专利名称：一种重组免疫毒素ccl25-pe38基因及制备方法和应用的制作方法研究发现CCR9在急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)患者的⑶4+T淋巴细胞上异常高表达，CCR9的配体CCL25在淋巴结和皮肤中表达水平显著增高。在CCR9发生内置的情况下，白血病细胞的趋化和粘附作用减弱，说明CCR9与白血病细胞的迁移运动密切相关。 CCR9的天然配体CCL25可以诱导T-ALIXD4+T细胞依赖Livin的方式抵抗TNF- α诱导的凋亡，说明CCL25/CCR9对T-ALL的存活有着十分重要的促进作用。另有报道，在儿童ALL复发患者中，白血病细胞高表达CCR9和⑶103，并且浸润到患者肠内的白血病细胞仍然高表达CCR9，同时高表达CCL25。说明CCL25/CCR9与儿童ALL 病复发及白血病细胞转移至特定部位密切相关。成人淋巴细胞白血病(ALT)是一类具有高度侵袭性的⑶4+成熟淋巴细胞恶性肿瘤，表达HTLV-I编码的转录因子Tax的白血病细胞可表达CCR9，体外培养ALT细胞1天后，可检测到CCR9在大多数白血病细胞上表达，使用免疫组织化学检测到侵入胃肠道的⑶4+T细胞普遍表达CCR9，表明白血病细胞浸润到患者肠内与CCR9的表达密切相关。以上研究提示趋化因子及其受体在不同的白血病及其亚型表达谱不同，极有可能成为白血病靶向治疗的潜在位点。免疫毒素的毒蛋白分为两类一类是植物毒素如蓖麻毒素、美洲商陆抗病毒蛋白等，另一类是细菌毒素如绿脓杆菌外毒素O3SeudomonaS exotoxin，PE)、白喉毒素等。PE38 是PE的衍生物，其结合细胞表面受体的结构域被去除，保留了羧基端的ADP核糖基化酶功能结构域，通过导向分子进入细胞后最终在细胞质中与肽链合成中的延长因子EF-2结合， 使EF-2糖基化失活，蛋白合成被阻断，从而导致细胞凋亡。目前还没有使用毒素蛋白PE38靶向CCR9受体这一靶点的重组免疫毒素肿瘤治疗技术方案报道。
本发明的目的是在于提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因。该基因具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。该序列SEQ ID NO. 3是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR的方法扩增获得该基因序列。本发明的另一个目的是提供了一种抗CCR9+白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38 基因制备方法。该方法是构建真核分泌表达载体，转染真核细胞表达该重组免疫毒素，利用亲和层析方法纯化重组免疫毒素CCL25-PE38。该方法简便，表达的重组免疫毒素活性高。本发明的再一个目的是提供了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。该免疫毒素能特异性结合并杀伤CCR9+急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)M0LT4细胞，延缓M0LT4细胞异种移植肿瘤的生长，实现了有效治疗特定类型白血病的目的。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施术语“ CCL25-PE38 ”包括完整的CCL25、PE38、Hi s标签及CCL25与PE38之间的连接序列(Linker, (SG4)4),如SEQ ID NO. 3所示核酸序列，SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列。一种抗CCR9+白血病的重组免疫毒素CCL25-PE38基因制备方法，其步骤是A、钓取CCL25 (GenBank :BC144463. 1)的cDNA，通过合成多对可互扩的引物(A和 B、C和D、E和F、G和H、I和J)，先合成较短的基因片段(AB、CD、EF、GH、IJ)，AB和CD、CD 和EF、EF合GH、GH和IJ之间存在着互相重叠的区域。采用S0E-PCR，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法，构建CCL25的cDNA (图1)。B、钓取 PE38 (GenBank :HC051663. 1)的 cDNA，运用 PCR 从 pRB391 质粒(Hu CC, et al. Construction of eukaryotic expression vector of recombinant immunotoxin human VEGF165-PE38 and its expression. Cancer Research and Clinic. 2009,21(4) 222-225.)为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行PCR,克隆PE38的cDNA(图2)。C、构建 IgK-CCL25-PE38(SEQ ID Ν0· 3)。以 CCL25 (步骤 A 获得的 PCR 产物)为模板，合成Ig κ -CCL25-1 inker,以PE38 (步骤B获得的PCR产物)为模板，合成Linker_PE38。 然后采用S0E-PCR，合成Ig κ -CCL25-PE38全基因片段(图3)，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著，2008，北京，化学工业出版社)所述的方法。D、构建pcDNA3. 1-CCL25-PE38真核分泌表达载体。分别用核酸内切酶Hind III和 EcoR I (New England Biolabs 公司，美国)消化PCR扩增产物 Ig κ-CCL25-PE38和pcDNA3. 1 载体anvitrogen公司，美国)，然后连接构成CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒。E、制备免疫毒素 CCL25-PE38。pcDNA3. 1-CCL25-PE38质粒转染四31"细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，采用无血清培养基 0ΡΤΙ-ΜΕΜQnvitrogen 公司，美国) 进行培养，72小时后收获细胞培养上清；使用HisTrapFF(Roche公司，美国)进行纯化， 使用 BCA 法(Zhongshu Liang, Kan Yang and Benmei Chen. Cholesterol in U937 foam cells assayed in liquid chromatographic-mass spectrometry. Chin J Mod Med. 2004, 14(20) :51-56.)进行测定蛋白浓度，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38浓度为2nmol/ml。 Western blot鉴定所表达的重组免疫毒素(图幻，如分子免疫学实验指南(黎燕等编著， 2008，北京，化学工业出版社)所述的方法。结果显示本发明的重组免疫毒素CCL25-PE38， 能被抗PE38的抗体特异性识别，并与预期目的分子量(54. 7kDa)条带一致。本发明的技术方案是提供一种制备重组免疫毒素的质粒，此质粒具有 CCL25cDNA碱基序列(来自GenBank，SEQ ID NO. 1)和绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38cDNA 碱基序列(来自GenBank，SEQ ID NO. 2)连接而成。一种分离的蛋白的核苷酸序列，其序列为SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列。提供一种高度特异性的重组免疫毒素，此种免疫毒素由上述质粒表达、纯化而成，以CCL25为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，具有特异性结合并杀伤M0LT4细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞，自然高表达CCR9) 的特性。CCL25是一种CC型趋化因子，主要表达在胸腺和小肠。其特异性受体CCR9也主要表达在胸腺和小肠的T淋巴细胞上。在T-ALL中，⑶4+白血病细胞高表达CCR9。CCR9的高表达与CD4+白血病细胞的转移和耐药密切相关。因此CCR9为白血病的个体化治疗提供了一个潜在的靶点。本发明选用CCL25为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，制备CCL25-PE38重组免疫毒素，特异性结合并杀伤CCR9+T-ALL M0LT4细胞，实现了有效治疗特定类型白血病的目的。SEQ ID NO. 1为CC型趋化因子CCL25的cDNA序列，该基因序列编码的蛋白主要在T细胞的发生发展中起作用，趋化T淋巴细胞，巨噬细胞和树突状细胞，其特异性受体为 CCR9。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO. 2为绿脓杆菌外毒素的衍生物PE38(分子量为38kD)的编码序列，去除了绿脓杆菌外毒素与细胞受体结合的序列，其编码的蛋白分子可以通过导向分子进入细胞内后最终在细胞质中与肽链合成中的延长因子EF-2结合，使EF-2糖基化失活，蛋白合成被阻断，从而导致细胞凋亡。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列。SEQ ID NO. 3为基因重组构建的一种新型重组免疫毒素Ig κ -CCL25-PE38序列；SEQ ID N0. 4为SEQ ID N0. 3所示序列编码的重组免疫毒素CCL25-PE38的蛋白质序列，根据在线翻译工具httD Il expasy. org/tools/dna. html获得。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列。该重组免疫毒素CCL25-PE38通过结合CCR9的特异性和PE38介导的细胞毒作用，从而对CD4+急性T淋巴细胞白血病细胞起到特异的杀伤作用。综上所述，如图1显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的PCR产物与CCL25预期的核酸片段(SEQ ID NO. 1)大小一致。如图2显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的 PCR产物与PE38预期的核酸片段(SEQ ID N0. 2)大小一致。如图3显示的琼脂糖凝胶电泳结果，本发明提供的PCR产物与IgK-CCL25-PE38预期的核酸片段(SEQ ID N0. 3)大小一致。如图5显示的免疫印迹结果，本发明提供的CCL25-PE38(SEQ ID NO. 4)氨基酸序列能被抗PE38的抗体特异性识别，并出现在预期分子量(M.7kDa)条带上。如图6所示流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的CCL25-PE38能特异性地识别M0LT4细胞表面表达的CCR9 分子。如图7显示的共聚焦显微镜、流式细胞仪分析结果，本发明提供的CCL25-PE38能内化进入M0LT4细胞内并伴随细胞表面CCR9分子表达降低。如图8显示的细胞毒性实验结果， 本发明提供的CCL25-PE38能特异性地靶向杀伤M0LT4细胞。如图9、10显示CCL25-PE38 能有效缓解M0LT4细胞异种移植肿瘤的生长。一种构建的重组免疫毒素在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用，通过细胞活力测定、抑制肿瘤生长实验检测免疫毒素靶向杀伤急性T淋巴细胞白血病 M0LT4细胞的活性。其应用过程是首先根据趋化因子CCL25的cDNA序列全基因合成此序列(SEQ ID NO. 1)；然后根据PE38的cDNA序列设计引物，运用PCR技术从pRB391质粒克隆PE38cDNA序列(SEQ IDN0. 2)；接下来根据上述两步获得的序列，运用重叠PCR技术将其进行融合，构建成编码重组免疫毒素CCL25-PE38的Ig κ -CCL25-PE38cDNA序列(SEQ IDN0. 3)；最后通过蛋白质数据库ExPASy在线翻译工具(http://expasy.org/tools/dna. html)，根据SEQ ID N0. 3得到重组免疫毒素CCL25-PE38的氨基酸序列(SEQ ID N0. 4)。构建的Ig κ -CCL25-PE38基因，可在真核细胞的得到表达，并可分泌至细胞培养上清中。能够特异性结合表达CCR9的急性T淋巴白血病细胞并通过PE38的细胞毒作用对其起到特异的杀伤作用。根据本发明的优选实施方案，最好使用可在适当的培养条件下高效表达外源基因的细胞作为制备本免疫毒素的宿主细胞。因此，为了制备本发明的抗人CCR9+T-ALL的免疫毒素CCL25-PE38，首先构建分泌表达载体pcDNA3. 1-CCL25-PE38。然后将其转染至细胞中，使之瞬时高表达并分泌至细胞培养液中，从而可更有效地进行分离。另外，由于细胞是表达SV40大T抗原的永生性细胞，可大大提高外源蛋白的表达。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明创造性的将趋化因子CCL25和ΡΕ38融合表达，构建一种新型的重组免疫毒素，并利用真核分泌表达载体表达此重组免疫毒素CCL25-PE38，具有制备简单，容易纯化的特点。利用CCL25结合CCR9的特异性和ΡΕ38细胞毒作用对肿瘤细胞起到特异的杀伤作用。0. 5nmol/ml重组免疫毒素CCL25-PE38在作用于M0LT4细胞48小时后，可导致种植在 RMPI1640 (Hyclone公司，美国)细胞培养液中一半的细胞死亡。在连续给予12次重组免疫毒素CCL25-PE38(每只小鼠每天给予0. 5nmol)治疗SCID小鼠M0UT4细胞异种移植肿瘤， M0LT4细胞异种移植肿瘤的生长减缓，肿瘤重量明显小于PBS处理组。所以，重组免疫毒素 CCL25-PE38具有特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长效果明显，毒副作用小，有很好的应用前景，为急性T淋巴细胞白血病的治疗提供一种新的选择。图1为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图本发明提供的PCR产物与CCL25预期的核酸片段大小一致。图2为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图本发明提供的PCR产物与PE38预期的核酸片段大小一致。图3为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图本发明提供的PCR产物与Ig κ -CCL25-PE38预期的核酸片段大小一致。图4为一种琼脂糖凝胶电泳结果示意图本发明提供的pcDNA3. I-Ig κ-CCL25-PE38 质粒 Hind III 和 EcoR I 酶切产物 pcDNA3.1和Ig κ -CCL25-PE38与预期的片段大小一致。图5为一种免疫印迹结果示意图本发明提供的CCL25-PE38能被抗PE38的抗体特异性识别，并出现在预期分子量 (54. 7kDa)条带上。图6为一种流式细胞仪分析结果示意图。A 对照，L929细胞仅加R-PE标记的羊抗兔IgG处理；B :CCL25-PE38处理细胞30分钟后再加入R-PE标记的羊抗兔IgG ；C 对照，M0UT4细胞仅加R-PE标记的羊抗兔IgG处理；D :CCL25-PE38处理M0LT4细胞30分钟后再加入R-PE标记的羊抗兔IgG ；结果显示本发明提供的CCL25-PE38能特异性地识别CCR9阳性的M0LT4细胞。图7为一种共聚焦显微镜、流式细胞仪分析结果示意图A 共聚焦显微镜检测M0LT4细胞表面的CCL25-PE38 ；B 共聚焦显微镜检测M0LT4细胞内的CCL25-PE38 ；C 流式细胞术检测M0LT4细胞表面的CCR9 ；D 流式细胞术检测M0LT4细胞表面的CCR9 ；结果显示本发明提供的CCL25-PE38能内化进入M0LT4细胞内并伴随细胞表面 CCR9分子表达降低。图8为一种细胞毒性实验结果示意图A 本发明提供的CCL25-PE38能特异性地靶向杀伤M0LT4细胞；B 本发明提供的 CCL25-PE38不影响CCR9阴性细胞的增殖。图9为一种肿瘤生长曲线示意图结果显示CCL25-PE38能有效缓解M0LT4细胞异种移植肿瘤的生长。图10为一种肿瘤体重比较示意图结果显示CCL25-PE38处理组与PBS处理组相比较具有统计学意义，CCL25-PE38能有效缓解M0LT4细胞异种移植肿瘤的生长。
引物D:GGGGTTCCCACACACCTTCCTGTGTCTCTTGGGGAGGTAGAATATCGCAGCAGGCAGA引物E:CACAGGAAGGTGTGTGGGAACCCCAAAAGCAGGGAGGTGCAGAGAGCCATGAAGCTCCT引物F:GGTGGAGCTTTGCAAAAACCTTATTTCGAGCATCCAGGAGCTTCATGGCTCTCTGCA引物G:TAAGGTTTTTGCAAAGCTCCACCACAACACGCAGACCTTCCAAGCAGGCCCTCATGCTG引物H:CGATGATAACTTGGAGTTTCCAGAACTCAACTTCTTTACAGCATGAGGGCCTGCTTGG引物I:GGAAACTCCAAGTTATCATCGTCCAAGTTTAGCAATCCCATCAGCAGCAGTAAGAGGAA引物J:CTATTACAGTCCTGAATTAGCTGATATCAGGAGGGAGACATTCCTCTTACTGCTGCTGA。 获得一种编码CCL25的cDNA的序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列(GenBank BC144463. 1)。2.PE38基因的克隆按照I^rimeSTAR HS DNA polymerase试剂盒(Takara公司，中国)说明书推荐的方法，克隆 PE38 的 cDNA。以 pRB391(Hu CC，et al. Construction of eukaryotic expression vector of recombinant immunotoxin human VEGF165-PE38and its expression. Cancer Research and Clinic. 2009,21 (4) :222-225.)为模板，使用上游引物K，和下游引物L进行 PCR扩增。反应条件94°C变性4min ；98°C，IOs ；68°C,90s ；30个循环。扩增产物行1. 2% (1. 2g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液)琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示。引物K:TCCGGAGGTCCCGAGGGC引物L:GTGCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCG。获得一种编码编码 PE38 的 cDNA的序列，其序列为SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列(GenBank :HC051663. 1)。3. CCL25-PE38 全基因的克隆第1步扩增CCL25C端部分序列与PE38N端部分序列的连接序列。使用上游引物 M和下游引物N互为模板进行扩增，反应条件98°C，10s ；68°C,20s ；30个循环。第2步扩增CCL25-Linker (SEQ ID NO. 3)。以CCL25，第1步获得的序列为模板， 以A和0为引物对扩增CCL25-Linker，反应条件:94°C，30s ；60°C，30s ；72°C，30s ；先行9个 PCR循环后，分别加入引物A和0，继续进行28个循环。第3步扩增Linker-PE38 (SEQ ID NO. 3)。以第1步获得的序列、PE38为模板，以 M 和 P 为引物对扩增 Linke-PE38，反应条件:94°C，30s ；60°C，30s ；72°C, 30s ；先行 9 个 PCR 循环后，分别加入引物M和P，继续进行28个循环。第4 步扩增 CCL25-PE38 (SEQ IDN0. 3)。以 CCL25_Linker，Linker-PE38 为模板， 使用上游引物A，和下游引物P进行PCR扩增。反应条件94°C，30s ；60°C,30s ；72°C, 30s ；先行9个PCR循环后，分别加入引物A和下游引物P，反应条件:94°C,4min ；98°C IOs ；68°C, 90s ；30个循环后72°C延伸5min。第5步各取1 μ 1弓丨物Q和R互为模板进行扩增含分泌信号序列Ig κ (GenBank DQ295255. 1)的 Ig κ-CCL25N 端部分序列(SEQ ID NO. 3)。反应条件98°C，IOs ;68°C，20s ； 30个循环。第6 步扩增 Ig κ -CCL25-PE38 (SEQ ID NO. 3，长度为 1620bp)。以 Ig κ -CCL25N 端部分序列，CCL25-PE38为模板，使用上游引物Q，和下游引物P进行PCR扩增。反应条件 940C，30s ；60°C，30s ；72°C，30s ；先行9个PCR循环后，分别加入引物Q和下游引物P，反应条件:94°C,4min ；98°C, IOs ；68°C, IOOs ；30 个循环后 72°C延伸 5min。第7步构建用于本发明的IgK-CCL25_PE38全序列(含酶切位点)，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。以IgK-CCL25-PE38为模板(由上述第6步所得)，以含有酶切位点HindIII的上游引物T和含有酶切位点EcoR I下游引物S 进行 PCR 扩增(94°C，4min ；98°C IOs ；68°C, IOOs ；30 个循环后 72°C延伸 5min)。扩增产物行1. 2% (1. 2g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液)琼脂糖凝胶电泳分析，如图3所示。引物M:CTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCGTAGTCCGGCAGGGCGCTGA引物N:CGGGACCTCCGGAAGCGGCCGCTGAGCCACCGCCCGACCCACCACCGCCACCGGAGCCT引物0:CGGGACCTCCGGAAGCGGCCGCTGAGCCACCGCCCGACCCACCACCGCCACCGGAGCCT引物P:GTGCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTGCCGGGCTGGCTGGCG 引物 Q GGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTG引物R:GTCCTCAAAGACACCTTGATGATGATGATGATGGTGCGCGTCACCAGTGGAACCTGGAA引物S:CGCAAGCTTCTATTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGCTTCAGGTCCTCGCG引物T:GCGAAGCTTACCATGGAGACAGACACACTCCT。获得一种编码编码 Ig κ -CCL25-PE38 的序列，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。4. pcDNA3. 1-CCL25-PE38 载体的构建分别用核酸内切酶Hind III和EcoR I消化PCR扩增产物Ig κ-CCL25-PE38 (由上述第7步所得)和pcDNA3. 1载体anvitrogen公司，美国)，37°C，4小时。回收酶切后含目的基因的片段后，使用T4连接酶(New England Biolabs公司，美国)连接过夜，构成 CCL25-PE38的真核分泌性表达质粒，用此连接产物转化DH5 α (Novagen公司，美国)感受态大肠杆菌细胞。并对筛选的阳性克隆进行Hind III和EcoR I酶切鉴定(图4)以及DNA测序(金斯瑞公司，南京)。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列，结果显示，所获得的核酸序列与GenBank中注册的CCL25 cDNA和PE38 cDNA序列完全一致。 用上述方法鉴定证实后，将所获得的真核分泌性表达载体定名为pcDNA3. 1-CCL25-PE38，含有编码重组免疫毒素CCL25-PE38基因。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.4所示的
氨基酸序列。SEQ ID NO. 1为步骤1获得的编码CCL25的cDNA ；SEQ ID NO. 2为步骤2获得的编码PE38的cDNA ；SEQ ID NO. 3 为步骤 3 获得的编码 Ig κ -CCL25-PE38 的 cDNA ；SEQ ID NO. 4为根据SEQ ID NO. 3翻译(在线翻译工具，http://expasy.org/tools/dna.html)的重组免疫毒素的蛋白质序列。实施例2 制备重组免疫毒素CCL25-PE38 (如序列SEQ ID NO. 4所示蛋白质序列)按照 Michael 等人所述的方法(Stocker M, Tur MK, Sasse S, Krussmann A, Barth S, Engert A. Secretion of functional anti-CD30-angiogenin immunotoxins into the supernatant of transfected 293T-cells. Protein Expr Purif. 2003 ；28 (2) :211-9.)制备抗T-ALL的重组免疫毒素CCL25-PE38。1.转染细胞取 3 μ g pcDNA3. 1-CCL25-PE38 质粒与 12 μ 1 转染试剂 Entranster -D(Engreen 公司，中国)混合后转染细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，置于37°C，CO2浓度为5%的细胞培养箱中，4小时后换成无血清培养基 OPTI-MEMdnvitrogen公司，美国)，72小时后收获细胞培养上清。2.纯化和定量上清液用磷酸盐缓冲液(PBQ进行透析，浓缩液使用Ni2+亲和层析柱HisTrap FF(Roche公司，美国)进行纯化，纯化后的蛋白于-80°C保存。蛋白浓度使用 BCA试剂盒(碧云天公司，中国)进行测定，分析结果显示，CCL25-PE38，上述步骤1获得的一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列，浓度为2nmol/ml。3. Westernblot鉴定显示本发明的抗人急性T淋巴细胞白血病的重组免疫毒素 CCL25-PE38，能被抗PE38的抗体特异性识别(图5)。实施例3 重组免疫毒素CCL25-PE38结合和内化特性实验收集M0LT4 细胞和细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，PBS 洗涤。取CCL25-PE38(0. 5nmol/ml，PBS稀释)，加至细胞悬液中，于4°C孵育1小时，PBS洗涤两遍后。加入抗PE38的兔抗P2318 (Sigma公司，美国)，对照组加入PBS，4°C孵育30分钟。PBS洗涤两遍后加入R-PE标记的羊抗兔IgG(ProteinTech公司，美国，4°C孵育30分钟。PBS洗涤两次后上流式细胞仪(Beckman公司，美国)进行检测。结果如图6所示。收集M0LT4 细胞(America Tyte Cultrue Collection，美国)，PBS 洗涤。取 CCL25-PE38 (0. 5nmol/ml,PBS稀释)，加至细胞悬液中，于4°C或37°C孵育1小时，PBS洗涤两遍后。一部分细胞加入抗PE38的兔多抗P2318，4°C孵育30分钟；PBS洗涤两遍后加入 R-PE标记的羊抗兔IgG(ProteinTech公司，美国)，4°C孵育30分钟，PBS洗涤两次后进行共聚焦显微镜(Leica公司，德国)分析，结果如图7A，B所示。一部分细胞加入抗CCR9的鼠单抗，4°C孵育30分钟；PBS洗涤两遍后加入R-PE标记的驴抗鼠IgG(ProteinTech公司， 美国)，4°C孵育30分钟，PBS洗涤两次后上流式细胞仪进行检测，结果如图7C，D所示。由图6和图7所示的结果可以看出，使用本发明的CCL25-PE38能特异性结合表达 CCR9的M0LT4细胞。CCL25-PE38结合M0LT4细胞后可内化进入细胞并伴随M0LT4细胞表面CCR9减少。实施例4 重组免疫毒素CCL25-PE38靶向杀伤M0LT4细胞实验
收集M0LT4 细胞，PBS 洗涤。分别取 CCL25-PE38 (0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,1. 0, 2. Onmol/ml, PBS稀释)，加至细胞悬液中，混合物加至96孔板的各小孔中。以PBS处理为阴性对照。37°C、(X)2浓度为5%的细胞培养箱中培养48小时后，加入10 μ 1 WST-I (Roche 公司，美国)继续培养4小时。测定450nm下的OD值(表1，图8A)。同时为检测CCL25-PE38对MOL1M细胞的特异性杀伤依赖于CCR9，设立抗 CCR9Ab (R&D公司，美国)处理组。收集M0LT4细胞，PBS洗涤。先用抗CCR9Ab处理1小时， 然后加入CCL25-PE38。其他处理同上(表1，图8A)。表1.重组免疫毒素CCL25-PE38对M0LT4细胞的杀伤作用(0D450nm)


本发明公开了一种重组免疫毒素CCL25-PE38基因及制备方法和应用，其步骤是A、钓取CCL25的cDNA,通过引物全基因合成CCL25的cDNA；B、钓取PE38的cDNA，运用PCR从pRB391质粒为模板，克隆PE38的cDNA；C、构建Igκ-CCL25-PE38，获得的PCR产物为模板，合成Igκ-CCL25-linker；D、构建pcDNA3.1-CCL25-PE38真核分泌表达载体，分别用核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ消化PCR扩增产物Igκ-CCL25-PE38和pcDNA3.1载体，构成真核分泌性表达质粒；制备免疫毒素，pcDNA3.1-CCL25-PE38质粒转染293T细胞，采用无血清培养基OPTI-MEM进行培养，纯化，测定蛋白浓度，结果显示重组免疫毒素CCL25-PE38，重组免疫毒素的质粒在制备治疗或预防急性T淋巴细胞白血病药物中的应用。制备简单，容易纯化。重组免疫毒素CCL25-PE38具有特异性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长效果明显，毒副作用小，有很好的应用前景。