专利名称：PEG化干扰素λ的制作方法干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。哺乳动物的干扰素可以分为I、II和III型，干扰素已用来治疗许多疾病，包括病毒感染(如丙肝、乙肝、HIV)、炎症性病症以及癌症(如骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳房癌、黑色素瘤、白血病等)。II类细胞因子受体典型地是异二聚体，由两个不同的受体链，即α和β受体亚基组成(Stahl等，cell，74，587-590，(1990))。一般地，α亚基是主要的细胞因子结合蛋白， 而β亚基是形成高亲和结合位点以及进行信号肽转导所必需的。II类细胞因子受体可以通过受体的细胞外部分中大约200个氨基酸(D200)的保守细胞因子结合域来鉴定。从治疗的角度出发，干扰素尤其有意义(关于干扰素的综述见De Maeyer和De Maeyer-Guignard，“干扰素”，《细胞因子手册》(The Cytokine Handbook),第三版，Thompson (编)，第 491-516 页(Academic Press Ltd. 1998)禾口 Walsh, Biopharmaceuticals Biochemistry and Biotechnology,第 158—188 页(John ffiley&Sons 1998))。干扰素显示出多种生物学活性，可用于治疗某些自身免疫性疾病和增强对感染剂(包括病毒、细菌、 真菌和原生物)的免疫应答。迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为三个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前，干扰素Y和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。III型干扰素是最近发现的一类细胞因子家族，包括干扰素λ 1、λ 2和λ 3，也称为IL-28A、IL-28B和IL-29。I型干扰素被认为来源于相同的祖先基因，保留了充分相似的结构以致可以通过相同的细胞表面受体起作用。人干扰素α/β受体的α链包含N端细胞外域，其具有II 类细胞因子受体的特征。干扰素Y与I型干扰素或II型干扰素α亚型没有显著同源性， 但与I性干扰素有许多相同的生物学活性。IL-28A, IL-28B和IL-四包含最近发现的新蛋白家族，所述蛋白质家族与I型干扰素有序列同源性，并与IL-10有基因序列的同源性。该新家族在共同所有的PCT申请WO 02/086087 和 Sh印pard 等，Nature Immunol. 4:63-68, 2003 (全文都纳入本文参考)中有详细的描述。从功能上说，IL-28和IL-四类似于I型干扰素，均能诱导细胞中的抗病毒状态，与I型干扰素不同的是，它们不显示出抗某些B细胞系的抗增殖活性。已知IL-沘和IL-29具有奇数个半胱氨酸(PCT申请WO 02/086087和Sh印pard 等，同上)。IL-观和IL-四的重组表达会导致形成蛋白质的非均一混合物，所述蛋白质包括多种构型的分子内二硫键，这些不同构象的异构体很难获得完全分离。IL-28A (对应于干扰素λ 2)有7个半胱氨酸残基，氨基酸残基第48位的半胱氨酸为游离半胱氨酸残基，可以形成分子间二硫键，尤其是和其它的IL-28A分子形成同二聚体，基于多重比对的IL-28A进一步分析预测，氨基酸残基第16和115位、第50和148位、 以及第167和174位的半胱氨酸，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在序列SEQ ID N0:3中将形成分子内二硫键，编码本文所述的IL-28A多肽区域、域、残基和序列的相应多核苷酸显示在 SEQ ID N0:4 中。IL48B(对应于干扰素λ 3)同样也有7个半胱氨酸残基，氨基酸残基第48位的半胱氨酸为游离半胱氨酸残基，可以形成分子间二硫键，尤其是和其它的IL-28B分子形成同二聚体，基于多重比对的IL-28B进一步分析预测，氨基酸残基第16和115位、第50和148 位、和第167和174位的半胱氨酸，其该蛋白质成熟氨基酸显示在序列SEQ ID Ν0:5中将形成分子内二硫键，编码本文所述的IL-28B多肽区域、域、残基和序列的相应多核苷酸显示在 SEQ ID Ν0:6 中。IL-29 (对应于干扰素λ 1)分子具有5个半胱氨酸残基，基于多重比对进行的 IL-29的进一步分析预测，氨基酸残基第49和145位，及第112和171位的半胱氨酸将形成分子内二硫键，第15位的半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 1中，编码本文所述的IL-四多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID N0:2中。蛋白治疗药物的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感， 阻碍在临床治疗上的应用，其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白质与聚合物例如聚乙二醇(PEG)缀合，通过治疗蛋白和PEG两者共价结合的连接部分可以显著延长治疗蛋白在血浆中的半衰期。这种PEG缀合的生物分子已经显示具有临床上的可应用特性(Inada等，J. Bioact. and Compatible Polymers, 5343 (1990)； Delgado Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249(1992)；禾口Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91 (1993))。在这些特性中有更好的物理和热稳定性、针对酶降解敏感性的保护作用、溶解度增加、使体内循环半寿期更长和清除率减少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。将亲水性多聚物聚乙二醇(PEG)(也称作聚环氧乙烷)与分子共价结合时生物技术和医学上的重要应用。PEG在其最常见形式下是在各末端具有羟基基团的线性多聚物HO-CH2-CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-0H该分子式能简单的代表为H0-PEG-0H，其中指-PEG-代表没有末端基团的多聚物主链 “ -PEG-” 指 “ -CH2CH2O (CH2CH2O) nCH2CH2-”。PEG通常用作甲氧基-PEG-0H，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是要化学修饰的羟基基团。CH3O- (CH2CH2O)n-CH2CH2-OH也常用支链PEG。支链PEG可以表示成R(-PEG-0H)m，其中R代表例如季戊二醇或丙三醇的中央核心分子，而m代表支化臂的数目。支化臂的数目(m)能从3变化到100或更多， 羟基基团要进行化学修饰。其它如PCT专利申请WO 96/21469所述的支链形式具有要进行化学修饰的单个末端，这种PEG类型能表示成(CH30-PEG-)pR-X，其中ρ等于2或3，R代表例如赖氨酸或丙三醇的中央核心，而X代表如能进行化学活化的羧基的功能性基团。而另一个支链形式，“测基PEG”具有如羧基(其主要在PEG主链上而不是在PEG链末端)的反应性基团。除了 PEG的这些形式，也能用在主链中的弱键或可降解来制备多聚物。例如， Harris已在美国专利申请06/(^6716中显示能多聚物主链中可进行水解的酯键来制备 PEG。该水解(反应)导致多聚物被切成较小分子量的片段。根据本发明，术语聚乙二醇或PEG指包括所有上述衍生物。环氧乙烷和环氧丙烷的共多聚物在其化学上和PEG密切相关，而且它们能用来代替PEG的许多应用，它们具有以下通式HO-CH2CHRO (CH2CHRO) nCH2CHR_0H 其中，R是H或CH3。PEG是具有高水溶性以及在许多有机溶剂中具有高溶解性的有用的多聚物。PEG 无毒性也无免疫原性，当PEG和水不溶性化合物化学结合(PEG化)时，得到的偶联物通常是水溶性的，以及在许多有机溶剂中是可溶的。已使用的水溶性多聚物如乙二醇、丙二醇共聚物，羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊环(poly-1，3-dioxolane)，聚-1，3，6-三恶烷、乙烯马来酸酐共聚物，多聚氨基酸(或者单一聚体或者随机共聚体)。目前，已使用的治疗性PEG-蛋白偶联物包括PEG化的腺苷脱氢酶(ADAGENe, Enzon Wiarmaceuticals)，用于治疗重症联合免疫缺陷病；PEG化的L-天冬氨酰胺酶 (ONCAPSPAR , Enzon Wiarmaceuticals)，用于治疗急性淋巴细胞白血病；PEG化干扰素 α -2b (PEG-INTRON , Schering Plough)、PEG 化干扰素 α-2a (PEGASYS , Roche)以及 PEG 化的共有干扰素PEG-CIFN(Amgen),用于治疗肝炎。关于具有临床疗效的PEG-蛋白偶联物的一般综述参见 Burnham，Am. J. Hosp. Pharm.，15 210-218 (1994)。对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的来说，聚乙二醇分子是通过一个在蛋白质分子上发现的反应基团而联到蛋白质分子上。氨基，如赖氨酸残疾上的或N-末端上的氨基通常用于这类附着，例如，Royer (US4002531)认为可利用还原性烷基化反应将聚乙二醇分子附着到酶上。Wright于1993年4月观日公开的EP0539167， "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof ”中认为带有自由氨基酸的肽及有机复合物可被PEG的直接衍生物或有关的水溶性有机多聚体所修饰。Siaw在1990年2月27日公开的美国专利号US4904584中涉及修饰蛋白质中用于通过反应性氨基基团附着聚乙二醇分子的赖氨酸残疾的数目。通常，这些偶联物包括每个蛋白质分子结合的PEG分子数从O到蛋白质中氨基基团数变化的偶联物，对于已经单独修饰的蛋白质分子，PEG单元可以结合在许多不同的胺位；卜.ο对于不同的蛋白，在其游离的Cys残基上偶联时，偶联后的蛋白活性的保留率相差甚大，有的甚至完全失活。活性减弱通常是由于如同在许多细胞因子和抗体中一样，屏蔽了蛋白质的活性结合功能域所致。例如，Katre等在美国专利4766106和美国专利4917888 中描述了用超量许多的甲氧基-聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基戊二酸和甲氧基-聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基琥珀酸PEG化IFN-β和IL-2。两种蛋白质都是在微生物宿主细胞中产生的，其允许自由半胱氨酸位点特异性突变为丝氨酸，突变在IFN-β的微生物表达中是必需的，以促进蛋白折叠，具体的，这些试验中所用的IFN-β是商业产品Betaseron ，其中Cysl7被丝氨酸替换。另外，无糖基化减弱了它在水溶液中的可溶性，非特异性PEG化导致可溶性提高，但主要问题是活性和产量的水平降低。中国专利CN17M889A对干扰素α-Ib 采用PEG在其Cys86上进行定向偶合，其体外活性保留率仅为干扰素α -Ib的1. 6%_2. 2%， 但其在体内可以获得与α-Ib相当或更高的活性。欧洲专利申请ΕΡ593868描述了 PEG-IFN- α的制备，然而，PEG化反应不是位点特异性的，并因此获得了 PEG-IFN- α偶联物位置异构体的混合物(也见Monkarsh等，ACS. Symp. kr. ,680:207-216，1997)。Kinstler等在欧洲专利申请EP675201中演示了用mPEG-丙醛对巨核细胞生长和发育因子(MGDF)的N-末端残基的选择性修饰，这考虑到批次之间可重复性PEG化合物的代谢动力学。Gilbert等在美国专利5711944中证明能产生具有最适合水平；活性的IFN-α 的PEG化，在该例中需要费力的纯化步骤来获得最适偶联物。在PCT/US2004/025864中公开了一种IU8和IU9的均一化制剂，在该申请中， IL-28和IL-29的PEG化是在其N-末端上的氨基进行PEG化，反应在使其能利用蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基和N-末端的α氨基之间的pKa差异的ρΗ下进行，通过该选择性衍生作用，可控制诸如醛(如甲氧基聚乙二醇丙醛)等反应性基团的水溶性聚合物与蛋白质连接，与聚合物的缀合主要发生在蛋白质的N-末端上，而不显著修饰其它反应性基团，如赖氨酸侧链氨基。Woghiren 等在 Bioconjugate Chem.，4 (5) :314-318, 1993 中为这样的位点特异性PEG化合成了硫醇选择性PEG衍生物，显示了稳定的硫醇保护的PEG衍生物以二硫对吡啶反应基团的形式与蛋白质木瓜蛋白酶的自由半胱氨酸特异性偶联，木瓜蛋白酶和PEG酯键新形成的二硫键能在温和的自由半胱氨酸特异性偶联。木瓜蛋白酶和PEG酯键新形成的二硫键能在温和降解条件下被切开，以再生天然蛋白。仍然需要提供一种经位点特异修饰的PEG-IFN-λ偶联物，及其制备方法，以补充适用于治疗人类各种相应疾病的长效干扰素类药物，以适应不同患者及医者需求。发明概述本发明涉及一种多肽偶联物，所述多肽是III型干扰素(即干扰素λ )具体是一种 PEG-IFN- λ偶联物，通过硫醇反应使聚乙二醇(PEG)试剂与IFN-λ中的游离半胱氨酸残基反应获得特异性偶联物，所得产物中，PEG实现在游离半胱氨酸定点修饰，得到分子量均一的PEG-IFN-λ。较未PEG化的IFN-λ相比，所得的PEG-IFN-λ具有可溶性、稳定性提高、 免疫原性减弱，体外可保留天然IFN-λ约8%的活性，活性留存率较高，且其在体内与天然的IFN-λ比较，单位时间内的曲线下面积显著(AUC)增加、并具有更为长效的功能。具体地，本发明涉及1、多元醇-肽偶联物，所述偶联物包括
(a)多肽部分；和
(b)与该多肽部分共价相连的非多肽部分；
其中，所述多肽是具有与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5至少90%序列同一性的氨基酸序列，且所述多肽的序列上，至少存在一个游离的半胱氨酸残基，所述非多肽部分为多元醇，所述非多肽部分共价连接到所述多肽部分的游离半胱氨酸残基上。2、项1中所述的偶联物，其中所述的多元醇是聚乙二醇。
3、项2所述的偶联物，其中所述的聚乙二醇是直链或支链的聚乙二醇。4、项1中所述的偶联物，所述偶联物具有均一的分子量。5、一种制备项1-4中任意一项所述偶联物的方法，包括如下步骤用硫醇反应性多元醇剂和所述多肽反应，所述多肽具有单一游离的半胱氨酸酸残基，所述多元醇试剂和所述多肽的位点特异性共价结合，形成共价硫醚键，得到多元醇-多肽偶联物，回收纯化产生的目的多元醇-多肽偶联物，即得。6、项5所述的方法，其中所述硫醇反应性多元醇是硫醇反应性PEG化剂。7、项5或6所述的方法，所述的硫醇反应性多元醇剂是单甲氧基化的。8、项5或6所述的方法，其中所述的硫醇反应性多元醇是具有选自二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺的官能团的多元醇衍生物。9、项5或6所述的方法，所述的硫醇反应性多元醇剂的分子量为10-50 kDa ；项8 中的单甲氧基化的硫醇反应性多元醇剂的分子量为10-50 kDa。10、一种药物组合物，该组合物包括项1至4中任意一项所述偶联物作为活性成分，和药学上可接受的载体、赋形剂或辅料。其中所述偶联物是多元醇-多肽偶联物，更具体为多元醇-IFN-λ偶联物。11、项1至4中任意一项所述偶联物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。12、项10所述组合物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。13、一种预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症的犯法，包括给哺乳动物施用有效量的项1-4所述偶联物或项10所述的组合物。14、一种药物组合物，用于预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症，白组合物包括项1-4中所述偶联物，优选为PEG-IFN-λ偶联物，和其它用于具有预防和治疗病毒或增强机体免疫的药物。15、一种试剂盒，包含装有本发明所述偶联物或药物组合物的容器和使用所述偶联物或其药物组合物预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症的说明书。以上各项中，所述多元醇为聚乙二醇，其中聚乙二醇可以是直链或支链的聚乙二


图1为pET30a-IFN_ λ 1质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a_IFN_ λ 1质粒MfeI 单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN- λ 1质粒Mfel+iXoI双酶切产物，泳道3为DL2000 plus Marker0图2为pET30a-IFN_A 2质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a-IFN_A 2质粒MfeI 单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN- λ 2质粒Mfel+^bo/PI双酶切产物，泳道3为DL2000 plus Marker0图3为pET30a-IFN_X3质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a-IFN_X3质粒 Ndel单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN-λ 3质粒Mfel+Hindlll双酶切产物，泳道3为 DL2000 plus Marker。
图4为层析纯化后的IFN- λ电泳检测图(15%的Tricine-SDS-PAGE电泳)，其中泳道1、2、3分别为IFN- λ UIFN- λ 2和IFN- λ 3纯化后5 μ g样品电泳图；泳道4为低分子量蛋白质Marker。图5为IFN- λ mPEG10kDa-MAL修饰后的电泳检测图(1 ^SDS-PAGE电泳)，其中泳道 1、2、3分别为IFN-λ 1、IFN-X2和IFN-λ 3纯化后的10 μ g样品，泳道4为低分子量蛋白质 Marker0图6为IFN-λ mPE(i2(lkDa-0PSS修饰后的电泳检测图(U%SDS-PAGE电泳)，其中泳道 1、2、3分别为IFN- λ 1、IFN- λ 2和IFN- λ 3纯化后的8 μ g样品，泳道4为低分子量蛋白质 Marker0图7为IFN- λ在H印G2细胞中抗EMCV病毒效果图。图8为PEG修饰的IFN- λ在H印G2细胞中抗EMCV病毒的相对影响效果图。图9为PEG干扰素在H印G2细胞中抗HCV病毒RNA复制的效果图。发明详述
本发明的目的之一在于提供一种多元醇-多肽偶联物，该多元醇-多肽偶联物包括活性多肽部分，所述多肽是与SEQ ID N0:USEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，且在所述多肽序列上，保留具有至少一个游离的半胱氨酸残基；该多元醇-偶联物还包括共价连接在所述活性多肽上的非多肽部分，所述非多肽部分为多元醇， 非多肽部分的多元醇通过与活性多肽上的游离半胱氨酸残基特异性偶联，得到分子量均一的多元醇-多肽偶联物。本发明中，所述多肽序列，优选与SEQ ID N0:USEQ ID NO:3,SEQ ID N0:5具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，更优选为具有至少95%、或者更优选为具有至少97%、98%、 99%序列同一性的氨基酸序列。更为具体地，本发明提供了一种多元醇-IFN-λ偶联物，所述多元醇为聚乙二醇， 多元醇与IFN-λ上的游离半胱氨酸残基进行共价键合，实现多元醇在IFN-λ上定点修饰。 IFN-λ包括IFN-λ 1、IFN-λ 2和IFN-λ 3，分别对应的成熟氨基酸序列SEQ ID NO: USEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5，在这些λ干扰素中，均具有一个游离的半胱氨酸残基，比如IFN-λ 1 在其成熟氨基酸序列的第15为半胱氨酸Cys是游离的，IFN- λ 2和IFN- λ 3的成熟氨基酸序列的第48位半胱氨酸Cys是游离的，多元醇与这些游离的Cys可实现特异性偶联。IFN-λ，如本文所使用，指一种III型干扰素，可以从生物液中分离获得的，或用 DNA重组技术从原核或真核宿主细胞获得的人成纤维细胞干扰素，这些原核和真核宿主细胞包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、转基因动物、转基因植物、 昆虫细胞，人白细胞干扰素(或人成纤维细胞干扰素)包括但不限于其盐、功能性衍生物、前体和活性片段，规定其含有天然存在形式的半胱氨酸残基。本发明活性多肽IFN-λ，也可以是IFN-λ多肽类似物，这些类似物可以通过提供功能等效分子的取代、添加、或缺失来改变蛋白质序列而获得，如在本技术领域所公知的， 这些类似物用功能等效氨基酸残基代替原序列内的残基而改变序列，形成沉默改变，例如， 序列内的一个或多个氨基酸残基可以用类似极性的另一个或多个氨基酸加以取代，作为功能等效，形成沉默改变。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及蛋氨酸，极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、络氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺，带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明编码活性多肽IFN-λ的多核苷酸可以包括天然序列(S卩，内源性序列，编码IFN- λ成熟多肽或其它包括例如信号肽)，或可以包含变异体、或该序列的生物性或抗原性等效物。相对于天然多肽，多核苷酸变异体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，术语“变异体”还包括异源的同源基因，通常，IFN-λ变异体将保留所有、主要部分、或至少部分生物活性。在此使用的术语“多肽”可以表达为“蛋白质”或有“生理活性的蛋白质”。本文使用的术语“衍生物”，指以本文方法表达和回收的任何蛋白质变异体，这类变异体包括，但不限于，PEG化形式，二聚体或其它高级变异体、氨基酸变异体、融合蛋白、糖类的改变、磷酸化或在天然蛋白质中发现的其它附着基团，以及本文公开的任何其它变异体。术语“异构体”表示一种被遗传工程方法或其它方法修饰的生理活性蛋白，它具有原始的生理活性蛋白的主要功能，在此术语“修饰”至少在一个氨基酸序列中的取代、加成和缺失，包括为了偶联聚乙二醇而被半胱氨酸取代或与半胱氨酸加成，而且，这些修饰还包括半胱氨酸和聚乙二醇之间的化学反应而形成的共价键。术语“具有游离半胱氨酸残基的蛋白质”指任意含有2N+1个半胱氨酸残基的天然或重组蛋白肽，其中，N可以是0或任意整数。本发明中，术语“ IL-29，，和“ IFN- λ 1 ”可互换使用、“ IL-28A”和“ IFN- λ 2”可互换使用、“IL-28B”和“IFN-λ ”可互换使用；术语“IFN-λ ”可以同本发明多肽或蛋白或 III型干扰素互换使用，在本发明没有特别指明时，“IFN-λ ”是对“IFN-λ 1”、“IFN-X2”、 “IFN-λ 3”的统称。根据本发明，多元醇-IFN-λ偶联物中的多元醇分子可以是任何具有线性或支链的水溶性单-或双功能性聚环氧烷基，通常，多元醇是聚乙二醇(PEG)。然而，本领域技术人员将认识到也能合适的使用其它多元醇，例如丙三醇和聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。如本发明所用的术语“PEG”分子指包括但不限于，线性或分支PEG，甲氧基PEG，可水解或酶解PEG，侧基PEG、树枝聚物PEG，PEG和一个或多个多元醇共聚物，以及PEG和PLGA (聚乳酸-乙醇酸)共聚物。本发明中，“功能性衍生物”指能从存在于氨基酸分子侧链或末端N-C-基团的官能团根据已知方法制备的，并当其是药物学可接受时，亦即，当其不毁坏蛋白质活性或不授予含有它们的药物组合物毒性时包括在本发明中的衍生物。这种衍生物包含羧基的酯或脂肪酸，和自由氨基的N-酰基衍生物，或自由羟基的0-酰基衍生物，并通过酰基如链酰基-或芳酰基-基团形成。“前体”是在人或动物体内转化为IFN-λ的氨基酸序列。对蛋白质的“活性片段”，本发明指当这种片段或前体实现和药物相同的IFN-λ 活性时，单独或/和与其结合的相关分子或残基，例如蔗糖或磷酸残基，或多肽分子的聚合物联合的化合物本身多肽链的任何片段或前体。本发明还涉及一种对含有游离半胱氨酸残基的多肽进行均一 PEG化的方法，本发明的偶联物能用任何本领域已知的方法制备。根据本发明的一个实施例，将IFN-λ和PEG化剂在合适的溶剂中相接触反应，即可得到PEG-IFN-λ偶联物。一般来说，PEG化蛋白质和这些试剂的方法类似与 W09412219 (Cox 和 McDermott)和 W09422466 (Cox 和 Russell) 中所述的方法，并略加改良，本文引用这两篇文献以供参考。将含游离半胱氨酸的多肽或蛋白质与过量的“巯基化PEG”相接触(一般PEG:蛋白质或多肽的摩尔比为1:1、5:1、10:1、和 50:1)搅拌进行反应，反应条件中优选的温度是4°C到37°C ；优选的pH范围可以从6. 5到 9. 5，但更优选为7. 5到8. 5。使用SDS-PAGE测定分子量的改变可检测蛋白质的PEG化，一般认为产生大量单PEG化产物而不产生二 PEG化产物的PEG的最低量是最佳的(一般认为 80%转变成单PEG化产物是较好的)。用于附着本发明的半胱氨酸变异体以形成“PEG化”蛋白质的“PEG部分”包括任何合适的多聚体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是有环氧乙烷单元组成的合成多聚体，可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围大约为3，000-70，000 Da的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期。因此，可通过改变PEG部分的大小或结构来加工具有不同循环半衰期的蛋白变异体使之用于具体治疗应用或优选的剂量方案。如本申请所用的“巯基化反应性PEG化剂”指任何与半胱氨酸残基的巯醇基团反应的PEG衍生物，这些用于半胱氨酸残基修饰的反应性PEG末端基团，其包括但不限于二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰胺。PEG末端基团应对游离巯基具有特异性，实现单 PEG化。但在不损伤蛋白质的条件下发生反应。以其单-甲氧基化形式使用的PEG化剂，其中仅一个末端能被偶联。术语“单PEG化”定义为指通过单个PEG部分共价附着到蛋白质的特定位点而修饰的蛋白质。“单PEG化”方法可使用本领域的技术人员已知的任何方法，包括，但不限于， 例如，本发明实施例中所列举的方法。在本发明中，优选的巯基化剂为mPEG- 二硫对吡啶(mPEG_0PSS)或mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL)，分别具有如下结构


本发明涉及一种PEG化的III型干扰素，即PEG化干扰素λ，通过硫醇反应性聚乙二醇试剂与IFN-λ中的游离半胱氨酸残基实现定点修饰，得到均一的PEG-IFN-λ，本发明得到的PEG-IFN-λ，在体内可以至少保留原有IFN-λ的活性，并具有更长的半衰期。