应答；和随后在该哺乳动物的完整皮肤上施用对该病原体特异性的抗原，允许放大Thl-定向的免疫应答。本发明还涉及ー种放大哺乳动物对象中针对病原体的先存免疫应答的方法，该方法包括将对所述病原体特异性的抗原的干且未加佐剂的制剂施用至该对象的完整皮肤。本发明还涉及ー种加强针对病原体预先免疫化的不如动物对象中的免疫应答的方法，该方法包括将对所述病原体特异性的抗原制剂在允许放大和Thl定向该免疫应答的条件下施用于所述对象的皮肤上。本发明的另ー个目的是ー种组合物，其包含对所选病原体特异性的抗原的注射制剂；和对所述所选病原体特异性的抗原的干且未加佐剂的制剂，适合给予至皮肤，用于单独、依次施用至哺乳动物对象。本发明还涉及ー种试剂盒，其包含对所选病原体特异性的抗原的注射制剂；和对所述所选病原体特异性的抗原的干且未加佐剂的制剂，适合给予至皮肤。本发明可以用于任何哺乳动物，尤其是任何人对象，以诱导或放大针对任何病原体的预防性和/或治愈性免疫应答。本发明还可以用于兽医领域，以治理动物如家畜或宠物，包括奶牛、猪、马、狗、猫等。特别适于针对传染性病原体进行疫苗接种。fill皮肤加强对抗-HBsAg IgGl应答的影响Mll皮肤加强对抗-HBsAg IgG2a应答的影响Sll通过皮肤施用或注射两次加强的小鼠中的产生细胞因子的细胞Mll通过皮肤施用或注射两次加强的小鼠中的细胞因子分泌Mll通过皮肤施用或注射两次加强的小鼠中的IL-5应答(ELISA)Mll通过皮肤施用或注射两次加强的小鼠中的IFN-应答(ELISA)Sll在完整和胶带剥离皮肤上诱导的免疫学应答的比较:特异性IgE(7A)和IgG2a(7B)的水平在完整和胶带剥离皮肤上诱导的免疫学应答的比较:食道中的嗜酸性粒细胞计数S9:在完整和胶带剥离皮肤上诱导的免疫学应答的比较:食道中的细胞因子的mRNA表达:嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)(图9A)、IL_5(图9B)和IL_13(图9C)
S 10:在完整和胶带剥离皮肤上诱导的免疫学应答的比较:食道中的mRNA表达:GATA-3 (图 10A)、Foxp3 (图 10B)
图11:在完整和胶带剥离皮肤上诱导的免疫学应答的比较:组织性数据-空肠中的绒毛/隐窝比

如本文中使用的，“常规”给药或疫苗接种是指胃肠外、经ロ或鼻道给药或疫苗接种。胃肠外给药可以通过注射(例如肌内、真皮内、静脉内或皮下)、刺穿、和/或经皮给药进行。优选的胃肠外给药途径是通过注射。表皮或皮肤施用是指在允许接触皮肤的表面的条件下在对象的皮肤上施用抗原。根据本发明的皮肤施用优选在完整(或未预先处理)的皮肤上进行。皮肤施用应维持足以允许抗原透入皮肤的浅层和/或抗原接触免疫细胞的时间期。在本发明的上下文中，术语“完整皮肤”是指角质层的完整性应被基本上保持。之前的工作已表明，对于有效的表皮免疫疗法和增强的抗原透过以及免疫应答的激活，需要去除皮肤的角质层(例如通过磨蚀或深度胶带剥离)，或者需要穿过角质层(例如使用纤维操作针)(Frerichs et al., Vaccine 2008, p2782; Strid et al, Eur J.1mmunol2004p2100)。这些之前的工作表面，通过改变角质层的完整性，角质形成细胞和郎格尔汉斯细胞被活化或刺激，导致有机体的更好应答。与这些之前的观察结果相反，本发明表明优选将抗原施用于完整(即非预先处理)皮肤上，例如在其中角质层的完整性基本上保持的皮肤的表面或部分上。事实上本发明表明，为了避免偏向的Th2免疫应答，很重要的是维持角质层的完整以及位于该角质层下方的角质形成细胞和郎格尔汉斯细胞的天然活化状态。通过維持这种完整性，获得的应答在耐受性方面的高度定向的。因此，尽管在施用部位处可以进行皮肤表面的温和清洗，例如水合、水清洗或非常温和的单次剥离，以除去例如角化细胞(corneocyte ),但是皮肤不应被预先处理以维持角质层的基本完整性。尤其是，皮肤的胶带剥离或强磨蚀不应进行，因为这样的预先处理破坏或去除所有或部分的角质层并且因此角质形成细胞的刺激。类似地，应当避免角质层的穿孔。
如本文中描述的，术语“疫苗接种”通常是指向哺乳动物依次给予ー种或多种抗原，以产生和/或增强针对该抗原的免疫应答。依次给药包括启动免疫化，随后的一次或多次加强免疫化。在本发明的上下文中，术语“病原体”是指可以引起病理状态的任何试剂。“病原体”的实例包括但不限于细胞(例如细菌细胞，患病哺乳动物细胞，癌哺乳动物细胞)、真菌、寄生物、病毒、朊病毒或毒素。优选的病原体是传染性病原体。在ー个特定实施方式中，传染性病原体是病毒，如肝炎病毒、轮状病毒、鸡水痘病毒、流感病毒、巨细胞病毒、流行性感冒、HIV、埃波拉病毒或狂犬病毒。传染性病原体的具体实例包括但不限于白喉棒杆菌(C.diphteriae)、破伤风梭菌(C.tetani)、百日咳鲍特菌(B.Pertussis)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、月思思炎病毒(Mumps)、风疫病毒(Rubella)、带状疱疫病毒(Varicella)(水痘)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、轮状病韋(Rotavirus)、HPV (人乳头瘤病韋(HumanPapillomavirus))、非洲维虫病(African trypanosomiasis)(睡眠病)、炭疽(Anthrax)、禽流感(〃鸟类流感〃)，布路里溃瘍病(Buruli ulcer disease)、霍乱、克里木-刚果出血热(Crimean-Congo haemorrhagic fever)、登革热和出血性骨痛热症、埃博拉出血热、肠道病毒-非脊髄灰质炎，B型流感嗜血菌(HiB) ,hendra病毒、甲型肝炎、こ型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戍型肝炎、流感(季节性)，拉沙热(Lassafever)、军团杆菌病、麻风病、拒疾、马尔堡出血热(Marburg haemorrhagicfever)、麻疫、脑膜炎球菌性脑膜炎(Meningococcalmeningitis)、nipah病毒(Nipah virus)、痕疫、脊髓灰质炎、裂谷热、天花、结核病或黄热病病原体。如本文中使用的，抗原是指可以在对象中引起T细胞或B细胞免疫应答的任何分子。对于病原体特异性的抗原典型地是从所述病原体获得或来源于所述病原体的成分，其含有抗原决定基，并且其可以引起针对病原体的免疫应答。取决于致病体，抗原可以为各种性质，如(多)肽、蛋白、核酸、脂质、细胞等。也可以使用病原体(例如细菌，病毒)的活弱化形式、或其杀死或失活形式，或其纯化材料如蛋白、肽、脂质等。抗原可以是天然或人工产生的。它对于所治疗的哺乳动物可以是外源性的或内源性的(硫肿瘤抗原)。抗原可以通过本领域本身已知的技术，例如合成或重组技术、或酶促方法产生。适合用于本发明的抗原是具体实例包括例如病毒性抗原，优选病毒表面抗原，例如こ肝或甲肝病毒抗原(HBsAg，HAsAg)。其他抗原包括肿瘤相关抗原，即通过肿瘤细胞但不是通过正常细胞表达的抗原、细菌蛋白等。在ー个特定实施方式中，抗原是蛋白、多肽和/或肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換地用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语还应用于氨基酸聚合物，其中ー个或多个氨基酸残基可以被修饰或非天然残基，如相应天然氨基酸的人工化学模拟物。应当理解，术语“蛋白”还包括不同抗原的片段或变体，如含有抗原决定基的片段，或获自病原体的井随后酶促、化学、机械或热修饰的蛋白。如将在以下进ー步讨论的，抗原可以为各种状态，如液体或干的。典型地，对于皮肤施用，抗原处于干的状态，而对于常规疫苗接种或启动，抗原处于液体形式。

本发明涉及使用表皮抗原施用改善哺乳动物对象中先存免疫的新方法。本发明可以用来改善、刺激、強化、扩大和/或再极化先存免疫应答，其可以由以下导致:
.对象针对所选病原体的在前常规疫苗接种；.对象针对所选病原体的在前常规启动；和/或.对象天然暴露于所选病原体。在第一实施方式中，本发明因此在于，在已接受常规疫苗的哺乳动物对象中使用抗原来刺激并优选THl-极化针对病原体的已有免疫应答，所述抗原通过皮肤施用给予对象。先存免疫性可以由在对象中长时间以前(例如在童年期间)实施的常规疫苗导致。常规疫苗和皮肤递送之间的时间期实际上可以显著变化，只要对象仍然表现出先存免疫性。存在这样的先存免疫性如果需要，可以通过常规方法验证。这种方法例如适于在童年期间针对肝炎或破伤风疫苗接种的对象的情形。用于皮肤加强的抗原可以是无活性的或亚基(例如流感、こ肝或甲肝、百日咳)或活的弱化的(水痘、BCG、脊髄灰质炎、流感、狂犬病、黄热病
坐、
ノ o在另ー个实施方式中，本发明在于在已接受常规启动的哺乳动物对象中使用抗原来刺激并且优选THl-极化针对病原体的现有免疫应答，所述抗原通过皮肤施用给予对象。如在实施例中举例说明的，本 发明的发明人已证实，组合胃肠外启动和皮肤加强导致强且Thl-定向的免疫应答。

在ー个特定实施方式中，本发明因此涉及一种针对病原体对对象进行疫苗接种的方法，包括对象用抗原的常规启动以引起或刺激针对所述病原体的免疫应答的第一步骤，接着是通过皮肤施用对于病原体特异性的抗原加强免疫应答的步骤。启动可以包括一个或多个相继的抗原给药。在ー种最典型的方法中，常规启动包括ー个或两个抗原给药。优选的启动通过注射。对于常规给药，抗原典型地组合佐剂。合适的佐剂包括例如活化或加速免疫系统以引起增强的抗原特异性免疫应答的任何物质。可以用于本发明的佐剂的实例包括无机盐，如磷酸钙、磷酸铝和氢氧化铝；免疫刺激性DNA或RNA，如CpG寡核苷酸；蛋白质，如抗体或Toll样受体结合蛋白；皂苷类，例如QS21 ;细胞因子；胞壁酰ニ肽衍生物；LPS ;MPL和衍生物包括3D-MPL ；GM-CSF (粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子);咪喹莫特(imiquimod);交替离子；竞争性或无能Freund佐剂；Ribi佐剂或细菌毒素,例如霍乱毒素或肠毒素(LT)。对于常规启动，因此使用启动抗原组合物，其包含抗原，典型地组合佐剂。这样的组合物通常为液体形式，适于注射。该组合物可以进一歩包含合适赋形剂如稀释剂、载体、等渗溶液、水等。如上所述的，本发明将常规启动或疫苗接种与皮肤加强组合。皮肤加强的步骤典型地包括在允许接触皮肤的条件下在对象的皮肤上施用抗原制剂。施用典型地在允许抗原透入表皮的角质层和/或到达免疫细胞的条件下进行和/或持续这样的时间。皮肤施用优选利用适于保持抗原制剂和对象的皮肤之间的接触的装置进行。这样的装置包括但不限于斑贴、胶带、绷带、薄片、或本领域技术人员已知的任何其他形式。优选地，皮肤装置是斑贴、甚至更优选地是封闭性斑贴。优选的斑贴装置不改变皮肤的完整性。本申请中呈现的结果表明，在使用封闭性皮肤斑贴装置进行皮肤加强时产生显著Thl-定向免疫应答。在最优选实施方式中，本发明的方法使用如在国际专利申请W02002/071950和WO2007/122226中描述的皮肤斑贴装置。
这样的装置是封闭性的并且被构造成使用干形式的抗原，在没有添加粘合剂的情况下，该抗原通过静电和/或范德华力被保持在斑贴上。这样的装置(称为Viaskin )的制备和特性详细公开在以上引用的申请中，其以其整体通过引用并入本文中。对于本发明的实施，特别适于使用包括背衬的装置，其适于与皮肤形成气密性封闭室，这种背衬在小室内在其皮肤面对侧上具有通过静电力和/或范德华力粘附的干的抗原。在施用于皮肤后，小室中湿气增大，导致抗原溶出并与皮肤接触。在本发明的另ー个优选实施方式中，利用封闭性斑贴装置将抗原施用于哺乳动物的皮肤上，该封闭性斑贴装置包括抗原结合的载体。优选地，在没有添加的粘合剂下，抗原通过静电力或范德华カ结合于载体。在特定实施方式中，斑贴的载体可以由玻璃或聚合物构成，该聚合物选自由纤维素塑料(CA，CP)、聚氯こ烯(PVC)、聚丙烯、聚苯こ烯、聚氨酷、聚碳酸酯、聚丙烯酸类、聚烯烃、聚酷、聚こ烯和こ烯丙烯酸こ烯酯(EVA)组成的组。在一个最优选的实施方式中，利用干的抗原制剂进行皮肤加强，其优选利用静电皮肤装置施用于皮肤上。在这方面，术语“干的”是指这样的事实，即加强抗原制剂基本上是粉末化，例如为可以单个化或聚集的颗粒形式。尽管较不优选，但是加强抗原制剂可以为液体形式并且利用已知装置如具有储罐或穿孔膜的封闭装置施用。本发明的优选方法组合液体、加佐剂的启动抗原制剂和干的加强抗原制剂。此外，在一个更优选的实施方式中，加强抗原制剂在没有佐剂下配制或使用。事实上，本发明表明，即使在加强制剂中没有添加佐剂下，该方法导致强且THl-极化的免疫应答。因此本发明的优选方法组合液体的添加佐剂的启动抗原制剂和干的未加佐剂的加强抗原制剂。加强抗原制剂可以含有惰性赋形剂或其他成分，如滲透增强剂或水合剤。然而，优选使用这样的加强抗原制剂，其含有仅有的活性物质的ー种或多种抗原，即没有另外的活性物质如佐剂或渗透增强剂。在加强步骤，一个或多个斑贴装置可以一次或多次在没有任何预处理下直接施用于完整皮肤，优选地在身体的无毛部分。事实上，尽管被本申请涵盖，但是在施用该装置之前不需要处理皮肤。此外，本申请令人惊讶地表明，皮肤预处理实质性地影响由表皮加强剂诱导的免疫应答的类型。更具体地，当抗原制剂是未加佐剂的并且施用于完整皮肤上时，先存免疫应答強烈放大并且Thl极化。这完全出乎意料并且是特别有利的。因此，本发明的ー个目的在于ー种在对象中诱导或增强Thl极化的抗原特异性免疫应答，该方法包括在对象的完整皮肤上施用所述抗原的干且未加佐剂的制剂。本发明的另ー个目的是ー种组合物，该组合物包含对所选病原体特异性的抗原的注射制剂，和对于所述所选病原体特异性的抗原的干的未加佐剂的制剂，用于单独、顺序地施用于哺乳动物对象。本发明的另ー个目的是如上定义的组合物，其用于在哺乳动物对象中诱导、刺激或放大病原体特异性、Thl-定向的免疫应答。本发明的另ー个目的是如上定义的组合物，其用于在哺乳动物对象中加强对所选疾病 的免疫应答。本发明的另ー个目的是ー种在针对病原体常规地免疫化的哺乳动物对象中加强免疫应答的方法，该方法包括在所述对象的未预处理皮肤上并且在没有添加佐剂下施用对病原体特异性的抗原，这样的使用导致免疫应答的加強。术语“常规地免疫化”是指哺乳动物之前已经通过常规给药而暴露于抗原(即，启动的)。由本发明的发明人呈现的结果令人惊讶地表明，在没有佐剂和没有皮肤预处理下的表皮加强，导致之前通过常规给药引起或刺激的免疫应答的有效放大和Thl-定向。在本发明的实施中，用于启动和加强的抗原可以相同或不同，只要该抗原对所选病原体是特异性的。典型地用于启动和加强的抗原含有至少ー个共有的T细胞和/或B细胞抗原决定基。而且，使用的抗原的量可以由技术人员修改。启动步骤可以依照公开的剂量实施。对于根据本发明的加强，每个皮肤装置上的抗原的量的范围典型地为0.1至10000 u g,优选地为 20 至 5000 u g。本发明的方法加强免疫化可以包括一次或多次加强施用，这可以使用相同或不同抗原，优选相同抗原，以不同时间间隔实施，取决于对象、抗原、皮肤装置、疾病等。

在ー个特定实施方式中，每个抗原加强包括I至10次皮肤装置是顺序施用，典型地为I至5次，优选为1、2或3次，在一段时间内，该时间可以从I天延长至几个月。毎次施用彼此可以间隔I天至几周，典型地为I周至10周。此外，本发明的优选处理典型地包括1、2或3个抗原加强。第一个抗原加强可以在启动或暴露于病原体之后的任何时间进行，只要仍然存在抗原特异性免疫细胞。优选地，该第一个加强在启动后2至10周实施。因此，在ー个特定实施方式中，该方法包括常规启动免疫化，接着典型地在3-6周后的单个抗原加强免疫化。如果需要，可以实施第二该和可选地第三个抗原加強。该第二和第三个加强可以在月时间间隔内所述，例如在之前的加强之后的2-18个月。在这方面，在ー个特定实施方式中，所述方法包括常规启动免疫化，随后典型地在3-6周之后，第一个抗原加强，并且典型地1-18个月之后，优选1-12个月之后，例如3-6周之后，第二个抗原加強。在另ー个特定实施方式中，所述方法由以下构成:(i)常规启动免疫化，(ii)典型地3-6周后，第一个抗原加強，(iii)典型地1-18个月后，优选地1-12个月后，例如3-6周后，第二个抗原加强，和(iv)典型地1-18个月后，优选地1-12个月后，例如3-6周后，第三个且最后ー个抗原加強。抗原的具体剂量以及加强施用的数量和接触的持续时间可以由技术人员改变，取决于对象、抗原制剂的性质、使用的斑贴装置的类型等。对于封闭性装置，如Vkskin 装置，接触的持续时间优选包括在5至72小时之间。优选地，对于每个施用，该装置在皮肤素保持24至约60小时，更优选约24小时至48小时，典型地24小时、36小时或48小时的时间。所述处理可以在任何时间停止，例如，一旦已经建立足够的免疫应答的放大和/或Thl-定向。在这方面，本发明表明，由胃肠外启动引发的特定免疫反应，其是Th2-定向的，可以在表皮加强后被有效放大和Thl-定向。Thl和Th2细胞是CD4+辅助T细胞的两种类型，其不同之处在于细胞因子产生的模式。Thl细胞产生IFN-y、IL-2和TNF-P并且涉及在针对胞内病原体和恶性肿瘤细胞的宿主抗性中是有益的细胞介导的免疫应答。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-1O和IL-13，其增大抗体反应，包括IgE产生。Thl和Th2反应相互是拮抗性的，使得它们通常平衡存在并且彼此交叉调控。在本发明的上下文中，免疫应答的Thl定向是指作为本发明的加强的結果，Thl/Th2免疫细胞或细胞因子的比值增大，优选至少10%。如实验部分公开的，从根据本发明加强的对象提取的T细胞的上清，相比于通过常规给药途径加强的对象，含有显著更高浓度的IFN-(其是主要的Thl细胞因子)和显著更低浓度的IL-5，由此证实了免疫应答的Thl定向。在ー个
中，Thl定向是指，相比于使用常规给药途径处理的对象，IFN-的浓度或产生IFN-的细胞的数量增加至少，和或相比于使用常规给药途径处理的对象，IL-5的浓度或产生IL-5的细胞的数量降低至少10%。本发明的另ー个目的涉及ー种在常规免疫化哺乳动物对象中放大或Thl定向针对病原体的免疫应答的方法，该方法包括在所述胃肠外免疫化对象的皮肤上施用对病原体特异性的抗原(未加佐剂下)。本发明的另ー个目的涉及ー种在常规免疫化哺乳动物对象中放大和Thl定向针对病原体的免疫应答的方法，该方法包括在所述胃肠外免疫化对象的未预处理皮肤上施用对于丙酮特异性的抗原(未添加佐剂下)。给出以下实施例用于举例说明的目的而不是用于限制的目的。实施例
_4] 实施例1:通过皮肤加强的放大和THl-定向材料和方法动物成年BALB/c小鼠购自Charles River Laboratories (法国)。所有实验根据欧盟动物护理规定进行。杭原乙肝病毒的表面抗原，即HBsAg。皮肤装置如在WO 2007/122226中描述的Viaskin甘装置。该装置是封闭性的且静电的。抗原通过静电力以干且未加佐剂形式保持在背衬载体的表面上。特异性I成、I甙1、I甙2a的定量血样在免疫疗法之前和期间从眶后静脉丛收集并且血浆储存在-30° C直至进ー步分析。定量ELISA，使用ICH指南确认的，被用于特异性IgGl和IgG2a。简言之，微滴定板用浓度为2 u g/ml的HBsAg涂覆。每孔分配每种血清的100 U I系列稀释液并在4° C孵育24h。用过氧化酶标记的杭-小鼠IgGl或IgG2a抗体用作示踪剂。试剂(TMB)用作酶底物。稀释曲线描图并且血清的滴定在相同坐标(y轴)确定。细朐因子产牛在最后一次采血样后，通过脊骨位错杀死小鼠并且在无菌条件下收获脾。ELISA 定量在24-孔微滴定板中在HBsAg (0 - 50 u g.mF1)存在下进行细胞培养(2.1O6个细胞/孔)。在体外刺激72h之后，收获上清并利用CytoSetTM试剂盒(BioSource InternationalEurope, Belgium)根据制造商说明书测定IL-5和IFN y的定量。ELISpot根据制造商(BD, USA)的推荐，在ELISpot微滴定板(R&D system, USA)中在HBsAg (0-50 ug.mr1)存在下进行细胞培养。在体外刺激48h后測定IL-5和IFN Y的定量。方皇 启动:成年BALB/C小鼠(7个中的2组)用2mg HBsAg/10 u g AlOH常规地免疫化。 启动后第28天-血清收集-第1 组 “HBsAg/Alum”:用 2mg HBsAg/10 u g AlOH 加强-第2 组“ Viaskin /HBsAgpatches”:用加载了 IOOmg HBsAg 的Viaskin 加强。在施用后48小时除去Viaskin - 在启动后弟49天(在后加强I后21天) 血清收集 第I组:没有加强 第2组:用加载有IOOmg HBsAg的Viaskin 加强用于加强I和2的斑贴用2种不同方法制备:对于加强1，通过冻干制备斑贴，而对于加强2，通过干燥制备斑贴。然而，在两种制剂中，将抗原作为粉末加载在这些斑贴上。 在启动后弟63天(在后加强II后14天) 血清收集取脾用于T细胞应答的分析 抗体定量:血清抗-HBsAg抗体(IgGl和IgG2a)在第0、28、49和63天试用抗原涂覆板通过ELISA定量。
T细胞应答:体表外:-在加入布雷菲德菌素a(Brefeldin A) /莫能菌素(monensin)之前,脾细胞在有或没有HBsAg(5mg/ml)下培养I小吋，以阻断细胞因子分泌。-在再培养6小时后，下拨用针对表面分子的抗体染色，然后在用针对IL-5、IL-2、IFN-的抗体染色之前固定和可渗透化处理。- (未示出):在任何实验组(除了在促分裂原刺激的对照脾细胞)中没有检测到高于背景的细胞因子产生细胞。在体外再刺激之后:-在分析之前脾细胞在有或没有抗原(5mg/ml和20mg/ml)下培养72小吋。
IL-5和IFN-g产生脾细胞在有或没有HbsAg下培养48小时后通过ELISpot定量。 在有或没有HBsAg下培养72小时后通过ELISA确定培养上清中的细胞因子分泌。
统计分析将Graph Pad软件(San Diego, USA)用于统计分析。当比较处理小鼠与对照时利用方差分析(ANOVA)和Dunnett试验来分析数据，或者当将所有组彼此进行比较时利用ANOVA和Tukey试验来分析数据。A.结果本发明的表皮加强对抗-HBsAg IrGI应答的影响(图1)呈现的结果表明，IgGl通过第一次皮肤贴施用显著加强(參见图1，D49和D28的比较)。本发明的表皮加强对抗-HBsAg IgG2a应答的影响(图2)呈现的结果表明，IgG2a通过第一次皮肤贴施用的显著加强參见图1，D49和D28的比较)。 用本发明的表皮加强或HBsAg/A10H (ELISpot)两次加强的小鼠中的细胞因子产生细胞(图3) 图3呈现的结果表明，在用Viaskin敗:或具有佐剂的肌肉内注射加强的小鼠中，IFN--产生细胞的数量类似，而IL-5产生细胞在用Viaskin 加强的小鼠中更少。因此，尽管用HBsAg/AlOH进行了 Th2-诱导启动，但是Viaskin 加强引发了平衡的Thl/Th2应答，与HBsAg/AlOH (通过肌肉内注射)的优先Th2应答形成对照。用本发明的表皮加强或HBsAg/A10H (ELISA)两次加强的小鼠中的细胞因子分泌(图4)在72h，相比于用HBsAg/AlOH (通过肌肉内注射)，在来自用Viaskin加强的小鼠的T细胞的上清中，IFN-以显著更高的浓度存在并且IL-5以显著更低的浓度存在。在用本发明的表皮加强或HBsAg/A10H ^LISA-ELISpot细节)两次加强的小鼠中的IL-5应答 在72h,相比于首次试验小鼠,在用Viaskin 加强的小鼠中,IL-5以更高浓度存在。 在72h，相比于用HBsAg/AlOH,在用Viaskin 加强的小鼠中，IL-5以显著更低浓
度存在。 观察到相同分布，与再刺激条件无关(在体外通过体外ELISpot的用ELISA定量)。在用本发明的表皮加强或HBsAg/A10H ^LISA, ELISpot细节)两次加强的小鼠中的IFN-g应答 来自免疫小鼠的脾细胞自发地释放IFN-g，并且这种释放在用Viaskin:: 加强的小鼠中更高。 如果这种自发释放减少: IFN-在用HBsAg/AlOH加强的小鼠中比在首次试验小鼠中在显著更高浓度下没有被检测到。
IFN-在用Viaskin 加强的小鼠中比在首次试验小鼠中在显著更高浓度下被检测到。B.结论
本发明的皮肤加强显著增加用HBsAg/AlOH常规启动的小鼠中的抗-HBsAg IgGl和IgG2a应答。IgGl和IgG2a水平类似于通过常规加强(用佐剂的肌肉内注射)获得的那些。皮肤加强增加IFN-并减少IL-5抗-HBsAg应答。这些结果证实，在体内，Th2_type应答的成功放大和Thl再极化通过常规HBsAg/ALOH启动引发。实施例2:皮肤预处理对免疫应答类型的影响A.材料和方法BALB/c小鼠用灌胃法对于作为佐剂的霍乱毒素混合的花生蛋白提取物(PPE)敏化达6周(一周一次)。然后，免疫疗法进行连续8周。10只敏化小鼠在完整皮肤上表皮地处理。10只小鼠在通过10次胶带剥离预处理的皮肤上表皮地处理。胶带剥离包括用粘合剂的10次剥离，这导致角质层完整性的显著变化。10只敏化小鼠没有进行处理。10只首次试验小鼠用作对照。在免疫疗法结束时，所有的小鼠暴露于10-天持续的口服花生方案。在牺牲后，切片通过组织学分析在食道和空肠中进行评价。Thl、Th2和Treg细胞因子的mRNA的表达通过TR-qPCR测量。血清学应答(特异性IgE、IgGl和IgG2a)的测量在免疫疗法之前和结束时通过ELISA完成。B.结果在完整皮肤上的表皮处理之后，SlgE降低和sIgG2a增加分别为0.036±0.0lvs
0.231 ±0.02 μ g/ml (EPIT vs Sham, ρ〈0.05)和 2.86±0.78vsl.06±0.28 μ g/ml (ρ〈0.05)。相反，在胶带剥离皮肤上的免疫疗法后，SlgE增加并且sIgG2a没有改变，分别为
0.383 ± 0.08 μ g/ml (ρ〈0.0lvs Sham) and 1.252 ±0.22 μ g/ml (参见图 7A 和 7B)。这些结果还表明，食管粘液中的嗜酸细胞浓度在Sham和剥离皮肤处理小鼠中(19.9±1.5和26.7±8.7)显著高于完整皮肤上处理的小鼠中(2.7±0.9) (p<0.01和p<0.05)和首次试验小鼠中(1.1±0.7细胞/mm2) (p<0.01)(参见图8)。此外，相比于Sham(2.57，2.60，2.50，ρ〈0.05)和剥皮处理(2.02，1.95，2.01，ρ〈0.05)，eotaxin (嗜酸细胞活化趋化因子)、IL-5和IL-13mRNA表达通过在完整皮肤上的表皮处理显著降低(分别为
1.14，1.35，1.02)(参见图 9A、B 和 C)。有意义的是，相比于Sham组(p〈0.05)，作为Th2转录因子的GATA_3mRNA在完整皮肤上处理的小鼠中显著降低，如图1OA所示。而且，相比于Sham(p>0.05)和剥皮(p〈0.001)，Foxp3 (一种Treg转录因子)在完整皮肤上处理的小鼠中显著增加(参见图10B)。最后，如图11所示，十二指肠绒毛/隐窝-比值在Sham (2.1 ±0.2)和剥离处理小鼠(2.4±0.3)中比在完整皮肤处理(2.9±0.2) (p〈0.05)和首次试验(3.3±0.1)小鼠显著降低(P〈0.001 和 ρ〈0.05)。C.讨论 获得的结果表明，在表皮免疫疗法中，引发的免疫学应答的外形取决于角质层的完整性水平:在完整皮肤上，诱导了 IgE的减少/IgG2a的增加。
在具有变化的角质层的处理皮肤上:诱导了 IgE/无IgG2a的增加。而且，在花生排他饮食之后:仅在剥离皮肤上处理的小鼠观察到嗜酸细胞的高渗入。结论这些结果表明，利用封闭性装置施用的使用未加佐剂的抗原加强，通过表皮疗法可以获得和扩大有效的免疫应答。当抗原施用于完整皮肤上时，所述加强引起Thl定向和特别强的免疫应答。
_6] 参考文献Glenn, Scharton-Kersten et al.1999，"Advances in vaccine delivery:transcutaneousimmunisation."Expert Opin Investig Drugs8 (6):797-805;Kaiserlian and Etchart 1999^Epicutaneous and transcutaneousimmunization using DNA orproteins.〃Eur J Dermatol 9(3):169-76;Partidosj Beignon et al.2003, ^Delivering vaccines into the skinwithout needles andsyringes."Expert Rev Vaccines 2(6):753-61;"Immunity underthe skin:potential application fortopical delivery of vaccines."Vaccine21 (7-8):776-80).
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本发明涉及用于对象的疫苗接种的改进方法。特别地，本发明公开了使用皮肤抗原施用以放大和提高对象中的针对所选病原体的先存免疫。本发明公开了使用皮肤施用联合常规疫苗接种或启动用于对象针对所选病原体的提高免疫化或疫苗接种。