一种高效制备重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法技术领域：】[0001]本发明属于基因工程领域，具体地涉及到一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的制备方法，同时涉及提高rh-bFGF在大肠杆菌中表达量的方法。[0002]发明背景[0003]重组人喊性成纤维细胞生长因子(RecombinantHumanBasicFibroblastGrowthFactor,rh-bFGF)是成纤维细胞生长因子(bFGF)家族的一个重要成员，目前所确定的bFGF分子量有18kD、22kD、22.5kD、24kD和34kD五种形式(FlorkiewiczRZ,SommerA.Humanbasicfibroblastgrowthfactorgeneencodesfourpolypeptides,threeinitiatetranslationfromnon-AUGcodons.ProcNatlAcadSciUSA,1989Jun,86(II):3978-3981；ArnaudE,TouriolC,BoutonnetC,GensacMC,VagnerS,PratsH,PratsAC.Anew34—kilodaltonisoformofhumanfibroblastgrowthfactor2iscapdependentlysynthesizedbyusinganon—AUGstartcodonandbehavesasasurvivalfactor.MolCellBiol,1999Jan,19(1):505-514)，其中分子量为18kD的bFGF包含155个氨基酸，不含N-端原子定位信号，且为bFGF活性的主要形式(PatryV,BuglerB,AmalricF,PromeJC,PratsH.Purificationandcharacterizationofthe210-aminoacidrecombinantbasicfibroblastgrowthfactorform(FGF-2).FEBSLett,1994Jul25,349(1):23-28)。[0004]从不同组织提取的bFGF肽链长短不一，分子量均少于18KD。如牛脑垂体bFGF是由146个氨基酸组成的单链非糖化多肽，分子量为16.4KD。这是由于不同的bFGF的分子量因其N末端不同而异，bFGF羧基末端较氨基末端稳定，少于155个氨基酸的bFGF均为其氨基末端截取形式。现已证实含155个氨基酸的bFGF其氨基末端截取少于25个氨基酸时并不影响其生物学活性。(`Chen-xiaoJiaetal,CloningandhighlevelnonfusionexpressionofrecombinanthumanbasicfibroblastgrowthfactorinEscherichiacol1.ActaPharmacolSin,2002sep；23(9):782-786)。[0005]bFGF在生物进化上具有很强的保守性，如:人bFGF(h-bFGF)和牛bFGF氨基酸顺序同源性达98.7%，鸟类和牛bFGF完全相同。[0006]rh-bFGF具有重要的临床应用价值，是基因工程重组蛋白质类药物，是治疗人体烧伤、组织创伤、手术伤及难治性溃疡(如褥疮、糖尿病导致的肤体溃疡伴有末梢神经炎等)等疾病的首选药物，是药效明确、市场认可度高的品种之一。同时rh-bFGF在治疗脑中风后遗症、脑呆、退行性神经病变、缺血性心脏病和外周血管病等方面有多项进入临床试验(牟旭鹏，人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达，吉林大学，2006，5；CHENQiong-yuetal.,HighandstableexpressionofananalogofhumanbasicfibroblastgrowthfactorinEscherichiacol1.ChineseJournalofPathophysiology2006,22(2):247-250)。[0007]bFGF来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，但由于其含量极少，因此难以从纯天然的组织中获得。通过基因工程的手段在大肠杆菌中发酵不失为一种理想和常用的方法。[0008]自1986年Abraham等首次克隆了bFGF的cDNA以来，bFGF基因的克隆和表达研究在原核表达系统中取得了重大进展，Iwaneetal.、Foxetal.、Sqiresetal、Knoerzeretal、Keetal.、Rinasetal等构建了各自不同的表达载体,在大肠杆菌中表达出具有生物活性的bFGF(IwataA,MasagoA,YamadaK.ExpressionofbFGFmRNAaftertransientfocalischemia:comparisionwithexpressionofc-fos,c-jun,andhsp70mRNA.NeuroTrauma,1997,14(4):201-209;FoxGM,SchifferSG,RohdeMF,TsaiLB,BanksAR,ArakawaT.Production,BiologicalActivity,andStructureofRecombinantBasicFibroblastGrowthFactorandanAnalogwithCysteineReplacedbySerine.JBiolChem，1988，263:18452-18458；SquiresCH,ChildsJ,EisenbergSP,PolveriniPJ,SommerA.ProductionandcharacterizationofhumanbasicfibroblastgrowthfactorfromEscherichiacol1.JBiolChem,1988,263:16297-16302;Knoerzerff.BinderHP.SchneiderK,GrussP,McCarthyJE,Risauff.ExpressionofSytheticgenescodesbovineandhumanbasicfibroblastgrowthfactors(bFGFs)inEscherichiacol1.Gene,1989,21:30；RinasU.SynthesisiratesofcellularproteinsinvolvedintranslationandproteinfoldingarestronglyalteredinresponsetooverproductionofbasicfibroblastgrowthfactorbyrecombinantEscherichiacoi1.BiotechnolProg,1996Mar-Apr,12(2):196-200)。[0009]目前，重组h-bFGF的生产主要依靠大肠杆菌表达系统，但是，h-bFGF的可溶性与稳定性较低，在溶液中很不稳定，静止后极易形成二聚体、三聚体甚至多聚体，严重时出现絮状沉淀，极大的影响蛋白质活性；同时，非融合的h-bFGF在原核细胞中的表达量低。根据文献，目前尚无bFGF表达量超过15%的报道。分析原因，主要是h-bFGF的翻译起始区(TranslationInitiationRegion,TIR)GC含量高,大肠杆菌的偏好密码子稀少的缘故。[0010]可见，优化基因结构是提高表达效率的重要途径。本发明基于GenBank中含有147个氨基酸(GENEBANKPROTEINIDAAQ73204.1)的rh-bFGF的核苷酸序列(GENBANK:AY367060.1)，对rh-bFGF的编码基因进行重新设计，获得特定的人工突变序列，克隆并在大肠杆菌中表达，获得了优于文献报道的表达效果，使bFGF在大肠杆菌中的表达量达到并超过25%。【
发明内容】[0011]本发明的目的就是提供一种制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，提高rh-bFGF在大肠杆菌中表达量的方法，从而在制备药用重组人碱性成纤维细胞生长因子方面得到应用。通过对rh-bFGF的编码基因进行重新设计，获得特定的人工突变序列。将该序列的基因克隆到大肠杆菌表达载体，转化大肠杆菌，经培养、诱导可以获得比文献报道水平显著提高的表达效果，目标产物可以达到占全菌蛋白的25%以上。该方法在制备重组人碱性成纤维细胞生长因子的过程中具有很高的实用价值，在制备药用重组人碱性成纤维细胞生长因子中的应用前景广阔。[0012]本发明的目的通过这样的技术方案来实现:[0013]I)本发明基本的核苷酸序列基于GENEBANK报道的编码rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)，氨基酸序列如SEQIDN0.5。通过对rh-bFGF的编码基因进行重新设计，获得如SEQIDN0.1所述的人碱性成纤维细胞生长因子的人工编码序列，人工合成该序列，5’及3’端包括可以接受的限制性核酸内切酶酶切位点保护碱基、限制性核酸内切酶酶切位点(如EcoRI和BamHI)、起始密码子ATG和终止密码子TAA，序列差异如附图3；[0014]2)采用适当的限制性核酸内切酶酶切上一步骤合成的基因，并采用DNA连接酶连接到同样酶切的可接受的大肠杆菌表达载体，该载体可以是但不限于pBV220、pET系列载体等原核表达载体；[0015]3)将步骤2)获得的连接产物转化大肠杆菌获得表达重组人碱性成纤维细胞生长因子的基因工程菌，所述大肠杆菌可以是但不限于JM109、DH5a、BL21等大肠杆菌；[0016]4)步骤3)获得的大肠杆菌经过诱导表达、发酵、提取纯化，获得重组人碱性成纤维细胞生长因子原料。[0017]图1是诱导表达rh-bFGF的SDS-PAGE图。左起第I道:rh_bFGF序列改造前，未诱导全菌；第2道:rh-bFGF序列改造前，诱导6h全菌；第3道:rh_bFGF标准品；第4道:实施例二rh-bFGF序列重新设计后，未诱导?’第5道:实施例二rh-bFGF序列重新设计后，诱导6h全菌；第6道:实施例一rh-bFGF序列重新设计后，诱导6h全菌；第7道:实施例三rh-bFGF序列重新设计后，诱导6h全菌；第8道:实施例一rh-bFGF序列重新设计后，未诱导全菌[0018]图2是rh-bFGF提取纯化SDS-PAGE检测图。左起第I道:实施例二中菌株发酵产物经纯化后效果；左起第2道:实施例一中菌株发酵产物经纯化后效果；左起第3道:bFGF标准品；左起第6道:实施例三中菌株发酵产物经纯化后效果[0019]图3是SEQIDN0.1-4序列差异对比图。实施例[0020]实施例按【
发明内容】的方法进行，更为详尽地描述了本发明，但并不限制本发明。[0021]实施例一:[0022]具体步骤:[0023]I)基因的来源:基于GENEBANK报道的编码rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。对该编码基因进行重新设计；[0024]2)目的序列的重新设计:对步骤I)中rh-bFGF序列N端起的第5、6、11、12、13、15、21、22、23、26、120、123、125、126、127、130、131、133、137、138、139、140位氨基酸编码基因进行重新设计，确保其编码的氨基酸不变的情况下，对其密码子进行修改，得到如SEQIDN0.1所示序列；[0025]3)目的序列的获得:通过人工合成的方式，获得目的突变序列；[0026]4)突变基因与特定表达质粒的连接重组:设计酶切位点EcoRI和BamHI，选用pbv220表达质粒，获得突变基因与表达质粒的重组子，连接方法依照《分子克隆实验指南》，连接体系为10μL，其中T4连接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表达质粒2μL，连接温度16°C过夜连接；[0027]5)重组子的转化:选择大肠杆菌BL21，作为宿主菌株。将4)中获得的重组子转化到BL21中。转化方法依照《分子克隆实验指南》；[0028]6)目的蛋白(rh-bFGF)的诱导表达:采用大肠杆菌温度诱导方式进行诱导表达，其中诱导温度42°C，连续诱导6小时，诱导前浓度OD6tltl为0.6，经过诱导，该菌株的rh-bFGF蛋白表达量可占全菌蛋白的25%以上，诱导前后SDS-PAGE检测结果如附图1，左起第7道；[0029]7)大肠杆菌的发酵培养:按常规菌株的发酵培养进行，培养温度37°C，诱导温度42°C，诱导10小时；[0030]8)蛋白分离纯化:采用常规离子交换层析法进行分离纯化，平衡液为0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脱液为1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)冲洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析鉴定，结果如附图2，左起第2道。[0031]实施例二:[0032]I)基因的来源:基于GENEBANK报道的编码rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。通过对rh-bFGF的编码基因进行重新设计；[0033]2)目的序列的重新设计:对步骤I)中对rh-bFGFN端起的第5、6、11、12、13、15、21、22、23、26位氨基酸编码基因进行重新设计，确保其编码的氨基酸不变的情况下，对其密码子进行修改，得到如SEQIDN0.3所示序列；[0034]3)目的序列的获得:通过人工合成的方式，获得目的突变序列；[0035]4)突变基因与特定表达质粒的连接重组:设计酶切位点EcoRI和BamHI，选用pbv220表达质粒，获得突变基因与表达质粒的重组子，连接方法依照《分子克隆实验指南》，连接体系为10μL，其中T4连接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表达质粒2μL，连接温度16°C过夜连接；[0036]5)重组子的转化:选择大肠杆菌BL21，作为宿主菌株。将4)中获得的重组子转化到BL21中。转化方法依照《分子克隆实验指南》；[0037]6)目的蛋白(rh-bFGF)的诱导表达:采用大肠杆菌温度诱导方式进行诱导表达，其中诱导温度42°C，连续诱导6小时，诱导前浓度OD6tltl为0.6，经过诱导，该菌株的rh-bFGF蛋白表达量占全菌蛋白的15%以上，诱导前后SDS-PAGE检测结果如附图1，左起第4道及第5道；[0038]7)大肠杆菌的发酵培养:按常规菌株的发酵培养进行,培养温度37°C,诱导温度42°C，诱导10小时；[0039]8)蛋白分离纯化:采用常规离子交换层析法进行分离纯化，平衡液为0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脱液为1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)冲洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析鉴定，结果如附图2，左起第I道。[0040]实施例三:[0041]I)基因的来源:基于GENEBANK报道的编码rh-bFGF的核苷酸序列如SEQIDN0.2(GenBank:AY367060.1)。通过对rh-bFGF的编码基因进行重新设计；[0042]2)目的序列的重新设计:对步骤I)中对rh-bFGFN端起的第120、123、125、126、127、130、131、133、137、138、139、140位氨基酸编码基因进行重新设计，确保其编码的氨基酸不变的情况下，对其密码子进行修改，得到如SEQIDN0.4所示序列；[0043]3)目的序列的获得:通过人工合成的方式，获得目的突变序列；[0044]4)突变基因与特定表达质粒的连接重组:设计酶切位点EcoRI和BamHI，选用pbv220表达质粒，获得突变基因与表达质粒的重组子，连接方法依照《分子克隆实验指南》，连接体系为10μL，其中T4连接酶IμL，bufferIμL，目的片段6μL，表达质粒2μL，连接温度16°C过夜连接；[0045]5)重组子的转化:选择大肠杆菌BL21，作为宿主菌株。将4)中获得的重组子转化到BL21中。转化方法依照《分子克隆实验指南》；[0046]6)目的蛋白(rh-bFGF)的诱导表达:采用大肠杆菌温度诱导方式进行诱导表达，其中诱导温度42°C，连续诱导6小时，诱导前浓度OD6tltl为0.6，经过诱导，该菌株的目标产物占全菌蛋白的10%。诱导前后SDS-PAGE检测结果如附图1，左起第8道及第6道；[0047]7)大肠杆菌的发酵培养:按常规菌株的发酵培养进行,培养温度37°C,诱导温度42°C，诱导10小时；[0048]8)蛋白分离纯化:采用常规离子交换层析法进行分离纯化，平衡液为0.6mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)，洗脱液为1.0mol/LNaCl+20mmol/LPBS(ρΗ7.0)冲洗，1.8mol/LNaCl+20mmol/LPBS(pH7.0)洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析鉴定，结果如附图2，左起第6道。`徐明波,贾东晨,王俊玲,王喜鹤,秦富景,陈献华,吴彦卓申请人:北京双鹭药业股份有限公司,北京双鹭生物技术有限公司