一种低温加工灵芝的方法[0002]灵芝又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的子实体。味甘性平，功能益气血、安心神、健脾胃。始载于《神农本草经》，列为上品，按本草纲目记载:“灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙。” 灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍贵药材，具备很高的药用价值，灵芝属的子实体、菌丝体和孢子中含有多糖类、核苷类、呋喃类衍生物、留酵类、生物碱类、蛋白质、多肽、氨基酸类、三萜类、倍半萜、有机锗、无机盐等。灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗氧化、降血脂与抗衰老作用。灵芝所含三萜类不下百余种，其中以四环三萜类为主，灵芝的苦味与所含三萜类有关。三萜类也是灵芝的有效成分之一，对人肝癌细胞具有细胞毒作用，也能抑制组织胺的释放，具有保肝作用和具有抗过敏作用等。[0003]目前市售灵芝均为灵芝成熟后的子实体，其功效成分分为水溶性成分和脂溶性成分，一般水溶性功效成分主要是多糖，脂溶性功效成分为三萜，其中多糖、三萜类功效成分均不超过20%，其主要成分为木质化纤维。而木质化纤维在人体内不吸收，无免疫增强等功效。水溶性成分主要用水提取，浓缩，干燥工艺提取制备，脂溶性成分主要采用酒精提取或CO2超临界萃取等工 艺提取制备，所以很难用单一工艺将灵芝中的所有功效成分制备完全，而如果对成熟灵芝子实体采用粉碎工艺，可确保其中的功效成分不损失，但带入的大量木质人纤维成分难以去除。
[0004]发明解决的技术问题:本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种低温加工灵芝的方法。[0005]技术方案 一种低温加工灵芝的方法，选取露嫩芽且未木质化的灵芝子实体，采收后清洗、打浆、冷冻干燥得到粉末，然后进行冷藏。[0006]所述的低温加工灵芝的方法，选取露嫩芽且未木质化的灵芝子实体时灵芝芽露出地面不超过15天。
[0007]所述的低温加工灵芝的方法，打浆使用胶体磨，可以设定磨孔径为0.5cm，打浆时间10~40分钟。
[0008]所述的低温加工灵芝的方法，冷冻干燥条件可以为物料装填厚度5~20mm，预冻时间为3~6h，预冻温度-20~-35°C，工作压力35~55Pa，升华温度45~65°C，解析温度 55 ~75°C。
[0009]以上所述的低温加工灵芝的方法制备得到的灵芝粉末制成的制剂。[0010]选取人工栽培的灵芝子实体，刚露出嫩芽即开始采摘，要求灵芝芽露出地面不超过10天，子实体无木质化现象。一般采摘时间为每年5飞月，此时灵芝芽未分离出菌盖和菌板，仅仅为嫩黄色或白色芽状，细杆，触摸手感未产生木质化，较柔软，环境温度较高，采收后应及时处理。
[0011]打浆过程中可以加入少量水(不到10%)使打浆均匀，无遗留。
[0012]干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一。干燥的方法很多，如晒干、煮干、烘干、喷雾干燥和真空干燥等，但这些干燥方法都是在0°c以上或更高的温度下进行，干燥所得的产品，一般是体积缩小、质地变硬，有些物质发生了氧化，一些易挥发的成分大部分会损失掉，有些热敏性的物质会发生变性，微生物会失往生物活力等，因此干燥后的产品与干燥前相比在性状上有很大的差别。
[0013]冷冻干燥就是把含有大量水分物质，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热，整个干燥是在较低的温度下进行的。
[0014]冷冻干燥有下列优点:
一、冷冻干燥在低温下进行，因此对于很多热敏性的物质特别适用。
[0015]二、在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，适合一些化学产品，药品和食品干燥。
[0016]三、在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性装。
[0017]四、由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象。
[0018]五、干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状。
[0019]六、由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。
[0020]七、干燥能排除95-99%以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
[0021]有益效果
本发明直接选用灵芝未木质化前的子实体嫩芽，采用打浆，冻干工艺，所获冻干粉中充分保留了多糖、三萜类功效成分，经检测发现，其中还有超氧化物歧化酶(SOD)等功效成分是灵芝成熟子实体所没有的，故本发明所制备冻干粉较成熟灵芝子实体功效更强。故考虑选用灵芝未木质化之前的嫩芽，直接打浆，冷冻干燥，充分保留其中的功效成分，且无成熟子实体中之木质化纤维成分。
[0022]本发明提供的方法制备得到的灵芝产品的有效成分含量与常规方法相比有了显著的提高，其中灵芝多糖的含量是传统方法制得灵芝产品的3倍多，灵芝三萜的含量是传统方法制得灵芝产品含量的将近5倍，而本发明提供的方法制备得到的灵芝产品中还有S0D，传统方法种没有，更进一步提高了本法制备得到的灵芝产品的应用价值。

[0023]以下实施例中选取灵芝子实体时要求在刚露出嫩芽即开始采摘，要求灵芝芽露出地面不超过15天，子实体无木质化现象，为嫩黄色或白色芽状，细杆，触摸手感未产生木质化，较柔软。
[0024]实施例1
一种低温加工灵芝的方法，加工过程如下:
选取人工栽培的灵芝子实体lkg，采取后用清水清洗干净，于胶体磨中进行打浆，胶体磨孔径调节为0.5cm，反复循环打浆20分钟，打浆过程中加入少许水将浆体稀释均匀。打浆后对浆料进行冷冻干燥，物料装填厚度为5mm，设定预冻温度_20°C，工作压力35Pa，升华温度45°C，解析温度55 °C，预冻时间3h。
[0025]实施例2
一种低温加工灵芝的方法，加工过程如下:
选取人工栽培的灵芝子实体1.5kg，采取后用清水清洗干净，于胶体磨中进行打浆，胶体磨孔径调节为0.5cm，反复循环打浆30分钟，打浆过程中加入少许水将浆体稀释均匀。打浆后对浆料进行冷冻干燥，物料装填厚度为15mm，设定预冻温度_30°C，工作压力40Pa，升华温度55 °C，解析温度65 °C，预冻时间4h。
[0026]实施例3
一种低温加工灵芝的方法，加工过程如下:
选取人工栽培的灵芝子实体lkg，采取后用清水清洗干净，于胶体磨中进行打浆，胶体磨孔径调节为0.5cm,反复循环打浆10分钟，打浆过程中加入少许水将浆体稀释均匀。打浆后对浆料进行冷冻干燥，物料装填厚度为10mm，设定预冻温度-26°C，工作压力45Pa，升华温度55 °C，解析温度65 °C，预冻时间4h。
[0027]实施例4
一种低温加工灵芝的法，加工过程如下:
选取人工栽培的灵芝子实体2kg，采取后用清水清洗干净，于胶体磨中进行打浆，胶体磨孔径调节为0.5cm，反复循环打浆40分钟，打浆过程中加入少许水将浆体稀释均匀。打浆后对浆料进行冷冻干燥，物料装填厚度为20mm，设定预冻温度-35 V，工作压力55Pa，升华温度65 °C，解析温度75 °C，预冻时间6h。
[0028]本发明提供的灵芝产品为粉末状，可以非常方便的制备成各种制剂进行进一步应用。
[0029]选取灵芝子实体时一般采摘时间为每年5飞月，此时灵芝芽未分离出菌盖和菌板，仅仅为嫩黄色或白色芽状，细杆，触摸手感未产生木质化，较柔软，环境温度较高。
[0030]对以上实施例3制备得到的产品制成制剂，与现有常规方法制得的制剂进行性能测试对比试验，过程及结果如下:
按照实施例3方法制备得到的冷冻干燥的产品灌装胶囊，以下简称灵芝胶囊I规格:0.2g/粒，性状为棕褐色粉末。按常规方法制得的灵芝胶囊Π。
[0031]常规方法:成熟灵芝子实体干燥后粉碎至一定细度，直接灌装成硬胶囊即得。
[0032]试验动物及分组:选用上海斯莱克实验动物有限责任公司繁殖的清洁级CKFl代健康雌性小鼠250只，体重为19.2~21.9g。
[0033] 小鼠按体重随机分为1、II二个大组，每大组50只小鼠，分成4个剂量组，每个剂
量组10只。其中I组小鼠进行NK细胞活性试验；11组小鼠进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。
[0034]剂量:灵芝胶囊的人体推荐剂量1.2g/人/日(以60kg体重计)，设灵芝胶囊I高剂量组0.6g/kg.bw/d、灵芝胶囊II高剂量组0.6g/kg.bw/d、灵芝胶囊I低剂量组0.4g/kg.bw/d、灵芝胶囊II低剂量组0.4g/kg.bw/d,另设Og/kg.bw/d组以无菌水代替受试样品。受试样品用无菌水配制，灵芝胶囊I高剂量组、灵芝胶囊Π高剂量组浓度为60mg/mL,灵芝胶囊I低剂量组、灵芝胶囊II低剂量组浓度为40mg/mL，经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试样品，小鼠灌胃量为0.lmL/10g.bw0连续灌胃I个月后测定各项增强免疫力功能指标。
[0035]实验测试方法:
(1)DNFB诱导小鼠迟发型变态反应(DTH)——耳肿胀法
各样品组动物连续灌胃I个月后，每鼠用剃毛机将腹部毛剃去，范围约3cmX 3cm，用10mg/mL DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5日后用10mg/mL DNFB溶液ΙΟμL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h颈椎脱白处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm耳片，称重。
[0036]用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。
[0037](2) NK细胞活性测定一乳酸脱氢酶测定法
各样品组动物连续灌胃I个月，颈椎脱白处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min( 1000r/min),弃上清将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入 0.5 mL 2 倍 Hank’s 液及 8mL Hank’s 液,离心 IOmin (1000r/min),用含 10%小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，I %冰乙酸稀释后计数，台酚蓝染色计数活细胞数(均在95%以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2 X IO7个/mL。
[0038]试验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养，应用前以Hank’ s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4X105个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100μL(效靶比50:1)加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μL, YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和1%ΝΡ40各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37°C、5%C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应lOmin，每孔加入lmol/L的HCl 30μL,在酶标仪490nm处测定光密度值。
[0039]受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，方可判定该项实验结果阳性。
[0040]实验结果:
表1各样品组对DNFB诱导小鼠DTH的影响(土 SD)