专利名称：复合功能超微磁性载体粒子及其制备方法 磁性材料是一种具有优良的靶向定位特性的功能材料，尤其是超微粒子级的磁性材料在磁性能，热性能及化学性能上均不同于普通磁性材料，利用这些特殊的性能，早在上个世纪60年代就有人开始对超微磁性粒子的制备及应用进行了研究，其在生物医学领域有广泛应用，如用做局部药物治疗或诊断的载体材料，以及承载基因，多肽片断或其他生物活性制剂等。随着近年来纳米粒子研究的发展，磁性材料也进入了纳米粒子的研究阶段。现有的超微磁性粒子制备技术大致有水热法、等离子体法、共沉淀法、溶胶-凝胶法等几类。其中，共沉淀法是使用最广泛，制备过程最简便的经典方法。然而，现有的共沉淀技术工艺陈旧，制备得到的磁性粒子粒径分布宽，功能单一，很难具有超顺磁性，适应面窄。
本发明的目的是提供一种兼具磁定位，生物靶向定位与药物控释复合功能的超微载体粒子及制备方法。本超微磁性载体材料的制备方法在现有共沉淀技术的基础上进行了改进，通过调节反应聚合物基的浓度控制粒径分布，以合理的升温时间和速度产生超顺磁性，并针对超微磁性粒子的不同应用领域以化学键合与物理连接的形式加入生物活性功能制剂，制得了多组分，粒径分布窄，一般为40～80纳米，具有稳定的超顺磁性，且兼具磁定位、生物靶向定位与药物控释功能的超微磁性载体粒子。本发明是由以下技术方案实现的复合功能超微磁性载体粒子为三层核壳结构络合物。第一层为铁氧化物，第二层为高分子载体材料，第三层为生物活性功能制剂。第一层和第二层粒径为20～40纳米的超顺磁超微粒子。表面包覆第三层的生物活性功能制剂的超顺磁超微载体的粒径为40～80纳米。
其中如图1所示第一层1的铁氧化物为Fe3O4、γ-Fe2O3等铁磁性物质之一。
第二层2的高分子载体材料为多糖及其衍生物，如分子量为10,000～100,000的葡聚糖、分子量为50,000～100,000的O-羧甲基壳聚糖和分子量为3,000～10,000的水溶性低聚壳聚糖；以及分子量为2,000～7,000的聚乙二醇(PEG)等载体材料的一种。
第三层3的生物活性功能制剂主要包括三大类1)靶向制剂，包括抗体及其片断，如M4G3人乳腺癌单抗、羊抗兔lgGF(ab’)2片断等；细胞因子与受体，转铁蛋白等。
2)各类药物，如消炎痛、阿克拉霉素、红霉素，以及阿霉素、表阿霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、顺铂、阿糖胞苷、博莱霉素等各种抗肿瘤药物和各类基因物质等。
3)其他活性功能制剂，如具有较高跨膜特性的TAT等多肽类物质、病理诊断类物质、干细胞等。
在具体实施中，生物活性功能制剂层可以是一种物质，也可以是几种物质的配合使用，主要的配合方式如下在局部药物治疗中，生物活性功能制剂可以是一种药物，亦可为靶向制剂、各类药物以及具有较高跨膜特性的TAT等多肽类物质的有机结合，这样即可增强靶向性与跨膜性，减少副作用，同时又增强了药效。例如，在恶性肿瘤局部治疗中，可将抗体及其片断、抗肿瘤药物以及TAT多肽小分子配合使用。
在局部干细胞治疗中，生物活性功能制剂为靶向制剂与干细胞的配合使用。
在局部病理诊断中，生物活性功能制剂主要为靶向制剂和其他活性功能制剂的配合使用，以提高诊断的准确性。
本发明同时提供一种制备复合功能超微磁性载体材料的方法，具体制备步骤如下(1)超顺磁超微粒子的制备；(2)利用物理凝聚法与化学键合法在超微载体粒子表面包覆生物活性功能制剂。步骤的具体方法如下(1)超顺磁超微粒子的制备X溶液的配制以高分子载体材料∶铁盐∶去离子水＝1∶1.5～2.3∶8～15的重量比比例(本发明中没有具体说明的均是重量比)配制溶液，并于冰水浴中冷却至0～15℃，待用；其中铁盐是FeCl3、Fe2(SO4)3等。
Y溶液的配制以亚铁盐∶去离子水＝1∶0.2～4的比例配制溶液，在冰浴中冷却至0～15℃，待用；其中亚铁盐是FeCl2、FeSO4等。
将X溶液置于冰水浴中，将Y溶液逐滴加入混合搅拌。加热冰水浴，控制温度在10～60分钟内逐步上升至50～100℃，保持此温度下将0.1～0.8体积浓度为1～4摩尔每毫升的强碱液加入到XY混合溶液中，继续搅拌混合溶液30～60分钟，得到黑褐色的超顺磁超微粒子胶体溶液，经过通常的后处理得到粒径为20～40纳米的超顺磁超微粒子。
后处理可以采用的方法是将得到的胶体溶液经透析、磁分离、高速离心、冷冻干燥等。(2)利用物理凝聚法与化学键合法在超微载体粒子表面包覆生物活性功能制剂把由步骤(1)制备的超顺磁超微粒子溶于稀的生物活性功能制剂水溶液中，通过物理凝聚法与化学键合法，结合低频超声浴与生物活性制剂连接；得到的胶体溶液，经过通常的后处理得到粒径为40～80纳米的表面包覆生物活性功能制剂的超顺磁超微载体。
步骤(2)的具体方法可以采用许多种，这里叙述如下几种把由步骤(1)制备的超顺磁超微粒子溶于稀的生物活性功能制剂水溶液中，升温到45～75℃，再加入缓冲溶液调节Ph值4.5～7.5，低频超声，通过物理凝聚得到表面包覆生物活性功能制剂的超顺磁超微载体粒子；或可利用强氧化剂，如NalO4，将由步骤(1)制备的超顺磁超微粒子醛化，再按醛化的超顺磁超微粒子∶生物活性功能制剂∶缓冲溶液＝1∶0.1～0.8∶15的比例混合，常温下反应18～36小时，将混合物经过通常的后处理，得到表面包覆生物活性功能制剂的超顺磁超微载体。
亦可按超顺磁超微粒子∶生物活性功能制剂∶交联剂∶去离子水＝1∶0.1～0.8∶0.25～2∶15的比例混合，用稀酸调pH值4～7.5，于10～40℃反应10～48小时。得到的胶体溶液充分透析后经磁性分离、高速离心、冷冻干燥，得到粒径为40～80纳米的表面包覆生物活性功能制剂的超顺磁超微载体。
由本发明制备的超微磁性载体粒子由于高分子载体材料和生物活性功能制剂的加入，形成了聚合物与铁氧粒子的核壳体系，使得制备的载体粒子兼具磁定位和生物靶向定位两种定位方式，在治疗和诊断过程中药物可控释。尤其是本载体粒子对病灶组织准确的靶向定位特性，减少了副作用，加强药效，提高了患者的生存质量。
本法制备的超微磁性载体粒子在药物局部治疗方面优势明显。首先，磁靶向和生物靶向的双重定位功能确定了药物只在病灶部位聚集，减少了药物对正常细胞的毒副作用；其次，组分之一的高分子载体材料可连接不同的药物，如抗肿瘤药和基因药物等；而且还能连接某些小分子多肽，如TAT等，增加该载体系统穿过细胞膜和跨越血脑屏障的能力，使该复合功能的超微载体具有更广泛的通用性。另外，该载体系统还可通过结合具有病理诊断特性的物质和干细胞，达到对某些疾病进行定位诊断和干细胞修复的效果。
本发明操作简单，原料经济，操作过程清洁，在药物局部治疗与诊断载体系统的制备中具有广阔的发展前景。


图1为本发明制备的超微磁性载体粒子核壳结构示意图；图2为本发明制备的平均粒径为35nm的超微磁性载体粒子的形貌；图3为复合功能超微磁性载体粒子的透射电镜照片；图4为本发明制备的复合功能超微磁性载体粒子的粒径分布图；图5为本发明制备的复合功能超微磁性载体粒子的红外谱图；图6为本发明制备的复合功能超微磁性载体粒子由VSM LDJ9600-1所测得的磁滞回曲线(M-H曲线)。

X溶液的配制以葡聚糖∶FeCl3∶去离子水＝1∶1.5∶8的比例配制溶液，并于冰水浴中冷却至0℃，待用；Y溶液的配制
以FeCl2∶去离子水＝1∶0.2的比例配制溶液，在冰浴中冷却至15℃，待用；将X溶液置于4℃冰水浴中，将Y溶液加入混合搅拌。加热冰水浴，控制在10分钟逐步升温至50℃，保持此温度下把0.1倍体积的4摩尔每毫升的NaOH溶液加入到XY混合溶液中，继续搅拌混合溶液30分钟，得到黑褐色的葡聚糖超顺磁超微粒子胶体溶液；得到的胶体溶液充分透析，再经磁性分离、高速离心、冷冻干燥，得到平均粒径为35nm的葡聚糖超顺磁超微粒子，如图2所示。
称取6mg本发明制备得到的葡聚糖超顺磁超微粒子放入试管中，加15倍体积的去离子水溶解。再于管中加入0.5％(W/V)的高碘酸钠，常温下避光反应1小时，纯化并冻干，得到醛化的葡聚糖超顺磁超微粒子。
以醛化的葡聚糖超顺磁超微粒子∶表阿霉素∶PBS缓冲液＝1∶0.1∶15的比例混合，室温反应24小时。反应混合物再经硼氢化钠还原，并充分透析、冻干，即得平均粒径为60nm的表阿霉素-葡聚糖超顺磁超微载体粒子。
本发明实例1制备的产物如图3，图3为用日本电子光学公司JEM-100CXII型透射电子显微镜得到的产物的透射电子显微镜照片。
通过图像分析软件得到表阿霉素-葡聚糖超顺磁超微粒子的粒径分布，如见图4所示，用本方法制备的表阿霉素-葡聚糖超顺磁超微粒子粒径为纳米级，平均粒径为45纳米，且粒径分布较窄。
将冻干的表阿霉素-葡聚糖超顺磁超微粒子通过VSM LDJ9600-1磁性能分析仪得到一条光滑的磁滞回曲线如图5所示，由此可判断用本方法制备的表阿霉素-葡聚糖超顺磁超微粒子具有超顺磁性。
通过红外吸收光谱，如图6所示，检测到络合于铁氧粒子表层的葡聚糖。
X溶液的配制以O-羧甲基壳聚糖∶Fe2(SO4)3∶去离子水＝1∶2.3∶15的比例配制溶液，并于冰水浴中冷却至室温以下，待用；Y溶液的配制以FeSO4∶去离子水＝1∶4的比例配制溶液，在冰浴中冷却至4℃，待用；将X与Y溶液混合并置于冰水浴中。加热冰水浴，使其温度在30分钟逐步上升至80℃，保持温度，把0.5倍体积的1摩尔每毫升的NH4OH加入到XY混合溶液中，继续反应50分钟，得到深黄褐色的O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微粒子胶体溶液；将胶体溶液纯化并冷冻干燥，得到平均粒径为40nm的O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微粒子。
按O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微粒子∶盐酸阿霉素∶EDC∶去离子水＝1∶0.1∶0.25∶15的比例混合，用盐酸调pH值5.5，于16℃反应24小时。反应产物充分透析并纯化，得到平均粒径为60nm的盐酸阿霉素-O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微载体粒子。实施例3与实施例1中的步骤相同，所不同的是该例中高分子载体材料为水溶性低聚壳聚糖(MW＝3,000)，生物活性功能制剂为博莱霉素。
按醛化的低聚壳聚糖超顺磁超微粒子∶博莱霉素∶PBS缓冲液＝1∶0.4∶15的比例混合，室温避光反应24小时。反应混合物再经硼氢化钠还原，随后纯化并冻干，即得平均粒径70nm的博莱霉素-壳聚糖超顺磁超微载体粒子。
以醛化的聚乙二醇超顺磁超微粒子∶甲氨喋呤∶PBS缓冲液＝1∶0.8∶15的比例混合，室温避光反应24小时。反应混合物经硼氢化钠还原，并充分透析、冻干，即得平均粒径为75nm的甲氨喋呤-聚乙二醇超顺磁超微载体粒子。
按醛化的聚乙二醇超顺磁超微粒子∶阿糖胞苷∶PBS缓冲液＝1∶0.3∶15的比例混合，室温避光反应24小时。反应混合物再经硼氢化钠还原，随后纯化并冻干，即得平均粒径80nm的阿糖胞苷-聚乙二醇超顺磁超微载体粒子。
把1mg本发明制备的O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微粒子溶于5ml 1％(W/V)的铁饱和型转铁蛋白水溶液中，并在水浴中升温至60℃。将乙酸-乙酸钠缓冲溶液快速加入上述水溶液中，调节pH值5.5，超声振荡。得到的胶体溶液经纯化处理并冷冻干燥，得到平均粒径为80nm的表面包覆铁饱和型转铁蛋白的O-羧甲基壳聚糖超顺磁超微载体。
该例中高分子载体材料为葡聚糖(MW＝10,000)，生物活性功能制剂为M4G3人乳腺癌单抗和盐酸阿霉素。
按盐酸阿霉素-葡聚糖超顺磁超微载体粒子∶M4G3人乳腺癌单抗∶PBS缓冲液＝1∶0.4∶15的比例混合，低温反应24小时。反应混合物再经硼氢化钠还原，离心，取上清夜，Sephacry-300凝胶过滤，收集首峰，冷冻干燥，即得纯化的盐酸阿霉素免疫复合功能超顺磁超微载体粒子。经ELISA检测，超微载体粒子上的抗体活性保持80％以上。
该载体粒子在体外抗肿瘤细胞试验中，肿瘤细胞抑制率达80％以上。在后期的动物体内靶向定位实验中，载体粒子由家兔一侧耳缘静脉注入，成功富集于外磁场所在的兔对侧耳部磁区，并由ECT动态检测了载体粒子的富集过程。
按甲氨喋呤-葡聚糖超顺磁超微载体粒子∶羊抗兔lgGF(ab’)2∶PBS缓冲液＝1∶0.35∶15的比例混合，避光低温反应24小时。反应混合物再经硼氢化钠还原，离心，取上清夜，Sephacry-300凝胶过滤，收集首峰，冷冻干燥，即得纯化的甲氨喋呤免疫复合功能超顺磁超微载体粒子。经ELISA检测，超微载体粒子上的抗体活性保持80％。
本发明公开和提出的制备方法和产品，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数、结构设计等环节实现。本发明的方法与产品已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。


本发明是复合功能超微磁性载体粒子及其制备方法。它是三层核壳结构络合物，第一层为铁氧化物，第二层为高分子载体材料，第三层为生物活性功能制剂。是提供一种兼具磁定位、生物靶向定位与药物控释复合功能的超微载体粒子及制备方法。具体制备方法包括以下步骤(1)超顺磁超微粒子的制备；(2)利用物理凝聚法与化学键合法在超微载体粒子表面包覆生物活性功能制剂。本发明可制得40～80nm具有超顺磁特性的复合功能超微载体粒子，且粒径分布窄，靶向性好，药物可控释，在药物局部治疗与诊断载体系统的制备中具有重要的应用前景。