通过皮肤的非侵入性接种制作方法

接种 侵入 皮肤 通过

本发明涉及预防或治疗接种目的用于非侵入性透皮给予和超级可变形性载体相连的抗原的新的疫苗该疫苗包含(a)一种透皮载体，该载体是以微小液滴形式悬浮或分散于水性溶剂中的穿透剂，该液滴被一层或数层具有聚集趋势的至少两种不同物质或物质的两种不同形式的膜状包衣包围，所述物质或物质形式在较佳的水性液体介质中的溶解度相差至少10倍，从而使溶解度较大的物质或物质形式的均相团聚体平均直径、或由所述两种物质或所述物质两种形式组成的非均相团聚体的平均直径小于溶解度较小的物质或物质形式的均相团聚体的平均直径，和/或其中溶解度较大的组分有使穿透性液滴增溶的趋势，且其中这些组分的含量高达使液滴增溶所需浓度的99％(摩尔)或对应于非增溶液滴的饱和浓度的99％(摩尔)，无论哪一个更高，和/或其中在膜状包衣周围的液滴的弹性变形能量比血红细胞或具有液体脂族链的磷脂双层低至少5倍，更佳的低至少10倍，理想的是低10倍以上；(b)特异性释放或诱导产生细胞因子或抗细胞因子活性或本身发挥该活性的化合物；和(c)抗原或变应原本发明还涉及哺乳动物的相应治疗性或预防性疫苗接种的方法在本说明书整个篇幅中引述了数篇文献本文引用的每一份文献(包括生产商说明书等)均纳入本文作为参考；然而，这并不是承认所有引用的文献的确是本发明的现有技术另外纳入本文作为参考的还有以IDEA AG名义提交的名称为“经鼻输送/用高适应性载体免疫”的待批申请的全部公开内容皮肤是微生物最容易接近的，但是由于角质层的存在，也最难进入体内皮肤角质层是进化产生的一种优化的屏障，它很象血管壁，因为它含有松弛的、紧密充塞的且横向重叠的细胞，从而使角质层中的基础细胞瓦片状基元重复20-30次而且，皮肤中细胞之间的接触部分被密集而组织良好的脂类混合物密封因此，角质层不仅保护生物体以防感染，而且还阻止通过皮肤有效地吸收抗原这一事实从过敏角度来看是有利的，但却使目前通过完整皮肤进行免疫或接种不能成功市场上任何透皮输药装置中最大的药物小于350Da(Cevc，G.“通过皮肤输送药物”，Exp.Opin.Invest.Drugs(1997)61887-1937)，因为只有这样的分子能通过皮肤中自身密封的细微孔后者在亲水性时宽度通常小于1纳米，或当呈疏水性时宽度更窄因此，诸如蠕虫等生物利用它们“钻孔”通过器官的生化机理来穿过皮肤进入体内皮肤中天然存在的微小损伤和支路(皮脂单位)也被可利用然而，它们仅占皮肤表面的0.1％-0.5％，因此对透皮输送没有很大贡献，但细菌通常利用该途径来进行局部感染(Strange，P.，Skov，L.Lisby，S.，Nielsen，P.L.，Baadsgard，O.″施加在完整的正常皮肤和特应性皮肤上的葡萄球菌肠毒素B引起皮炎″，Arch.Dermatol.(1996)13227-33)只有少数半抗原在皮肤上引起皮肤免疫应答这证实大量局部沉积的半抗原的足够小的分子能大量进入皮肤然后，这些半抗原首先刺激器官，最终可能引起过敏和接触性皮炎(Kondo，S.，Sauder，D.N“变应性接触性皮炎中的表皮细胞因子”J.Am.Acad.Dermato1.(1995)33786-800；Nasir，A.，Gaspari，A.A.“接触性皮炎，临床展望和基础机理”Clin.Rev.Allergy and Immunol.(1996)14151-184)对于低分子量化学物质或与皮肤刺激物(如皮肤渗透增强剂)组合的药物，该问题最严重(Cevc，1997，同上)大分子很少对皮肤有变应原性，因为它们通过该屏障的能力有限对高度免疫原性卵白蛋白(Wang，L-F.，Lin，J.-Y.，Hsieh，K，-H.，Lin，R.-H.“表皮接触蛋白质抗原在小鼠中主要诱导产生Th2样应答和IgE产生”J.Immunol.(1996)1564079-4082)或对霍乱毒素(Glenn，G.M.，Rao，M.Matyas，(1998)391851；Glenn，G.M.，Scharton-Karsten T，Vasell R，Mallet C.P.，Hale T.L.和Alving C.R.“用霍乱毒素透皮免疫保护小鼠抵抗致死性粘膜毒素攻击”，J.Immunol(1998)1613211-3214)的Th2应答只有在表皮(epicutanous)接触大量此类蛋白质后才有可能发生，而且相当弱而且，除去皮肤角质层是分别在96％或43％的表皮经处理的C57BL/6小鼠中产生针对编码人癌胚抗原或人GM-CSF基因的腺病毒的可检测量特异性抗体的先决条件(Deng，H，Qun，L.，Khavari，P.A.“可持续的皮肤基因输送”Nature Biotechnology(1997)151388-1390)至今未报道过针对上述或其它用于表皮的抗原的保护作用白喉毒素或破伤风毒素以及牛血清白蛋白(通过将抗原与霍乱毒素施加到BALB/c小鼠皮肤上产生(Glenn等人，1998同上))在没有佐剂时只能产生非常微弱的免疫应答抗体即使在加入霍乱毒素(CT)后，白喉及破伤风抗原的特异性抗体平均滴度也比霍乱毒素本身引起的分别低大约50倍和70-4000倍(取决于所包含的单个数据点)(Glenn，等人，1998，同上)对应的滴度绝对值分别为14±17和8±16；抗BSA滴度约为11±11(平均值±标准偏差，从公开的图计算出)这些低滴度没有预防或治疗效果，这表明简单的非侵入性疫苗接种途径并非是直截了当的同一研究组出版的最近的论文(Glenn等人，1998b)证实经鼻攻击后的抗CT保护作用，但不能得到通过透皮疫苗接种可获得保护力的结论较早的出版物报道了将蛋白质输送通过皮肤的方法，根据滴度判断，它比上述研究更有效高数个数量级，该方法采用了力学敏感的(mechanosensitive)和水敏感(hydrosensitive)的自调节性载体(Transfersomes)(综述见Ceve，1997，同上)对于强效抗原，其诱导的抗体滴度与皮下照射蛋白质引起的滴度相当；在BSA情况下，两种例子中的IgG滴度绝对值均约为200(Paul，A.，Cevc，G.“非侵入性给予蛋白质抗原，用牛血清白蛋白表皮免疫”Vaccine Res.(1995)4145-164)，对于间隙连接蛋白，测得滴度在15000-100000之间(Paul，A.，Ceve，G.，Bachhawat，B.K.“利用超变形药物载体用大的蛋白质透皮免疫”Eur.J.Immunol.(1995)253521-3524；Paul，A.，Cevc，G.，Bachhawat，B.K.“利用超变形药物载体Transfersomes用整合膜组分间隙连接蛋白来透皮免疫”Vaccine(1997)16188-195)另外，这些出版物中也没有表明产生了保护性免疫应答迄今已知，Th1或Th2细胞活性在免疫应答中起重要作用Th1细胞还在小鼠中主要促进细胞介导的免疫力、吞噬细胞介导的宿主防御，而且还产生抗原特异性IgG2a相反，Th2优先支持不依赖于吞噬细胞的宿主应答、IgG1、IgE和IgA免疫球蛋白的产生免疫应答的Th1或Th2基础(即Th细胞亚类的分化)不仅取决于细胞因子以及其它调节分子的活性(Luger，T.A.，Schwarz，T.“细胞因子和神经内分泌激素在皮肤免疫力和发炎中的作用”Allergy(1995)50292-302；Lohoff，M.，Gessner，M.，Bogdan，C.，Roellinghoff，M.“Th1/Th2示范和实验鼠立什曼病”Arch Allergy Immunol.(1998)115191-202)，而且抗原呈递细胞的性质和抗原用量也起着重要的作用几乎所有真核细胞都短时产生细胞因子并通过特异性细胞表面受体起作用实际上，皮肤中的每个细胞在适当刺激后都能释放出这样的(糖)蛋白因子或表达它们的受体大多数细胞因子是多能性的，能相互诱导或影响有关受体的表达这使得细胞因子在所谓的细胞因子级联反应框架中以协同、附加或拮抗方式起作用(Luger & Schwarz，1995；同上)不同细胞在皮肤上施加抗原后免疫激活中的作用还未被完全了解(Luger &Schwarz，1995；同上；Lohoff等人，1998，同上)认为在上基部皮肤区域中的朗格罕斯细胞在免疫呈递中起主要作用这些细胞首先结合并加工抗原，然后携带着消化的抗原从表皮迁移到淋巴管中，进而进入邻近的引流淋巴结中在该过程中，朗氏细胞经历了表型和功能上的改变，分化成(淋巴类)树突细胞，该树突细胞最终向通过内皮小静脉进入淋巴结的原初CD4+T细胞提供抗原相反，皮肤中的其它两种主要类型的抗原呈递细胞(巨噬细胞和B淋巴细胞)首先需要激活，以便呈递抗原和刺激T细胞抗体可通过小静脉内皮细胞呈递给T细胞，可能也可通过皮肤中的某些基底细胞呈递给T细胞例如，已知角质细胞可通过产生过多的促炎性细胞因子(包括IL-1α，GM-CSF和TNFα)加强局部炎症(Pastore，S.，Fanales-Belaso，E.，Abbanesi，C.，Chinni，L.M.，Giannetti，A.，Girolomoni，G.“在特应性皮炎中角质细胞过量产生粒细胞巨噬细胞集落刺激因子皮肤中树突细胞持续激活的暗示”J.Clin.Invest.(1997)993009-3017)角质细胞衍生的细胞因子对于朗氏细胞成熟变成强效抗原呈递细胞(Nasir & Gaspari，1996，同上)也非常关键角质细胞直接参与抗原呈递的程度还不知道(Kondo & Sauder，1995，同上)，但是角质细胞产生抑制性细胞因子(如IL-10，无功能的IL-12和TGFβ)是已知的事实(Nasir & Gaspari，1996，同上)皮肤中的成纤维细胞群也含有参与抗原呈递的细胞亚组例如，在硬皮病中，成纤维细胞的一个亚组受到炎性部位细胞因子选择性地募集(Fries，K.M.，Blieden，T.，Looney，R.J.，Sempowski，G.D.，Silvera，M.R.，Willis，R.A.，Phipps，R.P.“成纤维细胞异质性的证据和成纤维细胞亚群在纤维变性中的作用”Clin.Immuno.Immunopathol.(1994)72283-292)以前已有报道说，表皮施加抗原产生了与通过口腔或鼻常规给药途径不同的免疫应答例如，在皮肤表皮反复接触卵白蛋白后，产生了显著的抗卵白蛋白IgE(Wang等人，1996，同上)在皮肤上用牛血清白蛋白作为模型抗原，以前已经观察到有异常强烈的IgA产生(Paul等人，1997，同上)，但是至今还没有表皮抗原呈递详情与所致免疫应答之间相互关系的一致性描述有众多不同的细胞参与抵抗通过皮肤输送的大分子的免疫应答如上所述，目前采用的方法还没有建立起令人信服的产生保护性免疫应答的策略这可能是因为现有技术策略(如注射抗原)不能帮助仔细分析抗原施加到皮肤上所获得的免疫应答以设计出定向的保护性免疫应答例如，已知抗原注射(作为损伤或其它种类的皮肤干扰，包括存在化学刺激物)使皮肤(皮肤不仅是机体中最重的器官，而且也构成了机体免疫系统的主要部分)释放出各种细胞因子这使得皮肤免疫应答(该免疫应答对所用抗原的性质也敏感)的强度达到最大，但是阻止了对免疫应答的微调高冲击疫苗输送得益于该效果用超变形性载体将物质输送通过皮肤与所述高冲击输送方法正好相反，因为据报道它对皮肤没有影响认为这是由于这种水敏感性超变形体(也称为TransfersomesTM(Cevc，1997，同上)通过被调节成细胞形状的角质细胞(comeocyte)之间的“有效通道”穿透角质层(Sch?tzlein，A.，Ceve，G.“不均匀的角质层细胞堆积和完整皮肤的渗透屏障功能用高度可变形性载体(Transfersomes)的高分辨率共焦激光扫描显微镜研究”Br.J.Dermatol.(1998)138538-592)据称，Transfersomes在该过程中优先在最薄弱的接触处将皮肤中的细胞与细胞间脂质推开这样就产生了看上去平均约20-30纳米宽的通道它们覆盖了几个百分数(约4％)的皮肤表面(Sch?tzlein &Cevc，1998，同上)，相邻表面的引流未包括在内这比正常的支路面积(约0.1％)大得多，从而解释了与超变形性载体一起给予抗原(Paul & Cevc，1995，同上)或用霍乱毒素作为佐剂(Glenn等人，1998a，b，同上)后测得的抗BSA滴度之间量的差别载体在皮肤中打开的有效通道看来宽得足以使载体和它们结合的材料通过屏障而不明显干扰器官然而，用超变形性载体反复将胰岛素输送通过皮肤没有诱导出抗该蛋白质的抗体(Cevc，G.，Gebauer.D.，Sch?tzlein，A.Blume，G.“超柔性泡囊Transfersomes具有极低的渗透阻力，可将治疗量的胰岛素输送通过完整的哺乳动物皮肤”Biochim.Biophys.Acta(1998)1368201-215)因此，本发明背后的技术问题是建立一种方法来成功地诱导产生医学上有用的透皮免疫应答本文通过提供权利要求中定义的实施方案，解决了所述技术问题因此，本发明涉及一种透皮疫苗，它包含(a)一种透皮载体，该载体是以微小液滴形式悬浮或分散于水性溶剂中的穿透剂，该液滴被一层或数层具有聚集趋势的至少两种不同物质或物质的两种不同形式的膜状包衣包围，所述物质或物质形式在较佳的水性液体介质中的溶解度相差至少10倍，从而使溶解度较大的物质或物质形式的均相团聚体的平均直径、或由所述两种物质或所述物质两种形式组成的非均相团聚体的平均直径小于溶解度较小的物质的均相团聚体的平均直径，和/或其中溶解度较大的组分有使穿透性液滴增溶的趋势，且其中这些组分的含量高达使液滴增溶所需浓度的99％(摩尔)或对应于非增溶液滴的饱和浓度的99％(摩尔)，无论哪一个更高，和/或其中在膜状包衣周围的液滴的弹性变形能量比血红细胞或具有液体脂族链的磷脂双层低至少5倍，更佳的低至少10倍，理想的是低10倍以上；(b)特异性释放或特异性诱导产生具有细胞因子或抗细胞因子活性的分子或发挥这种活性的化合物，两种任一均产生了所需的医学上有用的免疫应答；和(c)抗原、变应原、抗原混合物和/或变应原混合物对于上述高达99％的数值，应注意通常采用低于前一相对浓度的50％的数值更佳的是选择低于40相对％或甚至大约30相对％及以下的数值，而对于不能用溶解度较高的组分来增溶的液滴，相对浓度宜超过上述浓度2倍在本发明中，术语“病原体”指其存在于机体内或机体上将导致或促进病理状态而该病理状态理论上是可受控或受益于预防性、治疗性或辅助性免疫治疗的病原体它包括导致微生物疾病的病原体，如胞外细菌，包括形成脓的球菌，如葡萄球菌属和链球菌属、革兰阴性菌如脑膜炎球菌和淋球菌属、奈瑟氏菌属、革兰阴性菌，包括肠微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、白喉杆菌、百日咳博德特氏菌和革兰阳性菌(如鼠疫耶尔森氏菌，BCG)，尤其是厌氧菌，如梭菌属(破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、诺氏梭菌、腐烂梭菌)；在宿主细胞内存活并复制的许多细菌和所有病毒；后一类包括分支杆菌(如结核杆菌)和单核细胞增生李斯特菌，逆转录病毒和腺病毒，包括但不局限于肝炎病毒、(人)免疫缺陷病毒、疱疹病毒、天花(禽痘)、流感、麻疹、腮腺炎和脊髓灰质炎病毒、巨细胞病毒、鼻病毒等，在宿主细胞内繁殖的各种真菌；寄生虫，包括动物寄生虫，如原生动物和蠕虫，以及外寄生物，如蜱和螨病原体还包括布鲁氏菌属(如马尔他布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、木鼠布鲁氏菌、羊布鲁氏菌)、霍乱病原体(例如霍乱弧菌)、嗜血菌属如伴放线菌素嗜血菌、大叶性肺炎嗜血菌以及引发副伤寒、鼠疫、狂犬病、破伤风和风疹疾病的病原体本发明中的病原体另外假定还包括，但不局限于，引起动物或人体各种肿瘤形成、自身免疫疾病和其它病理学状况(并非由微生物感染引起)的真核细胞或其部分某些病原体部分，尤其是各种微生物毒素，具有孔蛋白样性质，因此具有一定的通过粘膜或增加穿透剂膜柔性的能力与“释放”或“诱导”联合的术语“特异性”指化合物与能释放细胞因子的细胞相互作用，通过受体介导触发该细胞因子释放或诱导特异性释放或诱导与非特异性释放或诱导(例如皮内注射获得)相反在本发明中，术语“变应原”用来描述内源或异源、动物或植物来源的物质，该物质导致接触该变应原的机体产生不良的免疫应答，通常是产生急性过敏反应变应性微生物或其部分(如螨的部分)、植物部分(例如花粉)或动物部分(毛发和皮屑)，以及人造的和无机物质属于该类另一方面，几乎人体的每一部分，如果受到机体免疫系统的不正确加工或接触，会产生自身免疫应答反应，并对该物质产生变应性反应在采用较窄的解释时，变应原是在体内引起速发型过敏反应的物质、一类或一系列物质，这些反应可通过免疫治疗来减少或消除，无论是否非侵入性通过皮肤本发明中术语“(治疗性)疫苗接种”描述了任何类型的治疗性疫苗接种，无论是在患病后为改善临床状况而进行，还是出于预防疾病的目的而进行该疫苗接种可涉及单次或反复给予本发明疫苗治疗性接种预防病理学状况和/或改善临床状况当用作预防制剂时，它通常会产生保护性免疫应答免疫接种指任何类型的激发免疫应答反应的方法，而不论所述应答是否是治疗性的“抗体”或“免疫球蛋白”指IgA，IgD，IgE，IgG或IgM，包括其所有亚型，如IgA1和IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4它们的“衍生物”包括可用化学、生物化学和其它方式获得的衍生物，如基因工程改造的抗体衍生物片段例如包括单链片段、Fc-、Fab-、F(ab)′2-和Ig的其它部分，而不论它们是内源、异源、(半)合成还是重组的本发明还包括两种或多种上述抗体、衍生物或片段的复合物“抗原”是天然形式的或片段化或衍生处理后病原体或变应原的一部分更通常的，术语“抗原”指大分子或其片段，任何半抗原部分(例如简单的碳水化合物、复杂的碳水化合物、多糖、脱氧核糖核酸)，简言之，是当给予机体时可被机体抗体所有组分识别且可能会诱导产生抗体的任何分子本发明中术语“抗原混合物和/或变应原混合物”指至少两种抗原或变应原的组合预计包含至少一个抗原和至少一个变应原的抗原与变应原的混合物也可用于本发明本发明所用的术语“细胞因子”指细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18和它们的所有的亚型如IL-1α和IL-1β，肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF-β和-α)、I型和II型干扰素(IFN-α1，IFN-α2，(IFN-ω)、IFN-β、IFN-γ)、迁移抑制因子MIF、c-kit配体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、趋化因子等以及这些分子的所有功能性衍生物能非常好地介导天然免疫力的细胞因子包括I型干扰素(IFN-α和IFN-β)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-1(IL-1α和IL-1β)、白介素-6(IL-6)和吸引和激活白细胞的趋化因子该过程依赖于其中的抗增殖(例如IFN-s)、促炎(例如TNF，IL-1)或协同刺激(例如IL-6)作用介导淋巴细胞激活、生长和分化的最佳的细胞因子包括白介素2(IL-2)、白介素-4(IL-4)和转化生长因子(TGF)因此，这些细胞因子不仅能影响靶标的生长，而且还影响到最终可能会在治疗中起作用的细胞的激活和其它细胞因子的产生非常依赖细胞介导应答的介导免疫性炎症的细胞因子是γ干扰素(IFN-γ)、淋巴毒素(TNF-β)、白介素-10(IL-10)、白介素-5(IL-5)、白介素-12(IL-12)，可能还有迁移抑制因子白细胞生长和分化最受白介素-3(IL-3)、c-kit配体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞或粒细胞集落刺激因子(M-CSF或G-CSF)以及白介素-7(IL-7)的影响本文的术语“免疫佐剂”用于描述能支持、增强、刺激、激活、强化或调节所需的细胞或体液免疫应答(尤其是在预防中增强任何种类的抗原特异性免疫应答，以及在治疗中经常支持细胞介导免疫力)的物质这可通过以下方式来实现，加入合适的细胞因子、其混合物或拮抗剂，或较间接地用化学物质刺激皮肤(该化学物质直接或间接使皮肤或其它涉及的外周组织释放细胞因子)，或催化或加速组织中细胞因子的生物合成然后产生该作用，只要最终结果是提高了疫苗接种成功率，即所用抗原有预防和/或治疗作用对有用的细胞因子库有间接贡献的免疫佐剂种类，包括具有变应原潜力的小的化学物质，如某些变应原性(金属)离子，包括但不局限于LiCl、HgCl2、钼(molibdenum)、酸、碱和其它刺激性化合物，如二环己基甲烷-4，4′-二异氰酸酯、ditrocarb(二乙基二硫代氨基甲酸酯)、2，4-二硝基氯苯、异丙肌苷、异佛尔酮-二异氰酸酯、左旋咪唑、(苯基)噁唑酮等，Swansonine、西左伏兰(sizofran)、苯二甲酸酐、胸腺生成素(thymopentin)、(脂肪)醇、(脂肪)胺、(脂肪)醚、蓖麻蛋白或其它合适的两亲物，众多表面活性剂和化学皮肤渗透增强剂，以及它们的衍生物或组合物；另外还有(低分子量的)微生物的片段和衍生物，包括脂多糖(如LPS)、索状因子(海藻糖-二霉菌酸酯)和其它膜结合多糖(当用量充足时)，乙酰基胞壁酰-丙氨酰-异谷氨酰胺和较大的微生物片段，包括细菌外毒素和内毒素或肠毒素，如霍乱毒素和大肠杆菌的不耐热毒素(HLT)，及其大分子片段，如A-链衍生物(其大部分(如果不是全部的话)看上去具有ADP-核糖基化活性)，高效免疫佐剂LT全毒素等，细胞壁骨架、减毒细菌如BCG等较不熟知的例子包括梭菌毒素、纯化的结核杆菌蛋白质衍生物、LT-R192G、酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白I、B型脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(GBOMP)、其它各种肽聚糖等换句话说，免疫佐剂包括能改变抗原摄入或呈递、激活或增强抗原特异性淋巴细胞的增殖、或干扰免疫应答中占优势控制机制的分子(不仅在皮肤中，而且在其它免疫活性组织中)(ADP-核糖基化细菌肠毒素的粘膜佐剂活性是一个已经确定的已知例子)另一方面，能改变细胞因子的(相对)浓度的分子或其它免疫佐剂，如抗免疫佐剂抗体或免疫佐剂的激动剂或拮抗剂也是本发明意义中的免疫佐剂对于影响淋巴细胞归巢的分子(如各种选择蛋白(LECAMS如各种CD62-s)、GlyCAM-1、MaDCAM-1、VCAM-1、ICAM-1、透明质酸等)以及其它趋化因子(如RANTES或MCP-1)也是如此内源型免疫佐剂还包含组胺、转移因子、吞噬作用激素等由于许多上述免疫佐剂在以太低、有时太高的浓度或其本身非侵入性免疫接种后没有足够的能力确保所需效果，本文所用佐剂的功能定义包括，对细胞因子浓度和其体内的分布方式更充分地调节导致产生所需的治疗性或预防性免疫应答如果需要弄清楚，例如可在测定特定细胞因子水平的实验中确定所述调节及其程度“免疫辅助操作”指对皮肤的非化学处理，例如对皮肤摩擦、挤压、加热，接触电或力，例如超声、场等，或将非免疫原性制剂注射入皮肤中，只要该处理使皮肤或其它外周有免疫活性的组织释放免疫辅助性化合物，或减少针对所需接种的拮抗剂的作用浓度/作用时间然而，根据本发明，“免疫辅助操作”也指用免疫调节剂和/或细胞因子和/或细胞因子释放因子(尤其是组胺)预处理皮肤术语“免疫原”指能诱导产生免疫应答的与免疫学载体偶联的半抗原或不含载体或与载体结合的抗原“免疫耐受性”指没有针对抗原的不希望的免疫应答(更通常的是减少)Th1(T辅助细胞I型)涉及的抗体包括IgG2a，IgG2b和IgG3Th2(T辅助细胞II型)涉及的抗体包括IgG1类、IgG4类和IgE类本发明中的术语“物质的两种形式”指同一物质的两种离子化状态或盐形式，该物质的两种不同的复合物等“非侵入性给药”或“非侵入性输送”指在生物学施药时施加或输送通过完整的屏障，在本文中是通过完整的皮肤“穿透”描述了相当大的物质通过屏障的非扩散性运动该过程通常依赖于穿透剂改变屏障中禁闭的孔，而且还可能涉及引起屏障阻力下降的穿透，例如孔变宽或通道打开；然而，该过程并不主要取决于通过屏障的穿透剂浓度梯度“渗透”指通过半渗透屏障的扩散性运动其主要例子是分子或分子团聚体在渗透性物质浓度梯度影响下输送通过屏障因此，穿透剂是包含一种或一系列分子的物质，这些分子大得不能渗透通过屏障，但是却能靠穿透剂改变屏障的禁闭通道(孔)的形状和/或直径的能力(即适应性)而通过屏障该改变能力可从例如以下事实看出比孔径大两倍的穿透剂可通过双层但不变成孔径大小的片段另一方面，穿透剂是能渗透通过半透屏障(如皮肤)的物质外场中的穿透剂所受推动力与穿透剂的标称大小以及施加的场(该场可天然存在)成比例在完整的未堵塞皮肤上的这种力被认为源于横跨角质层的水浓度梯度，如果该力强度足以使穿透剂变形或/和使屏障中通道变宽从而避免体积排斥，则该力可使穿透剂运动通过屏障(包括皮肤)至于进一步的定义，尤其是关于穿透剂的复杂的体变形性、相应的作用机理、感兴趣的穿透剂组分或所选试剂的清单，参见以下授权的或待批的专利(DE 41 07 152，PCT/EP91/01596，PCT/EP96/04526，DE4447287)关于生产过程以及穿透剂与抗原性(大)分子和/或免疫佐剂(它们太大而不能渗透通过屏障)一起加载的详细信息，可在国际专利申请PCT/EP98/06750中找到在形成载体的聚集性物质中溶解度较低的通常是脂质或脂质类物质，尤其是极性脂质，而在悬浮液中有较高溶解度且增加液滴适应性的物质是表面活性剂或具有表面活性剂类似性质前一组分通常是来自生物来源的脂质或脂质类物质，或是相应的合成的脂质或经修饰的脂质，这些脂质通常属于具有以下化学式的纯的磷脂类 其中R1和R2是脂族链，通常是C10-20-酰基或烷基，或部分不饱和的脂肪酸残基，具体是油酰基、棕榈油酰基、反油酰基、亚油烯基、亚麻基(linolenyl)、亚麻酰基、花生四烯酰基、牛痘基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基和硬脂酰基链，其中R3是氢、2-三甲基氨基-1-乙基、2-氨基-1-乙基、C1-4烷基、羧基取代的C1-5烷基、羟基取代C2-5烷基、羧基和羟基取代的C2-5烷基、或羧基和氨基取代的C2-5烷基，以及氨基、环己六醇、鞘氨基醇或所述物质的盐，所述脂质还包含甘油酯、类异戊二烯脂质、类固醇、硬脂酸精或甾醇、含硫或糖脂质、或任何其它形成双层的脂质，尤其是半质子化液态脂肪酸、较佳的选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂或其它鞘磷脂、鞘糖脂(包括脑苷脂、神经酰胺己多糖、硫苷脂、鞘缩醛磷脂)、神经节苷脂或其它糖脂或合成脂质，尤其是相应的鞘氨醇衍生物，或其它糖脂，其中两条相同或不同的链可以与骨架酯化(在二酰基和二链烯酰基化合物中)，或以醚碱与骨架相连(如在二烷基脂质中)所用表面活性剂通常是非离子型、两性离子型、阴离子型或阳离子型，尤其是脂肪酸或脂肪醇，烷基-三/二/甲基-铵盐，烷基硫酸盐，胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺胆酸等的单价盐，酰基或烷酰基-二甲基-氨基氧化物(aminoxide)(尤其是十二烷基-二甲基-氨基氧化物)，烷基或烷酰基-N-甲基葡糖酰胺，N-烷基-N，N-二甲基甘氨酸，3-(酰基二甲基氨)-链烷磺酸盐，N-酰基-磺基甜菜碱，聚乙二醇-辛基苯基醚(尤其是九乙二醇-辛基苯基醚)，聚乙烯-酰基醚(尤其是九乙烯-十二烷基醚)、聚乙二醇-异酰基醚(尤其是八乙二醇-异十三烷基醚)、聚乙烯-酰基醚(尤其是八乙烯十二烷基醚)、聚乙二醇-缩水山梨糖醇-酰基醚(如聚乙二醇-20-单月桂酸酯(Tween 20)，或聚乙二醇-20-缩水山梨糖醇-单油酸酯(Tween 80))、聚羟乙烯-酰基醚(尤其是聚羟乙烯-月桂酰基、-肉豆蔻酰基、-十六烷基硬脂酰基或-油酰基醚)，如聚羟基乙烯-4或6或8或10或12等月桂酰基醚(Brij系列)，或相应的酯，如聚羟乙烯-8-硬脂酸酯(Myri45)、肉豆蔻酸酯、月桂酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、棕榈油酸酯或油酸酯型，或多乙氧基化的蓖麻油40，缩水山梨糖醇-单烷基化物(例如Arlacel或Span)(尤其是缩水山梨糖醇-单月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、棕榈油酸酯或油酸酯)，酰基或烷酰基-N-甲基葡糖酰胺(尤其是癸酰基或月桂酰基-N-甲基葡糖酰胺)，烷基硫酸盐(如月桂酰基、肉豆寇酰基、棕榈酰基、油酰基、棕榈油酰基、亚油酰基、亚麻酰基、牛痘基或反油酰基硫酸盐)，脱氧胆酸钠，甘氨脱氧胆酸钠，油酸钠，酒石酸钠，优先具有上述脂族链的脂肪酸，溶血磷脂(如正十八烯(＝油酰基)-甘油磷脂酸、-磷酸甘油或-磷酸丝氨酸)，正-酰基-(例如月桂酰基、肉豆寇酰基、棕榈酰基、油酰基、棕榈油酰基、反油酰基、牛痘酰基、亚油酰基、亚麻酰基)-甘油磷脂酸、-磷酸甘油或-磷酸丝氨酸，或相应的短双链磷脂，如十二烷基磷脂酰胆碱或有表面活性的多肽然而，重要的是应认识到，极性脂质与其它两亲性物质的复合物通常会在载体包衣中起表面活性剂作用，且不同的离子化或盐状态的极性脂质的性质相差很大因此，很显然，在膜中一起混合的同一(极性)脂质的两种不同物理化学状态将产生使本项工作条件满意的高度可变形的载体关于磷脂悬浮液的更通常信息可在《脂质体》手册(Gregoriadis，G.，Hrsg.，CRCPress，Boca Raton，FI.，1-3卷，1987)、《作为药物载体的脂质体》(Gregoriadis，G.，Hrsg.，John Wiley & Sons，New York，1988)或实验室手册《脂质体实践方法》(New，R.，Oxford-Press，1989)中找到常规用于制备生物相容的免疫穿透剂的磷脂性质综述见《磷脂手册》(Cevc，G.，编，Dekker，New York，1995)在配制制剂后或应用之前可方便地调节制剂的pH值该调节应能防止单个系统成分和/或药物载体在初始pH条件下的劣化而不损害生理相容性为了中和穿透剂悬浮液，可以采用生物相容的酸或碱来配制pH值在3-12之间(通常在5-9之间，更经常的在6-8之间)的缓冲液生理上可接受的酸例如是无机酸(如盐酸、硫酸或磷酸)或有机酸(如羧基链烷酸如乙酸)的稀释水溶液生理上可接受的碱例如是稀氢氧化钠、适当离子化的磷酸等如果需要，免疫原悬浮液可以在应用前进行稀释或浓缩(例如通过超离心或超滤)；此时或在此之前悬浮液中还可加入添加剂添加剂通常选自使配方对环境应力敏感性减少的物质，包括杀微生物剂、抗氧化剂、不希望的酶作用的拮抗剂，冷冻防护剂、增稠剂等然而，在任何系统操作后，都应当检查载体特征，如果需要，可重新调节本发明惊奇地发现，与本文所述的超变形性脂质团聚体结合的大分子抗原(免疫穿透剂)能通过人工的多孔屏障以及皮肤，尽管所述穿透剂的平均直径超过屏障的平均孔/通道直径，而且该免疫穿透剂能引发治疗性或预防性免疫应答，只要所述免疫穿透剂与表现出细胞因子活性或能诱导皮肤和/或其它免疫活性器官产生和/或释放细胞因子的化合物结合或者，所述化合物能拮抗细胞因子活性后一实施方案通过阻断其它途径有利地将免疫应答导向Th1或Th2依赖型免疫应答本文所述的抗原载体在该过程之前和期间维持了足够的稳定性另外，惊奇地发现所产生的免疫应答与施加剂量不成正比，这暗示可以改变抗原的量应对所述量进行仔细选择以获得最优效果抗原最适量或最适范围的选择是本领域技术人员在阅读了本说明书后力所能及的本发明疫苗中用作载体的至少两组分免疫团聚体有高度可变形的优点，更通常的是具有非常柔软的膜的泡囊形式尽管这些载体在以前已在免疫程序中采用过，但是出人意料的是以前所假定的载体免疫辅助性没能消除加入细胞因子活性化合物或合适拮抗剂(较佳的是IL-4、IL-10、TGF-β、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13)的需要；或在T细胞受体预先刺激后，还加入IL-1以便获得所需的保护性免疫应答同样，宜加入IL-12、IFN-γ和淋巴毒素(LT或TNF-β)来促进Th1应答，从而有利于细胞介导的免疫应答，并提供治疗病毒和其它寄生虫疾病或促进免疫耐受性的方法例如，加入IFNγ、IL-12和抗IL-4的组合物或单单加入IL-12预计会将Th2型应答变成Th1型更广地说，在穿透剂介导的免疫接种的情况下，提议在免疫应答开始时增加IL-12和IL-4的相对量(有利于前者)可用来促进Th1应答，反之，IL-2将支持NK和B细胞生长，以刺激抗体合成，并在总体上影响T细胞依赖性免疫应答的强度因此，尽管现有技术描述了用合适的载体与抗原以及任选的免疫佐剂组合可诱导产生抗体滴度，但是所得的免疫应答未表现出保护性本发明的一个特别的好处是因为惊奇地发现本发明所述穿透剂的转移不会导致皮肤中细胞因子组成的实质性失调换句话说，这些载体输送通过皮肤本身不会诱导产生细胞因子释放因此，现在可以进行研究，将能特异性诱导皮肤(或有能力释放细胞因子的其它器官)细胞释放细胞因子的化合物加入本发明的疫苗中，未引发所需的免疫应答这样就可对所需的免疫应答进行微调或者，可在本发明疫苗中加入具有或能发挥细胞因子活性的化合物另外，可采用特异性防止这类细胞因子作用的细胞因子活性拮抗剂在该实施方案中，宜将免疫应答导向Th1或Th2途径重要的是要注意，这些化合物特异性地诱导或释放细胞因子依赖于抗原性质因此，它们与本发明中非特异性且广泛支持免疫应答的佐剂不同总之，应用本发明的疫苗可以微调所需的对给定抗原的免疫应答(当然，抗原特性也起一定作用)该免疫应答可用例如佐剂触发的非特异性免疫应答来增强与仅用注射疫苗的现有技术相比，微调免疫应答的选择自由特别有好处，因为注射过程本身严重地非特异性地干扰了皮肤中细胞因子的相对浓度对上述标准加以考虑不仅为向皮肤细胞以及外周免疫系统的合适类型的免疫呈递提供了基础(通过载体)，而且也确保这种免疫加工在将体内主要产生抗原中和性抗据，再用该曲线来进一步优化制剂或下一步应用其核心是测定免疫穿透剂通过明确屏障中孔的流动量与横跨屏障的合适的推动力或压力的函数关系，并根据不同数据组的比较结果以特征曲线形式对所得数据进行分析，该特征曲线可用于进一步优化配方或下一步应用这包括与已知能穿透皮肤的无免疫原穿透剂悬浮液的结果(例如由Cevc等人(1998，同上)报道)比较在一个补充的较佳方案中，测试免疫调节剂或免疫调节程序的各种组合(主要是Th1或Th2有关的细胞因子产生)，然后用这些结果来适当选择最终的治疗或预防应用疫苗接种通常在室温下进行，但是较低或较高的温度也是适合的这对于含有在室温和皮肤或其它屏障温度之间呈刚性的合成物质的制剂特别有意义生产温度通常在0-95℃范围内选择较佳的，在10-70℃的温度范围内，更经常的在15℃-45℃之间，在所有情况下，该温度均低于重要的配方组分发生不可逆的组成或物理状态变化的温度其它温度范围也有可能，然而，最明显的是含有可冷冻或非挥发性组分的系统、低温或加热稳定的配方等如果需要维持系统个别组分的完整性和所需性质，载体配方可与或不与所连接的抗原一起冷藏(例如在4℃下)在惰性气体(如氮气)下生产和保藏是可以的，有时是敏感的利用只有少量双键的物质(即利用低的不饱和度)，通过加入抗氧化剂、螯合剂和其它稳定化剂，或通过制备特别的免疫穿透剂或从冷冻干燥或干燥的混合物原位制得，也可延长免疫原制剂的使用期在本发明疫苗的较佳实施方案中，采用了特异性释放或特异性诱导产生具有细胞因子或抗细胞因子活性的化合物以及将抗原与穿透剂结合在本发明疫苗的另一较佳实施方案中，溶解度较低的自聚集性分子是极性脂质，溶解度较高的组分是表面活性剂或类似于表面活性剂的分子，或是出于本发明目的有足够溶解度的极性脂质形式在本发明疫苗的另一较佳实施方案中，穿透剂的平均直径在30-500纳米之间，较佳的在40-250纳米之间，更佳的在50-200纳米之间，特别佳的在60-150纳米之间在另一个较佳的实施方案中，本发明涉及一种疫苗，其中人或动物皮肤用的制剂中的液滴总重量为总重量的0.01-40重量％，特别是在0.1-30重量％之间，更佳的在5-20重量％之间在本发明疫苗的另一个较佳实施方案中，抗原总浓度为穿透剂总重量的0.001-40重量％，特别在0.01-30重量％之间，更佳的在0.1-20重量％之间，最佳的在0.5-10重量％之间在本发明疫苗的另一个较佳实施方案中，该制剂还包含(da)低分子量化学刺激剂体，将引发细胞介导的免疫应答，或将导致逐渐产生针对该抗原的耐受性或特异性促进细胞介导的免疫力本发明还发现，非侵入性透皮疫苗接种受免疫穿透剂(抗原载体)组合物的影响很大采用不同纯度的抗原出人意料地导致大大不同的免疫应答这反映在总滴度相似的生物体诱导了不同水平的保护力的观察结果中，这可能是因为最终的抗原同种型方式不同而致另外，加入常规的低分子量免疫佐剂单磷酸脂质A不仅使表皮免疫结果更可靠(以前的出版物中记载所测抗体滴度的标准偏差更小)而且与以前在小鼠中获得的经验相反，在免疫载体中采用该免疫佐剂还出人意料地增加了IgG2b的分泌(比IgG2a低)，但不增强IgA的产生由于IgG1(它是Th1样免疫球蛋白)的存在据推断对抵抗破伤风毒素的保护作用(至少在小鼠中)是必需的，因此首次揭示了脂质A或细菌抗原的作用对于本发明公开内容的未来医学和商业上的用途，重要的是要认识到高(特异性)抗体滴度不一定意味着良好的保护结果；为了获得所需和充分的保护作用，需要有恰当种类和相当量的某些抗体同种型，从而提供占优势的Th1或Th2型免疫应答(见以前的讨论)(视情况而定)适合获得所需目的的基础配方是本领域已知的；更详细的或补充的信息例如参见DE 41 07 152，PCT/EP91/01596，PCT/EP96/04526，DE 44 47 287本发明的疫苗不仅仅用于预防性或治疗性疫苗接种，而且还适用于治疗过敏和获得抵抗微生物(包括在人和兽医中的胞外和胞内细菌、病毒和寄生虫)的免疫力通过与上述穿透剂结合，可将抗原(如免疫活性物质)以和渗透剂的物理或化学复合物的形式转运通过屏障为了从皮肤中的细胞因子库得到好处，提议特别有用的疫苗接种方法是先用上述免疫辅助操作预处理器官，然后将免疫原施加到皮肤上特别好地是利用对贴剂评价的上述局部免疫应答的读数，优化进一步给予变应原的细节和过程，从而积极地影响治疗性或预防性疫苗接种的结果认为这样的方法可用来很好地达到或改善受测试对象对所施加变应原的免疫耐受性如果首次免疫采用侵入性方法(通常用皮下注射或其它一些合适的刺穿/破坏皮肤屏障的方法)，则预计可获得高水平的IgM，但是随后的加强免疫可用本发明所述的非侵入性方法来进行最后，提出几种优化方法，这些方法可根据高度可变形性穿透剂来改善免疫原和疫苗接种较佳的一种方法是测定结合了免疫原的穿透剂通过明确屏障中各个孔的流通量与横跨该屏障的合适的推动力或压力的函数关系，然后用特征性曲线来描述数和/或(db)来自病原体的低分子量化合物或其片段或衍生物在本发明疫苗的还有一个较佳实施方案中，发挥细胞因子活性的化合物是IL-4，IL-3，IL-2，TGF，IL-6，IL-7，TNF，IL-1α和/或IL-1β，I型干扰素，较佳的是IFN-α或IFN-β、IL-12、IFN-γ、TNF-β、IL-5或IL-10在本发明疫苗的更佳的实施方案中，具有抗细胞因子活性的化合物是抗细胞因子抗体或其对应的活性片段、衍生物或类似物本文中的术语“活性片段或衍生物”指所用物质基本上维持或模拟了上述活性在本发明疫苗的另一较佳实施方案中，抗原衍生自病原体在本发明疫苗的另一特别佳的实施方案中，所述病原体选自胞外细菌，包括形成脓的球菌，如葡萄球菌和链球菌、革兰阴性菌如脑膜炎球菌和淋球菌属、奈瑟氏菌属、革兰阴性菌，包括肠微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、白喉杆菌、百日咳博德特氏菌和革兰阳性菌(如鼠疫耶尔森氏菌，BCG)，尤其是厌氧菌，如梭菌属(破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、诺氏梭菌、腐烂梭菌)；在宿主细胞内存活并复制的细菌和病毒，包括分支杆菌(如结核杆菌)和单核细胞增生李斯特菌，逆转录病毒和腺病毒，包括但不局限于肝炎病毒、(人)免疫缺陷病毒、疱疹病毒、天花(禽痘)、流感、麻疹、腮腺炎和脊髓灰质炎病毒、巨细胞病毒、鼻病毒等，在宿主细胞内繁殖的真菌，寄生虫，包括动物寄生虫，如原生动物和蠕虫，以及外寄生物，如蜱和螨，或布鲁氏菌属(如马尔他布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、木鼠布鲁氏菌、羊布鲁氏菌)、霍乱病原体(如霍乱弧菌)、嗜血菌属如伴放线菌素嗜血菌、大叶性肺炎嗜血菌和引发副伤寒、鼠疫、狂犬病、破伤风和风疹疾病的病原体，引起动物或人体肿瘤形成、自身免疫疾病和其它病理学状况(不一定由微生物感染引起)的病原体在本发明疫苗的较佳实施方案中，变应原是内源或异源的、微生物、动物或植物来源的物质，该物质导致接触该变应原的机体产生急性过敏反应，许多这样的变应原来自螨、花粉、动物毛发或皮屑，或是人造的和/或刺激性无机物质，或是未经机体免疫系统正确加工或与其接触的人体部分或组分在本发明疫苗的另一较佳实施方案中，选择每一个具有细胞因子活性的化合物的所用浓度，使其比用所选抗原和免疫佐剂一起通过皮下注射所测试的或体外测试所确定的最适浓度高1000倍，较佳的高100倍，更通常的高50倍，还要佳的是高20倍在本发明疫苗的不同的较佳实施方案中，病原体提取物或化合物是脂多糖、索状因子(海藻糖-二霉菌酸酯)、胞壁酰二肽、或其它与病原体膜免疫学活性部分相同或相似的(多)糖或(多)肽；病原体提取物，包括细菌外毒素和内毒素，较佳的是霍乱毒素或大肠杆菌的不耐热毒素(HLT)，A-链衍生物(具有ADP-核糖基化活性的组分)，肽聚糖、梭菌毒素、纯化的结核杆菌蛋白质衍生物、LT-R192G、酿脓链球菌的纤连蛋白结合蛋白I、B型脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(GBOMP)或细菌或病毒核酸，如含有非甲基化CpG二核苷酸的寡核苷酸在本发明特别佳的实施方案中，所述脂多糖是脂质A或其衍生物和修饰物，如单磷酸脂质A或其类似物，如蔗糖的脂肪衍生物在本发明疫苗的另一特别佳的实施方案中，衍生自病原体的病原体化合物的浓度比采用类似抗原的相应的注射剂所用浓度低10倍到高1000倍之间，更通常的，表皮给予的免疫佐剂浓度与注射的免疫佐剂浓度相差0.5-100倍，更佳的相差1-50倍，最佳的相差2-25倍在本发明疫苗的还有一个较佳实施方案中，低分子量刺激剂选自变应原性金属离子、酸、碱、刺激性液体、(脂肪)醇、(脂肪)胺、(脂肪)醚、(脂肪)磺酸盐、磷酸盐等，或其它合适的溶剂或两亲物，或选自通常能增强皮肤渗透的表面活性剂类似分子，及其衍生物或组合物在本发明疫苗的较佳实施方案中，选择低分子量刺激剂的浓度，使其比在相同或相当对象上进行独立测试时因局部刺激(经常用于测试刺激剂的方法和标准品测得)而被认为不能接受的浓度低至少2倍，更通常的低5倍，还要佳的低10倍或更多在本发明疫苗的另一个特别佳的实施方案中，变应原属于吸入变应原类，包括各种花粉、孢子、少量动物毛发、皮肤、羽毛、天然或合成的织物、小麦、(房间)灰尘，包括螨；食物和药物变应原；接触变应原；注射、侵入性和贮存变应原，如各种(常驻于肠胃的)蠕虫、棘球蚴、旋毛虫等、部分植入物质等在本发明疫苗的较佳实施方案中，抗原应用剂量与免疫过程中的注射剂量相差0.1-100倍，常在0.5-50倍范围内，更佳在1-20倍之间，理想的是比注射所用剂量高不到10倍在本发明疫苗的另一较佳实施方案中，穿透剂应用量在0.1-15毫克/平方厘米之间，更通常的在0.5-10毫克/平方厘米之间，较佳的在1-5毫克/平方厘米之间对于容易达到的或遮蔽的机体区域(如胸部或背部、手臂、颈侧面如耳后或头皮区域)，用不同的给药面积来控制免疫原应用量也是有利的在本发明疫苗的不同的较佳实施方案中，所述抗原是纯的或纯化的抗原在本发明疫苗中采用高度纯化的抗原已经证实对于产生保护性免疫应答是特别有利的本发明还涉及一种试剂盒，它包括装在瓶子或其它包装形式中的至少一个剂量的疫苗根据本发明的一个较佳实施方案，该试剂盒包括上述抗原的至少一个注射剂量本发明还涉及一种使哺乳动物产生保护性免疫应答的方法，该方法包括用上述疫苗对所述哺乳动物进行接种在本发明方法的另一较佳实施方案中，选择不同的处理面积，以控制免疫原的施加剂量以及治疗性疫苗接种的结果在本发明方法的一个更佳的实施方案中，在给药的前一天，较佳的给予皮肤所述制剂前360分钟(更佳为60分钟、还要佳为30分钟)，将抗原加入无抗原的穿透剂悬浮液中与穿透剂结合在本发明方法的另一较佳实施方案中，在用免疫辅助性操作对器官进行预处理后，将本发明疫苗施加到皮肤上，所述操作例如包括对皮肤进行摩擦、挤压、加热，使皮肤接触电或力的作用，如超声场等，或将非免疫原性制剂注射入皮肤中，只要该处理能使皮肤或其它有免疫活性的外周组织释放免疫辅助性化合物，或减少针对所需疫苗的拮抗剂的作用浓度/作用时间在本发明方法的较佳实施方案中，免疫原以非堵塞性贴剂形式施加该实施方案也可用于评价皮肤对表皮给予的穿透剂悬浮液中的免疫原的反应，皮肤至少在开始时对该免疫原有过敏，从而产生了急性局部过敏反应(例如可从产生的皮肤发红、刺激等看出)在本发明方法的另一较佳实施方案中，给予至少一剂疫苗本发明方法的这个实施方案包括反复给予本发明疫苗反复给予包括在皮肤上反复给予，或在皮肤上给予一次或多次并与例如肠胃外给药相联合在这种情况下，本发明所用试剂盒宜包括含有本发明疫苗的一个或多个容器在本发明方法的特别佳的实施方案中，所述疫苗以加强接种形式给予在本发明方法的最佳实施方案中，初次免疫采用侵入性方法，通常用皮下注射或其它一些合适的刺穿/破坏皮肤屏障的方法，而随后的至少一次加强免疫采用非侵入性方式在本发明方法的较佳实施方案中，当采用非变应原性抗原时，疫苗应用次数在2-10次之间，较佳的在2-7次之间，更佳的多至5次，最佳的3次，或在变应原情况下接种如此次数，这是实现所需免疫耐受性(根据合适的评价方法来测定)或认为尝试失败所必需的在本发明方法的特别佳的实施方案中，选择随后的接种间隔的时间为2周-5年之间，通常为1个月至3年，更通常的为2个月至1年半在更佳的实施方案中，提倡反复给予免疫原以使治疗性疫苗接种最终效果达到最大当采用非变应原性抗原时，建议疫苗接种次数在2-10次之间，通常在2-7次之间，更常多至5次，最佳的3次，或在变应原情况下接种如此次数，这是实现所需免疫耐受性(用上述或其它合适的评价方法来测定)或认为尝试失败所必需的在对象首次接受免疫后，随后的接种时间间隔宜为2周-5年，通常为1个月至3年，更通常为2个月至1年半啮齿类动物(如小鼠)和家兔宜在2周间隔内免疫，灵长类动物(如猴子和人)需要在3-6周间隔时间内加强接种在本发明方法的较佳实施方案中，测定携带免疫原通过明确的屏障的各个孔的穿透剂流通量与横跨作用于该屏障的合适推动力或压力的函数关系，然后用特征曲线方便地描述该数据，进而用该特征曲线优化制剂或下一步的应用最后，本发明涉及上述透皮载体，能特异性释放或特异性诱导细胞因子或抗细胞因子活性或发挥该活性的化合物，抗原或变应原，以及任选的微生物的提取物或化合物或其片段或衍生物和/或低分子量化学刺激剂，用于制备诱导保护性或致耐受性免疫应答的疫苗的用途