专利名称：巫山淫羊藿的组培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿的制作方法巫山淫羊藿Epimedium wushanense Τ· S. Ying为小檗科淫羊藿属多年生宿根性草本药用植物，为《中华人民共和国药典》2010年版一部所载品种。以其干燥的叶入药，有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效，且具有改善心血管系统，调节内分泌和抗骨质疏松等生理活性。巫山淫羊藿药材原料主要依靠野生资源，随着国内外对其需求量的不断增大，巫山淫羊藿野生资源遭到严重破坏，不能满足国内外市场的需求。目前淫羊藿的繁殖方式主要有通过地下根茎的无性繁殖及种子繁殖(有性繁殖)，淫羊藿种子存在明显的休眠现象，繁殖发芽率低，且生长缓慢，生产上大多采用分株繁殖。人们期待有一种能够以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法来繁育和栽培巫山淫羊藿，以满足越来越大的巫山淫羊藿药用需求，并保护野生药用资源。
本发明的目的是提供一种能够以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法来繁育和栽培巫山淫羊藿。本发明人发现以巫山淫羊藿种子为繁育材料，使用特定的培养条件，可以有利地实现上述有关巫山淫羊藿繁育中的一个或多个方面的要求。本发明基于此发现而得以完成。为此，本发明第一方面涉及一种巫山淫羊藿的组培快繁方法，包括以下步骤Α.外植体层积处理将巫山淫羊藿种子消毒后于O 10°C低温沙藏层积处理；B.外植体消毒将层积处理后的种子进行消毒处理，再用无菌镊子将种胚剥出， 备用;C.初代诱导将消毒后的种胚接种于诱导培养基中培养，使种胚诱导愈伤组织而分化出不定芽，或者使种胚直接诱导出芽；D.继代增殖将步骤C中所得芽转入增殖培养基中，生成组培丛芽；E.再生植株诱导生根将步骤D诱导分化的I 4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生根培养基中，培养以形成白色须根，进而形成完整植株。根据本发明第一方面的方法，其中步骤A中，所述消毒是如下方式处理将种子用流水冲洗，于酒精中浸泡，再在HgCl2中浸泡,再用无菌水冲洗。在一个实施方案中，步骤 A中，所述消毒是如下方式处理流水冲洗15-30min(例如约30min)，于45-75% (例如约 75% )酒精中浸泡10-60s (例如约30s)，再在O. 1-0. 5% (例如约O. 5%)的HgCl2中浸泡 2-8min (例如约6min),无菌水冲洗2_6次(例如约5次)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤A中，所述低温沙藏层积处理是如下方式处理使种子与河沙按I : 2 5的比例混合，保持含水量50 70%，经3 8°C低温沙藏层积处理75 120天。由此处理的种子可以打破种子的休眠。在一个实施方案中，所述河沙是经高温灭菌l_5h(例如约2h)后再冷却至室温的河沙。在一个实施方案中，所述种子与河沙按I : (1-5)，例如约I : 3的比例混合。在一个实施方案中，所述种子与河沙按I 3的比例混合，保持含水量40-70% (例如约60%)。在一个实施方案中，所述种子与河沙按I : 3的比例混合，保持含水量60 %，经2-5°C低温沙藏层积处理60-100天(例如约90天)。根据本发明第一方面的方法，其中步骤B中，所述消毒是先用酒精消毒，接着用 HgCl2消毒。在一个实施方案中，步骤B中，将层积处理结束后的种子洗去河沙，于45-75% (例如约75% )酒精中浸泡10-60s (例如约30s)，无菌水冲洗2_6次(例如约5次)，再用 O. 1-0. 5% (例如约O. 5% )的HgCl2消毒2-8min(例如约6min)，无菌水冲洗2_6次(例如约5次)。在一个实施方案中，步骤B中，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥出， 无菌滤纸吸干水分后，备用于下一处理步骤。根据本发明第一方面的方法，其中步骤C中，所述诱导培养基是包含MS+2， 4-D2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的培养基，或者是包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6 % 琼脂的培养基，或者是包含 MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的培养基。在一个实施方案中，步骤C中，所述诱导培养基是包含 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的培养基，以及包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+ 蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的培养基；或者是包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的培养基。根据本发明第一方面的方法，其中步骤C的初代诱导是如下处理的将消毒后的种胚接种于包含 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6 % 琼脂的诱导培养基中培养，产生愈伤组织，接着在包含MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBAlmg/L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的诱导培养基中培养，分化出不定芽；或者，将消毒后的种胚接种于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的诱导培养基中培养，直接诱导出芽。根据本发明第一方面的方法，其中步骤D中，所述增殖培养基是包含 MS+6-BA1. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的培养基。在一个实施方案中，在增殖培养基中培养的时间为20 60天，优选25 45天，例如约30天。根据本发明第一方面的方法，其中步骤E中，所述生根培养基是包含 1/2MS+0. INAAmg/L 的培养基。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的培养基的pH值为pH5. O 7. 0， 优选ρΗ5· 5 6. 5，更优选ρΗ5· 8。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的MS培养基中各自独立地添加 30g/L蔗糖和O. 6%琼脂。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用的培养基经100-130°C (例如约 121。。),0. 1-0. 5Mpa(例如约 O. IMpa)高温灭菌 15_25min(例如约 25min)处理。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用培养基培养的条件是温度20 30°C，光照强度1500 30001x，光照8 15h/d。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中使用培养基培养的条件是温度25±2°C，光照强度20001x，光照12h/d。5根据本发明第一方面的方法，其包括以下步骤A.外植体层积处理将巫山淫羊藿种子，流水冲洗，消毒后于O 10°C低温沙藏层积处理；B.外植体消毒将层积处理后的种子，先用酒精浸泡，再用升汞浸泡，无菌水冲洗干净，用无菌镊子将种胚剥出，备用；C.初代诱导将消毒后的种胚接种于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/ L+NAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6 %琼脂的诱导培养基中培养，产生愈伤组织，接着在包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的诱导培养基中培养，分化出不定芽；或者，将消毒后的种胚接种于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/ L+0. 6%琼脂的诱导培养基中培养，直接诱导出芽；D.继代增殖将步骤C中所得芽转入包含MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的增殖培养基中，生成组培丛芽；E.再生植株诱导生根将诱导分化的I 4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生根培养基中，I个月后形成白色须根，进而形成完整植株。根据本发明第一方面的方法，其中各步骤中，在进行培养时，其培养的时间以及培养的程度可以根据本领域技术人员的技术经验以及操作的具体条件来确定，而不作特别的限定。例如，在本发明步骤C中，种胚接种于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA0. 5mg/ L+蔗糖30g/L+0. 6%琼脂的诱导培养基中培养I个月左右，将会产生愈伤组织；接着在包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%琼脂的培养基中培养 I 个月左右会分化出不定芽。本发明第二方面涉及一种巫山淫羊藿株植，其是由组培快繁方法繁殖得到的。根据本发明第二方面的巫山淫羊藿的株植，其是由本发明第一方面任一实施方案所述组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发明第一方面任一实施方案所述步骤A、B、C、D和E的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。本发明第三方面涉及一种巫山淫羊藿的芽，其是由组培快繁方法繁殖得到的。根据本发明第三方面的巫山淫羊藿的芽，其是由本发明第一方面任一实施方案所述组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发明第一方面任一实施方案所述步骤A、B、C和D的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。本发明第四方面涉及一种巫山淫羊藿的愈伤组织，其是由组培快繁方法繁殖得到的。根据本发明第四方面的巫山淫羊藿的愈伤组织，其是由本发明第一方面任一实施方案所述组培快繁方法繁殖得到的。在一个实施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本发明第一方面任一实施方案所述步骤A、B和C的处理过程经组培快繁方法繁殖得到的。本发明第一方面任一实施方案中的任一技术特征同样适用于任一其它实施方案， 只要这种适用不会出现矛盾。下面对本发明方法进一步详细描述将有助于对本发明的了解。在本发明中，MS或者MS培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的(并因此简称为MS培养基)，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。本发明使用的培养基或其中加入的添加剂是本领域技术人员根据已有知识可以获得的，或者可以直接从市场上购得。例如MS培养基可以直接以商品方式购得。在本发明中，如未另外说明，提及MS培养基是添加了 6g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS培养基，如果以MS+6g/L琼脂 +30g/L蔗糖等类似方式提及的培养基，亦是指添加了 6g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS培养基。在本发明中，2，4-D指的是2，4- 二氯苯氧乙酸在本发明中，6-BA指的是6-苄基腺嘌呤在本发明中，IBA指的是吲哚丁酸在本发明中，NAA指的是α -萘乙酸本发明提供了一种巫山淫羊藿的组培快繁方法。本发明方法可以缩短培养时间， 扩大繁殖系数，保证种苗数量和质量，最终解决种苗的生产及供应问题，对实现巫山淫羊藿的可持续利用具有重要意义。本发明的目的在于提供一种巫山淫羊藿的组培快繁方法，使巫山淫羊藿成熟种子的种胚在MS培养基上I个月后诱导出愈伤组织，两个月后分化出芽，4个月后生根长成完整植株。本发明所提供的巫山淫羊藿的组培快繁方法，包括Α.外植体选择及处理将采集到的巫山淫羊藿种子，去除杂质和不饱满颗粒，流水冲洗30min，于75%酒精中浸泡30s，再在O. I % HgCl2中浸泡6min，无菌水冲洗5次后与经高温灭菌2h冷却至室温的河沙按I : 3的比例混合，保持含水量60%，经5°C低温层积处理90天打破种子休眠。B.外植体消毒将层积处理结束后的种子洗去河沙，于75%酒精中浸泡30s，无菌水冲洗5次，再用O. I % HgCl2消毒6min，无菌水冲洗5次，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥出，无菌滤纸吸干水分后，备用。C.初代诱导将经步骤B处理所得种胚接入初代诱导培养基，培养条件为MS分别附加 6g/L 琼脂，30g/L 蔗糖，pH5.8，温度(25±2) °C，光强 20001x，光照 12h/d。在 MS+2， 4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L的培养基上培养I个月后愈伤组织诱导率达63. 3% ; 在MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L的培养基上继续培养I月后愈伤组织分化率可达73. 8 %。或者，将经步骤B处理所得种胚接入到MS+IBA 2mg/L+6-BA0. 5mg/L培养基上培养I 2月后芽诱导率可达77.8%。D.继代增殖将步骤C中愈伤组织分化的不定芽或直接诱导的芽丛分瓶，转接到继代增殖培养基中，I个月后在MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L的增殖培养基上芽的增殖系数可达2. 17。E.再生植株诱导生根将诱导分化的I 4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生根培养基1/2MS+0. INAAmg/L中，I个月后形成白色须根，根系数一般在2 5条。本申请还请求保护根据上述巫山淫羊藿的组培快繁方法获得的巫山淫羊藿愈伤组织、芽及植株，其特征是选择巫山淫羊藿成熟种子的种胚为外植体，在MS培养基上培养 I个月后诱导出愈伤组织，再过I个月分化出不定芽，也可不经过愈伤组织途径直接诱导出芽，然后转接到生根培养基上，诱导生根形成完整植株。本申请还请求保护一种巫山淫羊藿的组培快繁方法得到的巫山淫羊藿植株,其特征是先诱导出白色或绿色致密、坚实且生长旺盛的愈伤组织再分化成芽，或直接诱导出芽，然后诱导生根形成完整植株。本发明的优点在于本发明诱导种胚产生愈伤组织分化出不定芽，愈伤组织分化不定芽的过程，不需要更换培养基配方，分化率达73.8%，且种胚可以直接诱导出不定芽， 大大缩短了不定芽的诱导过程。本发明可以提高巫山淫羊藿的繁殖系数，缩短繁殖周期，且方法简单，成本较低，适宜于生产应用。
图I显示了成熟种子纵切后的种胚外植体的照片，图中标尺表示O. 5mm。图2显示了培养10天后外植体边缘长出绿色、白色的瘤状组织的照片，图中标尺表不1 mm η图3显示了培养I个月后外植体形成的白色光滑，致密的愈伤组织的照片，图中标尺表不Imm0图4显示了培养2个月后愈伤组织分化出不定芽的照片，图中标尺表示5_。图5显示了芽增殖后形成的丛生芽的照片。图6显示了生根形成完整植株的照片。

845%以下。四.继代增殖将步骤三所得丛生芽长至2cm左右再分割成2 3个芽的芽丛接种到MS添加不同浓度的6-BA(0. l、l、10mg/L)和NAA(O. 5mg/L)组合的培养基中进行芽的增殖，以不加激素处理作为对照，结果表明，MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L为芽的增殖培养基，既可以使芽生长健壮，增殖速度适当，并保持较高增殖倍数，增殖系数达2. 17。其它组合的培养基在增殖系数方面远低于以上包含MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L的增殖培养基所得的结果。五·再生植株诱导生根将诱导分化的I 4cm长的健康的芽丛长成的无根苗转入生根培养基 1/2MS+0. INAAmg/L中进行生根培养，I个月后芽的基部逐渐长出白色的须根，根数一般在 2 5条。以上结果表明，巫山淫羊藿种胚愈伤组织诱导和分化的最适培养基分别为MS+2， 4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L、MS+6-BA lmg/L+NAA 0. 5mg/L+IBAlmg/L，诱导率和分化率分别达63. 3%,73. 8%;芽诱导的最适培养基为MS+IBA2mg/L+6-BA O. 5mg/L，诱导率达 77.8% ;芽增殖培养基为MS+6-BA I. 0mg/L+NAA0. 5mg/L，增殖系数为2. 17 ;生根培养基为 1/2MS+0. INAAmg/Lο实施例2 :组培快繁方法培育巫山淫羊藿A.外植体选择及处理将采集到的巫山淫羊藿种子，去除杂质和不饱满颗粒，流水冲洗30min，于75%酒精中浸泡30s，再在O. 1% HgCl2中浸泡6min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分后与经121 °C，O. IMpa高温灭菌2h冷却至室温的河沙按I : 3的比例混合均匀，保持含水量60%，经5°C低温层积处理90天打破种子休眠。B.外植体消毒将层积处理结束后的种子洗去河沙，于75%酒精中浸泡30s，无菌水冲洗5次,再用O. I % HgCl2消毒6min,无菌水冲洗5 6次,无菌滤纸吸干水分后,用灼烧冷却后的镊子和解剖刀将种胚轻轻剥出，无菌滤纸吸干水分后，备用。C.初代诱导将经步骤B处理所得种胚接入初代培养基，I个月后MS+2，4_D2mg/ L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L 培养基上愈伤组织诱导率达 63. 3% ;MS+6_BAlmg/L+NAA O. 5mg/ L+IBA lmg/L培养基上愈伤组织分化率达73. 8% ；MS+IBA2mg/L+6-BA O. 5mg/L培养基上芽诱导率达77.8%。D.继代增殖将步骤C中愈伤组织分化的不定芽及直接诱导的芽丛分瓶，转接到继代增殖培养基中，I个月后增殖系数为2. 17。E.再生植株诱导生根将诱导分化的I 4cm长的健康的芽丛长成的小植株转入生根培养基中，I个月后形成白色须根，根系数一般在2 5条。


本发明涉及巫山淫羊藿的组培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿。该方法包括以下步骤A.将巫山淫羊藿种子消毒后于0～10℃低温沙藏层积处理；B.将层积处理后的种子进行消毒处理，再用无菌镊子将种胚剥出，备用；C.将消毒后的种胚接种于诱导培养基中培养，使种胚诱导愈伤组织而分化出不定芽，或者使种胚直接诱导出芽；D.将步骤C中所得芽转入增殖培养基中，生成组培丛芽；E.将步骤D诱导分化的芽丛长成的小植株转入生根培养基中，培养以形成白色须根，进而形成完整植株。该方法可以提高巫山淫羊藿的繁殖系数，缩短繁殖周期，对于保护野生巫山淫羊藿资源，促进其可持续利用及产业化具有重要价值。