专利名称：组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的关节内应用的可注射组合物的制作方法组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的关节内应用的可注射组合物本发明涉及关节内注射溶液的开发以供治疗关节退化，尤其是骨关节炎。本发明提出将黏性补充剂，例如透明质酸或其一种盐和组成明确的成纤维细胞生长培养基以及可能的另一种多糖(优选天然来源的)组合起来。现有技术在一些四肢关节中，关节软骨保护的相对骨末端封闭在内衬有结缔组织的囊内，称为滑膜。滑液是填充关节腔的黏性液体；它由滑膜的成纤维细胞(滑膜细胞)分泌的透明质酸(HA)与血浆中滤出的组织间隙液组成。由于软骨中没有血管，滑液的功能是通过润滑关节以减少摩擦，吸收冲击，给关节软骨的软骨细胞提供氧和养分，和从后者中消除二氧化碳和代谢废物。骨关节炎是一种常见的多病因退行性关节疾病，涉及关节软骨的物质丧失。随着病情发展，观察到滑液中HA的浓度和分子量降低。这种现象解释为通过透明质酸的内源性合成减少和广生自由基的炎症，该自由基造成氧化退化。这些变化导致HA粘弹特性降低，渐渐导致其保护关节的基本功能丧失。它们可导致软骨侵蚀，关节腔内存在软骨或骨碎片，疼痛和僵硬。黏性补充是一种良好建立的理论，包括将HA注射入关键以便帮助其更好地润滑关节、提高流动性和减少疼痛。根据骨关节炎的严重程度，例如，每周连续3-5次注射入膝盖，对于大多数病人在6个月到I年内是有效的。这种治疗相当有用，尤其是对不能忍受、或对诸如抗炎药和口服镇痛药之类的常规治疗方法不再有反应，但其疾病还不适合假肢治疗的病人。直到现在，对黏性补充溶液的改进涉及延长HA的停留时间以便提高HA功效。化学修饰HA、交联 HA (W0 2007/070547)或将 HA 与多元醇组合(W02009/024670)的方法已见诸描述以便减缓HA凝胶的体内机械或热降解或其被自由基降解。然而，无论是否被修饰，HA黏性补充产品的半衰期只有几天，其关节内存留仍然远短于它们的治疗功效期，事实上，所述治疗功效期取决于多个累积的作用-对于软骨的冲击是直接的震动吸收器的角色；-捕获关节内碎片的性能，从而减少其摩擦作用；-抵御炎症细胞和它们所分泌的酶的保护作用；和-对痛感受体的可能的直接作用。因此，本领域急需开发用于治疗关节退化，尤其是骨关节炎的新治疗溶液。发明描述 考虑到该情况，申请人采取了一种全新的方法。本发明预计应在两个不同的水平上起作用，以重建良好的关节功能，尤其是治疗关节退化，特别是骨关节炎。因此，本发明涉及组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的注射组成物，以使关节结缔组织的细胞组分，特别是滑膜细胞和软骨细胞恢复活力，从而保证它们的细胞再生和刺激它们(透明质酸和GAG，关节的基本功能成分)的内源性合成。更准确地说，本发明的关节内可注射组合物中可能起到黏性补充剂作用的组分选自透明质酸、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐。实际上，这种关节内应用中常用的黏性补充剂是透明质酸或其盐的一种。由于这个原因，在一具体的实施方式中，目标组合物仅包含透明质酸或其盐的一种作为黏性补充齐U，与成纤维细胞生长培养基组合。 另一实施方式会在设想的组合物中采用透明质酸或其盐的一种作为主要的黏性补充剂，组合至少一种其它的多糖，优选天然来源的以保证其生物相容性、非致免疫的特性。所述的其它多糖优选聚硫酸化的粘多糖-特别是硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、或甚至是肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐。该组合物还包含成纤维细胞生长培养基，和可能的其它成分。事实上，本发明因此包括将润滑和保护关节的机械作用与促进滑膜和关节软骨内细胞合成的成纤维细胞刺激的营养作用组合起来。第一种作用是由黏性补充剂确保，优选透明质酸-交联的或未交联的，或其盐的一种，-可能与一种或多种其它的天然来源多糖组合。第二种作用由如下定义的成纤维细胞生长培养基提供。众所周知，本发明所用的透明质酸可以不同形式存在作为盐，如酯类或酰胺之类的衍生物，和线性或化学交联的形式。所有这些形式在本发明设想之内。虽然交联提高透明质酸分子在生物体内的寿命，但这些修饰影响其物理/化学特性，生物性质和潜在的免疫原性。如透明质酸所述，一种多糖或多种多糖(优选天然来源的)可以采用现有技术所述的交联和嫁接技术作成交联的或未交联的，嫁接的或未嫁接的。由于关节结构需要尽可能中性的技术方案，即，仿生的技术方案，优选未交联的透明质酸及其生理上可接受的盐作为第一组分，因该分子为滑膜液的天然组分。我们利用透明质酸的生理上可接受的盐特别指代钠盐和钾盐，以及它们的混合物。组合物中，黏性补充剂，优选透明质酸的存在浓度优选为I至100mg/ml，更优选10至 25mg/ml。本发明组合物中的第二基本成分是成纤维细胞生长培养基。对于本发明，成纤维细胞生长培养基定义为完全培养基，不仅保持成纤维细胞活性，而且刺激其扩增和细胞内合成(胞外基质和滑液的诸组分)。进行功能性生长试验可确定给出的培养基是否是本发明的成纤维细胞生长培养基。本领域技术人员已知的合适功能试验是利用试剂WST-I并在450nm读取结果的比色观察活细胞的密度。(Berridge，M.V.等.(1996): “利用四唑鎗盐的细胞增殖试验的生物化学和细胞基础” (The Biochemical and Cellular Basis of Cell Proliferation AssaysThat Use Tetrazolium Salts). Biochemica 4,15-19.)例如，成纤维细胞生长培养基是市售可得的S卩，西格玛公司(Sigma)的DMEM标准培养基，其补充有10重量％的FCS(胎牛血清)细胞生长因子。总的来说，此类培养基包含动物或细胞来源的提取物，它们确实刺激成纤维细胞、的生长，但其缺点在于缺乏确定的组成或包含诸如FCS、牛脑垂体提取物，细胞生长因子EGF(表皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、胰岛素或霍乱毒素、皮质醇、哌嗪等难以示踪的外源性元素。本发明所用的成纤维细胞生长培养基优选不含有细胞生长因子或动物或细胞来源的生物提取物，尤其是如果它们未经示踪或不可示踪的和/或不具有确定的组成。“未示踪”或“不可示踪的”表示所述生物材料的来源和/或随后经历的处理不能确定或检测。事实上，所述培养基优选不包含动物或细胞来源的生物提取物，细胞化合物或生长因子或荷尔蒙。在优选的实施方式中，通过关节内注射将与关节的天然环境最大程度相容的成纤维细胞生长培养基，即，包含仿生的和/或生物相容组分的培养基(生物体中天然存在的或对其中性的、不引起过敏或免疫反应的生物材料)引入关节。优选，该培养基优选包含结缔组织的基本物质的成分。这样的培养基可为成纤维细胞特别提供维生素、微量元素、氨基酸、矿物盐、单糖(如葡萄糖、核糖、脱氧核糖)和/或复合糖(如HA)形式的优化营养物质，和核酸成分(形成核苷酸和核苷所需的含氮碱基和戊糖)形式的天然生长因子。优选地，它也会具有6. 5至7. 9的生理pH，较佳地为7. 4至7. 6，和280至450m0sm的克分子渗透压浓度，较佳地为300至 350m0sm。应该注意的是，HA既可以是生长培养基的组分，也可以是黏性补充剂。不同之处是HA的形式(培养基中必须是生理上的透明质酸盐)及其含量(培养基中含量低很多)。为了刺激成纤维细胞生长，这样的培养基可补充某种物质,该物质对于生物体是外源性的但是中性、可跟踪来源的且组成明确。满足该定义的物质为，例如牛奶中提取的肽混合物，或通过先从牛奶中连续沉淀然后分离经过酶水解的某些蛋白获得的MPC复合物(牛奶肽复合物)。脱水粉末形式的该物质优选按0. 5至5mg/ml加至培养基，更优选地按4至5mg/ml o例如，申请人已开发了满足这样定义的复合培养基，其具有了约60种精确定量的以下组分。终浓度化妆品成分的国际命名溶、液1 x(INCI)__(mg/1)水__适量I升 氯化钠__5000至8000L-谷氨酰胺或__100至3000关节内注射用的组合物，其包含至少一种选自下组的黏性补充剂透明质酸、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、纤维素及其衍生物、壳聚糖、黄原胶、半乳甘露聚糖、海藻酸盐和它们各自的盐；和成纤维细胞生长培养基。