专利名称：可脱离的表面的制作方法图1示出角质细胞附着在各种表面上；图2示出角质细胞附着在高功率丙烯酸、脉冲的丙烯酸和丙酸表面上；图3是角质细胞转移后在DED上留着率的测量；图4(a)示出与DED接触4天后由于角质细胞从胶原I、载体和碳氢化合物表面转移到DED上造成的染色；图4(b)示出与DED接触4天后由于角质细胞从含酸的表面转移到DED上造成的染色；图5示出与DED接触4天后由于角质细胞从脉冲的丙烯酸表面转移到DED上造成的染色；图6示出与DED接触4天后由于角质细胞从丙酸表面转移到DED上造成的染色；图7示出与DED接触4天后由于角质细胞从高功率的丙烯酸表面转移到DED上造成的染色。材料和方法等离子体共聚合丙烯酸和1，7-辛二酸及丙酸从Aldrich Chemical Co.(英国)得到。所述单体在几个冷冻-泵吸/解冻循环之后原封不动地使用。聚合在一个圆柱形的反应器容器中(直径8厘米，长度50厘米)进行，由两级旋转泵抽真空。等离子体由一个射频信号(13.56MHz)发生器和一个电感耦连到所述反应器容器上的放大器维持。反应器中的基础压力是3×10-3毫巴。丙烯酸和1，7-辛二烯在2W的等离子体功率和2.0sccm的总流速下共聚合。等离子体共聚合物沉积在一种载体聚羟基丁酸(Goodfellow，Cambidge，UK)和干净的铝箔上(用于XPS分析)。共聚合时的压力典型地是4.0×10-2毫巴。另一个用于沉积丙酸的聚合用同样的条件进行。另外丙烯酸用脉冲等离子条件进行沉积。等离子功率为50W，使用5个毫秒的等离子占和40毫秒的等离子空的占空周期。单体流速是2.0sccm。最后，丙烯酸在连续波高功率的条件下沉积。所用的功率是7.5W，同时流速为2.0sccm。对于所有的共聚合，都使用了20分钟的沉积时间。在等离子关闭后让单体混合物继续流动20分钟。这样做是为使由于暴露于实验室环境吸取的大气中的氧最少。X射线光电子能谱法XP光谱由采用Mg KαX射线的VG CLAM2型光电子分光计得到。对于每个样品，分别使用通过50和20电子伏特的分析器获取测量扫描光谱(0-1100电子伏特)和窄带光谱。使用Spectra6.0软件(R.Unwin Software，Cheshire)获得光谱。随后的处理用Scienta数据处理软件(Scienta Instruments，Uppsala，Sweden)进行。分光计用Au 4f 7/2峰位置在84.00电子伏特标定，并且在C ls与F ls之间的光谱在PTFE样品中于397.2电子伏特测量，这与Beamson和Briggs报导的397.19电子伏特测量值很好的吻合。细胞培养从皮/表皮结合处分离正常成年人角质细胞(从乳房复位成形术和腹壁成形术得到)，方法依以前所述(14)。细胞在完全格林氏培养基中培养，此种培养基包括霍乱毒素(0.1毫微摩尔)、氢化可的松(0.4微克/毫升)、EGF(10毫微克/毫升)、腺嘌呤(1.8×10-4摩尔)、三碘-1-甲状腺原氨酸(2×10-7摩尔)、胰岛素(5毫克/毫升)、转铁蛋白(5微克/毫升)、谷氨酸(2×10-3摩尔)、两性霉素B(0.625微克/毫升)，青霉素(1000免疫单位/毫升)、链霉素(1000微克/毫升)及100％的胎牛血清。在37℃，5％的二氧化碳环境中培养细胞。用台盼蓝染色和标准血球计数器进行总细胞计数和可存活细胞计数。细胞培养试验只用新鲜分离的细胞。通过在层流室中过夜风干溶于0.1摩尔乙酸(200微克/毫升)中的胶原I(32微克/平方厘米)制备胶原涂覆的载体的样品。细胞以12.0×106个细胞/毫升的密度接种在三份组表面上，用直径10毫米的不锈钢环保持样品在6穴组织培养盘中扁平。培养24小时后，用MTT-ESTA检测测定每三份的一个样品上的角质细胞附着(15)。这估计了可成活细胞数，这种测定以前提示了人类角质细胞数(16)中的平行增长(16)。细胞在PBS中使用0.5毫克/毫升的MTT培育40分钟。用酸化异丙醇洗提染色。光密度测量是在540纳米进行的，使用已减除的630纳米蛋白参考波长做参考。
每三份中的余下的两个样品去与DED和添加的格林氏培养基接触使该表面处于空/液介面上。该DED/表面创面模型在37℃下置于培养箱中4天，4天后把表面从DED分开并用如上所述MTT测定评估表面向DED转移的程度。DED的MTT要求把DED在染色洗提前用MTT培育120分钟。
结果XPS特性用丙烯酸和1，7-辛二烯准备PCP的XP检测扫描光谱只揭示在沉积中有碳和氧。O/C比示于表1中。随着馈送的单体中丙烯酸的摩尔数加大O/C比增加。对于各种含氧官能团进行了PCP的C ls核能级谱峰拟合。首先为加样进行了光谱校正，把碳氢化合物信号设定到285电子伏特，然后拟合了以下官能团在+1.5电子伏特移位的醇/醚(C-OH/R)；在+3.0电子伏特移位的羰基(C＝O)；在+4.0电子伏特移位的羧酸/酯(COOH/R)；而在+0.7电子伏特移位的结合在羧酸盐(C-COOH/R)上的一个β-位碳。所述峰拟合结果及一种样品的峰拟合(Faa/Ftot＝1)示于表1。在该峰拟合中FWHM组份峰保持相同并且在1.4-1.6电子伏特范围。该组份峰的高斯峰与洛伦兹峰的比(G/L)也保持恒定并且在0.8-0.9的范围。尽管XPS不能区分羧酸和酯官能团，等离子体聚合化丙烯酸的掠射角红外线分光测量显示，在本研究中所用的低功率下，在XP光谱中的羧基峰可以归为羧酸而不是酯(10)。在PCP中出现的其它碳-氧官能团(除了羧酸之外)包括羰基和醇/醚。这是由于等离子体中单体破裂造成的。在沉积物与从等离子体容器壁上吸收的水分之间的反应(在聚合时)及大气中的氧气与水之间的反应(在聚合后)也对此起了作用。C-OH/R峰被认为主要是羟基。在一个以前的研究中我们更加详细地检验了丙烯酸/1，7-辛二烯的PCP中含氧官能团的同一性(用馈送单体中不同摩尔数丙烯酸进行比较)(11)。基于此研究，我们认为，在PCP表面上，羧酸官能团对角质细胞起作用，而不是C-OH。后者应当以高浓度出现(25％)以促进细胞附着(8)。
从(i)丙酸的连续波沉积，(ii)脉冲丙烯酸及(iii)高功率丙烯酸测定的XP光谱也只揭示在沉积中的碳和氧，并且用以上对丙烯酸定出的同样标准拟合。对丙酸，脉冲丙烯酸及高功率丙烯酸的曲线拟合结果分别示于表2、表3和表4中。基于我实验室对脉冲等离子体的研究，可以期望脉冲等离子体中的低占空比会产生更高的羧基留着率(21)。由比较表1和表4可见增加等离子体功率导致-50％的羰基官能团留着率下降，及相应的醇/醚及羰基官能团的增加。
表1 由丙烯酸和1，7-辛二烯制备PCP的XPS结果汇总％C ls核能级中的官能团
一个β-移位碳以与在峰拟合上附加的羧酸盐连结等幅度地方式结合在羧酸盐(在从碳氢化合物+0.7电子伏特移位处的(C-COOH/R))上。
表2 由丙酸制备的PPs的XPS的结果汇总％C ls核能级中的官能团
一个β-移位碳以与在峰拟合上附加的羧酸盐连结等幅度地方式结合在羧酸盐(在从碳氢化合物+0.7电子伏特移位处的(C-COOH/R))上。
表3 由脉冲的丙烯酸制备的PPs的XPS结果汇总％C ls核能级中的官能团
一个β-移位碳以与在峰拟合上附加的羧酸盐连结等幅度地方式结合在羧酸盐(在从碳氢化合物+0.7电子伏特移位处的(C-COOH/R))上。
表4 由高功率丙烯酸制备的PPs的XPS结果汇总％C ls核能级中的官能团
一个β-移位碳以与在峰拟合上附加的羧酸盐连结等幅度地方式结合在羧酸盐(在从碳氢化合物+0.7电子伏特移位处的(C-COOH/R))上。
细胞在表面上的附着对于所有的表面，在分离角质细胞之后用计数器进行了细胞计数，示出97％细胞成活率(2.5×107总细胞)。24小时后用MTT测定检查这些表面。
(i)丙烯酸/1，7-辛二烯结果示于图1。数据显示单体流中用50％和100％丙烯酸制备的含酸表面性能稍好于胶原I。在流中用25％的酸制造的表面与TCPS可相比较，但是角质细胞在碳氢化合物表面上附着不佳。
(ii)丙酸、高功率丙烯酸、脉冲丙烯酸结果示于图2。细胞虽然附着于所有的表面，但是，胶原I显示附着程度较高。细胞附着的程度不是接着从表面向DED转移的程度的预报因子，但是注意到用不同单体前体和/或等离子体产生的表面的确支持角质细胞的附着是重要的。细胞附着显然是随后的转移成功的前提。
向DED转移细胞表5汇总了从DED分离载体聚合物表面的结果。胶原I表面和在气体流中用100％制备的表面对DED粘着良好，表示角质细胞几乎都从表面转移到DED上。在单体流中用低量酸制备的表面粘着较差，而载体和碳氢化合物表面易于从DED剥离，表示细胞转移程度较低。
表5 在接触4天后各种表面对DED的粘着性
在表面和DED并置4天后把两者分开，而图2中示出在表面上进行MTT测定的结果，图3中示出在DED上进行MTT测定的结果。与在转移到DED上的相比较所有例中保留在表面上的细胞的光密度极低。对向DED的转移进行检验时，在胶原I上生长的细胞显示最高的值，约大于仅用载体时所见的4倍。生长在用25％酸处理的表面上的细胞的转移与仅用载体时所见可相比较。生长在用50％和100％酸处理的表面上的细胞却显示显著多地转移到DED上。生长在碳氢化合物处理的表面上的细胞显示很少向DED转移。
角质细胞从丙烯酸/1，7-辛二烯PP向DED转移的照像证据示于图4(a)和图4(b)。碳氢化合物(1，7-辛二烯)和载体(biopol)表面未染色，而胶原I和含酸表面却因为在DED上的角质细胞显示染为紫色。图5示出由于细胞从脉冲的丙烯酸PP转移造成的染色。图6示出用丙酸PP的同样结果。而图7示出由于细胞从高功率的丙烯酸PP(沉积于无纺纤维上)转移造成的DED染色。
讨论本研究的目的是扩大本实验室的原有工作，这些研究揭示使用PCP表面用于角质细胞附着和增生，但是对向DED的转移无助。角质细胞对这些研究提出了特殊的挑战，因为它们在许多基底上经历不可逆的终末分化。从而细胞失去了迁移或形成群体的能力，而这些能力特性却是在从支持表面向创面转移角质细胞以达到表皮再生所需要的。
因此本发明的目的是检验在什么范围内促进附着的表面会促进细胞向一个简单的离体创口模型转移。
人类角质细胞在含有各种浓度羧酸官能团的PCP表面上可成功地培养，在附着的细胞数上，与一种优选的角质细胞培养基胶原I上的细胞表现可相比较。
使用碳氢化合物等离子聚合物作阴性对照是重要的，因为早先的一项研究怀疑过TCPS做对照的适宜性(17)。这样的顾虑是由于在制造过程中对TCPS的表面处理引起的，这种表面处理视表面氧化程度不同可以使TCPS对水溶液不稳定。还不清楚不同批次的TCPS是否接收确切相同量的表面氧化，也不清楚此种表面氧化是否易于受老化的影响。
尽管细胞附着对官能团浓度的依从性还有待研究，先前已经表明角质细胞在有2-3％低量酸官能团的表面上加强附着(11)。然而，在本研究中显示在含21％酸的表面上附着也并不低。应当提醒的是酸PCP还含有其它的O-C官能团，主要是C-OH。即使如此，我们以前的研究显示酸PCP在融合程度及细胞数方面与胶原I可相比较(由DNA测定)。
在含水的媒介中，酸PCP可以水合，如我将于另文所述(18)。试验显示酸PCP的稳定性取决于单体流中丙烯酸的浓度。高浓度的酸(＞60％总流量)导致欠稳定的表面。此要求使得把低浓度的酸表面(＜5％)的发展被打上对促进附着及续后的增生“理想”的标签。然而谈及从酸表面上转移，很可能要用不同的标准。尽管低浓度酸官能团赋予表面稳定性，角质细胞可能因良好地附着于其上而防碍了转移。在个评估是从转移实验的结果得出的，实验中馈送单体中25％的酸流量(在PCP表面上2.6％的羧酸)显示对DED最低的转移。相反馈送单体中100％的酸流量(在PCP表面上＞20％的羧酸)细胞转移显著地高。这些表面的性能仅被胶原I胜出。以50％酸的馈送单体流量，转移介于高酸和低酸官能团表面之间，正如所料。这些结果指出促进附着和增生的理想表面可能不是产生最大程度的从PCP向DED转移的表面。从碳氢化合物PP的低量转移证实这样一种表面不能够支持增生状态的角质细胞。尽管，细胞转移对官能团浓度的依从性还需要充分地探讨，用高量酸官能团时角质细胞表现出加强了从表面转移。因此可以清楚在促进增生的表面(低酸官能团)和促进转移的表面(高酸官能团)之间存在一种折衷。
在含血清的培养基中，已经表明细胞受一种蛋白质的吸附层的作用，而不是直接受培养基本身作用(19)，这种介导蛋白层吸附(几乎是)自发的。细胞对受研究的培养基的响应提示要么是蛋白膜的成分有变化，要么是这些蛋白在吸附后的活性有变化，或者两者兼有。实验表明一些粘性蛋白支持细胞附着，例如纤维结合蛋白和玻璃粘连蛋白。Tidwell等(12)表述了在用有不同末端的链烷硫醇盐(alkanethiolates)化学药品在SAM上形成的蛋白层与各自支持不同层次的牛动脉内皮细胞附着的蛋白层之间的区别。尽管细胞附着和扩散是细胞增生的重要条件，但是它们并不是排他性的条件。血清也是一种生长因子的来源并且已经表明对于低级哺乳动物细胞是必须的。实验提示把生长因子吸收到细胞外间质材料中在其活性化中起重要的作用(20)。
结果表明可以从大范围的起始单体中提供羧酸官能团。丙烯酸是不饱和类有机酸中的一种，而丙酸是饱和有机酸。因此，只要单体可充分地挥发以流经等离子室，可料想任何有机酸都应当适于用作制造能够显示角质细胞附着及续后向DED转移的PP表面。而且结果表明一个宽范围的等离子条件能够制备促进所需要的细胞附着和转移的表面。我们表明，在连续波的条件下，高和低功率的方式都可以成功地制备所需特性的PP。另外，把等离子体进行脉冲提供另一种在表面上沉积酸官能团的途径。另一个考虑是一个范围的载体表面可以用于等离子沉积。在此研究中一种可生物降解的载体(biopol)，和一种不可以生物降解的载体(聚丙烯，Delnet，由AET Specialty Nets供应)，表明它们均可以涂覆以促进角质细胞向DED转移的PP。数据提示，尽管载体膜可在其特性上有别(例如溶解性，吸收性)，PP沉积在影响细胞性能的载体上是首要的(尽管诸如结构/孔径之类的形态影响可能意味着PP覆层不是均匀的“扁平”表面，照样在载体轮廓上发生沉积。因此当PP覆层的载体用于DED时，细胞在不会与DED发生接触处附着就位)。人们设想，任何转移现象的外科应用都会要求一种膜样的载体而不是网样的载体，以保证细胞在PP表面上的最大附着，而不是在载体材料的覆层的轮廓之内。
基于以上的讨论，很明显酸PCP在支持角质细胞附着和转移上的成功是多因素的。然而，我们的结果提示角质细胞的附着和转移特别地由羧酸官能团促进。这最可能是通过从血清形成的介导蛋白层的控制起作用。
含高浓度酸官能团(典型地羧基)的PCP表面与碳氢化合物相比较更促进角质细胞的附着和向DED的转移。在含到20％酸官能团的表面上的初始附着与培养24小时后细胞在胶原I基底上的表面附着可相比较。
对于含高浓度的羧酸官能团表面细胞从PCP向DED的转移是最多的，尽管在低酸官能团浓度的表面也观察到了转移。用从饱和和不饱和有机酸沉积的PP都达到细胞转移。在连续波的条件下，低和高功率法都能够产生促进细胞转移的PP。脉冲等离子体也提供了一种制造促转移PP表面的途径。
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本发明涉及一种细胞培养表面,细胞附着于所述细胞培养表面,并且增生,而且所述细胞培养表面使所述的附着细胞可以从所述表面脱离以用于各种治疗性和美容性组织工程/外科手术。