专利名称：用人源化抗-EGFR IgG1抗体和伊立替康治疗癌症的制作方法用人源化抗-EGFR IgGI抗体和伊立替康治疗癌症 本发明涉及用于治疗癌症的药剂和药物组合物。本发明特别涉及在癌症治疗中组合使用的人源化抗-EGFR IgGl抗体和伊立替康(irinotecan)。癌症是各种各样的细胞恶性肿瘤的通用名，其特征为生长失控、缺少分化、和能够侵袭局部组织并转移的能力。这些恶性肿瘤以不同的发病率影响体内的每种组织和器官。在过去的几十年中已经开发了多种用于治疗各种类型癌症的治疗剂。最常用的抗癌剂类型包括微管破坏剂(Microtubule disruptors)(例如长春花生物碱(vinca alkaloids)如长春碱(vinblastine)或长春新碱(vincristine),紫杉烧类(taxanes) 如多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)，埃坡霉素^pothilones)如伊沙匹隆(ixab印ilone))，抗代谢物(antimetabolites)(例如抗叶酸(anti-folates)如甲氨蝶呤(methotrexate)或氨基蝶呤(aminopterin)，抗嘌呤(anti-purines)如氟达拉滨(fludarabine),抗啼唆(anti-pyrimidines)如氟尿啼唆(fluorouracil),卡培他滨(capecitabine)或吉西他滨(gemcitabine)),拓扑异构酶抑制齐[J (topoisomerase inhibitors)(例如喜树喊(camptothecin)，伊立替康(irinotecan)或依托泊昔 (etoposide))，DNA插入剂(DNA intercalators)(例如多柔比星(doxorubicin)，柔红霄素 (daunorubicin),方文线菌素(actinomycin),博来霉素(bleomycin)),烧化剂(alkylating agents)(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，卡莫司汀 (carmustine)，尼莫司汀(nimustine)，链佐星(streptozocin)，白消安(busulfan)，顺钼(cisplatin)，奥沙利钼(oxaliplatin)，曲他胺(triethylenemelamine)，达卡巴嗪 (dacarbazine))禾口激素疗法(hormonal therapy)(例如糖皮质激素(glucocorticoids), 芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors)如他莫昔芬(tamoxifene)，抗雄激素 (antiandrogens)如氟他胺(flutamide)，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)类似物如亮丙立德(Ieuprolide))。伊立替康(irinotecan) (CamptO )是拓扑异构酶I抑制剂。该物质是喜树碱 (camptothecin，一种天然生物碱)的半合成类似物。其常常与其它化疗剂组合用于治疗不同类型的癌症，例如结肠癌。最近，癌症疗法中的靶向疗法的重要性已经增加。此类物质_小分子或生物治疗药物如抗体-干扰特异性靶标，例如已知促进致癌作用和肿瘤生长的细胞表面受体。表皮生长因子受体(EGFR)和抗-EGFR抗体人表皮生长因子受体(也已知为HER-I或ErbB-I，并且在本文中称作〃 EGFR") 是170kDa的跨膜受体，其由c-erbB原癌基因编码，并且显示固有的酪氨酸激酶活性 (Modjtahedi 等，Br. J. Cancer (英国癌症杂志)73 :228_235 (1996) ；Herbst 禾Π Shin, Cancer (癌症)94 :1593_1611 (2002))。SwissProt 数据库登录号 P00533 提供了 EGFR 的序列。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于SwissProt数据库登录号Ρ00533-1，Ρ00533-2，Ρ00533-3，和P00533-4确定的那些。 已知EGFR结合包括以下各项的配体表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-a (TGF-α ), 双调蛋白，肝素结合EGF(HB-EGF)，β动物纤维素，和印iregulin(Herbst和Shin，Cancer (癌症)94 1593-1611 (2002) ；Mendelsohn 禾口 Baselga，Oncogene (致癌基因)19 6550-6565(2000))。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径(Atalay等，Ann. Oncology (肿瘤学年报)14 1346-1363 (2003) ；Tsao和 Herbst，Signal (信号)4 :4_9(2003) ；Herbst 和 Shin，Cancer (癌症)94 1593-1611(2002)； Modjtahedi 等，Br. J. Cancer (英国癌症杂志)73 :228_235 (1996))。 EGFR的过表达已经在许多人类恶性病症中报道，包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌(Atalay等，Arm. Oncology (肿瘤学年报)14，1346-1363 (2003) ；Herbst 和 Shin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002) Modjtahedi 等，Br. J. Cancer (英国癌症杂志)73，228-235 (1996))。在这些病症的许多中，EGFR的过表达与患者的差的预后相关或关联。(Herbst和Shin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002) Modjtahedi 等，Br. J. Cancer (英国癌症杂志)73，228-235 (1996))。EGFR 也在正常组织的细胞中表达，特别是皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织，尽管通常水平比在恶性细胞中低 (Herbst 和 Shin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002))。已经报道了靶向EGFR和阻断EGFR信号传导途径的各种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，卡纳替尼(canertinib)/ CI-1033，培利替尼(pelitinib)/EKB-569, neratinib/HKI-272，拉帕替尼(Iapatinib)/ GW572016以及其它等等阻断在胞内酪氨酸激酶区域内EGFR的自磷酸化，由此抑制下游信号传导事件(Tsao和Herbst，Signal (信号)4，4-9 (2003))。另一方面，单克隆抗体，靶向 EGFR的胞外部分，导致阻断配体结合并由此抑制下游事件如细胞增殖(Tsao和Herbst， Signal (信号)4，4-9 (2003))。已经产生了几种鼠单克隆抗体，其获得这种体外阻断并且已经在小鼠异种移植模型中评估它们影响肿瘤生长的能力(Masui，等，Cancer Res.(癌症研究)46， 5592-5598(1986) ；Masui，等，Cancer Res.(癌症研究)44，1002-1007 (1984) ；Goldstein, 等，Clin. Cancer Res.(临床癌症研究)1，1311-1318 (1995))。例如，EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals)是针对人鳞状细胞癌细胞系A431产生的鼠抗-EGFR单克隆抗体，并且在喉或下咽部晚期鳞状细胞癌患者的临床研究中检验(Bier等，Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252，433-9 (1995))。另外，结合EGFR胞外结构域的大鼠单克隆抗体 ICR16, ICR62，和ICR80已经显示有效抑制EGF和TGF-α受体的结合(Modjtahedi等， Int. J. Cancer (国际癌症杂志)75，310-316 (1998))。鼠单克隆抗体(mAb)425是另一种针对人A431癌细胞系产生的mAb并且发现在人表皮生长因子受体的外部结构域上与多肽表位结合(Murthy等，Arch Biochem Biophys (生物化学和生物物理学档案)252， 549-560(1987))。在治疗中使用鼠抗体的潜在问题是非人单克隆抗体可以被人宿主识别为外源蛋白；因此，重复注射这些抗体可导致诱导免疫应答，导致有害的过敏反应。对于鼠单克隆抗体，这经常被称为人抗小鼠抗体或"HAMA"应答，或人抗大鼠抗体或"HARA"应答。此外，这些“异源”抗体可以被宿主的免疫系统所攻击从而使它们，在达到它们的靶位点前被有效地中和。另外，非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)典型地缺乏人效应子功能性，即它们不能，特别是通过抗体依赖性细胞_介导的细胞毒性或Fc-受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性的裂解或溶解人靶标细胞。为避开这些问题，已经开发了嵌合的，人源化的或甚至完整的人抗体，其中仅可变结构域，互补决定区(CDRs)或根本没有任何部分分别是鼠来源，而该抗体的所有其它部分，特别是Fc区，是人来源。例如，IMC-C225/西妥昔单抗(cetuximab) ( Erbitux ; ImClone)是嵌合小鼠 / 人抗-EGFR mAb (基于小鼠M225单克隆抗体，其在人临床试验中导致HAMA应答)，其已经报道在各种人异种移植模型中显示抗肿瘤功效(Goldstein等，Clin Cancer Res (临床癌症研究)1，1311-1318(1995) ；Herbst 和 Shin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002)) IMC-C225 的功效已经归因于几个机制，包括抑制通过EGFR信号传导途径，和可能通过增加的抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)活性调节的细胞事件(Herbst和Siin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002))。IMC-C225也用于临床试验中，包括与放射疗法和化学疗法组合 (Herbst 和 Shin，Cancer (癌症)94，1593-1611 (2002))。另外，美国专利号 5，891，996 (Mateo de Acosta del Rio等，)讨论了针对EGFR的鼠/人嵌合抗体，R3。人源化的基于R3 的抗体，h-R3/ 尼妥珠单抗(nimotuzumab)Mateo 等，Immunotechnology (免疫技术)3， 71-81(1997) ；Crombet-Ramos 等，ht J Cancer (国际癌症杂志)101，567-575 Q002)， Boland& Bebb, Expert Opin Biol Ther (生物学理论专家观点)9，1199-1206 (2009)，正被 Oncoscience (Wedel，德国)开发用于癌症治疗。美国专利号5，558，864讨论产生鼠抗-EGFR 单克隆抗体(mAb) 425的嵌合和人源化形式，人源化的基于mAb 425的抗体，EMD72000/马妥珠单抗(matuzumab) (Bier 等，Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学免疫理论)46， 167-173(1998)，Kim，Curr Opin Mol Ther (现代分子理论观点)6，96-103 Q004))正被 Merck (Darmstadt，德国)开发用于癌症治疗。Abgenix，he. (Fremont, CA)开发了 ABX-EGF/ 帕尼单抗(panitumumab)用于癌症治疗。ABX-EGF是完整的人抗-EGFR mAb (Yang等， Crit Rev Oncol/Hematol (肿瘤学/血液学评论)38 ； 17-23 (2001))。另一种完整的人抗-EGFRmAb，2F8/扎芦木单抗(zalutumumab)已经被 Genmab Inc. (Princeton, NJ)开发 (Bleeker 等，J Immunol (免疫学杂志)173，4699-4707 0004)，Lammerts van Bueren, PNAS 105,6109-6114(2008))ο抗体糖基化寡糖成分可以显著地影响与治疗性糖蛋白的功效有关的性质，包括物理稳定性， 对蛋白酶攻击的抗性，与免疫系统的相互作用，药物代谢动力学，和特异性生物活性。这些性质可以不仅依赖于寡糖的存在或缺乏，还依赖于寡糖的特定结构。可以在寡糖结构和糖蛋白功能之间进行一些总结。例如，某些寡糖结构通过与特异性糖结合蛋白相互作用介导糖蛋白从血流中快速清除，而其它的可以被抗体结合并且触发不需要的免疫反应。 (Jenkins 等，Nature Biotechnol.(自然生物技术)14，975-81 (1996))。IgGl型抗体，在癌症的免疫疗法中最常用的抗体，是在每个CH2结构域的Asn 297 具有保守的N-联糖基化位点的糖蛋白。与Asn 297连接的两个复合双触角寡糖隐藏在CH2 结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)是必要的(Lifely等，GlyC0bi0l0gy(糖生物学)5，813-822 (1995) Jefferis 等，Immunol Rev (免疫学综述)163，59-76 (1998) ；Wright 和 Morrison, Trends Biotechnol (生物技术趋势)15，26-32 (1997))。单克隆抗体如上文提及的抗-EGFR抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab)，尼妥珠单抗(nimotuzumab)，帕尼单抗(panitumumab))的细胞介导的效应子功能可通过如Umafia 等，Nat BiotechnoK 自然生物技术)17，176-180 (1999)和美国专利号 6，602，684 (WO 99/54342)的描述改造(engineering)它们的寡糖组分而增强。Umana等人显示，§ (1， 4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III (GnTIII)，一种催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达显著增加了在那些细胞中产生的抗体的体外ADCC活性。Asn 297碳水化合物的组成中的改变或其消除也影响抗体Fc-结构域结合 FcaR和 Clq 蛋白(Umana 等，Nat Biotechnol (自然生物技术)1了，176_180 (1"9)； Davies 等，Biotechnol Bioeng (生物技术生物工程)74，288-294 (2001) ；Mimura 等， J Biol Chem(生物化学杂志)276，45539-45547 (2001) ；Radaev 等，J Biol Chem(生物化学杂志)276，IM78-IM83(2OOl) ；Shields 等，J Biol Chem(生物化学杂志)276， 6591-6604(2001) ；Shields 等，J Biol Chem(生物化学杂志)277，26733-26740 (2002)； Simmons 等，J Immunol Methods (免疫学方法杂志)263，133-147 (2002))。 抗瘤药物应该理想地选择性杀伤癌细胞，具有相对于其对非恶性肿瘤细胞毒性而言更为宽泛的治疗指数。即使延长暴露于该药物后，其同样保留针对恶性肿瘤细胞的功效。 遗憾的是，没有一种目前的抗癌疗法具有这种理想的特性。相反，多数具有非常窄的治疗指数。此外，癌细胞暴露于轻微亚致死浓度的抗瘤剂通常会形成对该药剂的抗性，形成对一些其它抗瘤制剂的交叉抗性也是很常见的。因此，需要治疗瘤形成和其它增生疾病的更有效的疗法。用于提高目前药物治疗功效的策略涉及改变它们的给药时间表，以及与其它抗癌剂或者生化调节剂结合使用。众所周知的组合治疗是一种这样的方法其可以产生相对于单独使用治疗性相关剂量的每一种制剂更好的功效和减少的副作用。在一些情况下，药物组合的功效是加成性的(组合的功效基本上等于每种药物单独功效的总和)，但在其他情形中，功效是协同的(组合的功效大于每种药物单独给药功效的总和)。例如，当与5-氟尿嘧啶(5-f Iuorouraci 1)和亚叶酸 (Ieucovorin)组合时，奥沙利钼(oxaliplatin)作为结肠直肠癌的一线治疗显示25-40% 的应答率(Raymond，E.等，Semin Oncol (肿瘤学讲座)25 (2Suppl. 5)，4-12 (1998))。同样，与用单一药剂治疗相比，组合使用针对癌细胞表面上的特异性靶标的抗体和化疗剂可以增加抗癌功效。发明描述认识到将靶向癌症进展中涉及的癌细胞上的表面受体的抗体和化疗剂组合的重大治疗潜力，本发明提供用于在治疗癌症中组合应用的人源化抗-EGFR IgGl抗体和伊立替康。本发明还包括特别是用于在治疗癌症中应用的药物组合物，其包含在药用载体中的人源化抗-EGFR IgGl抗体和伊立替康。本发明还涉及用于癌症治疗的方法，包括向有需要的受试者施用人源化抗-EGFR IgGl抗体和伊立替康。优选地，意欲同时或者顺序施用给患者治疗有效量的人源化抗-EGFR IgGl抗体和伊立替康的组合，其在相同或不同制剂中，并且使用或者不使用另外的药剂或者疗法，诸如其它的抗癌药物或者放射疗法。本发明有用的优选的人源化抗-EGFRIgGl抗体描述于W02006/082515和WO2008/017963中，其全部内容通过引用并入本文，包括这样的抗体，其特征在于它们是嵌合抗体，具有大鼠单克隆抗体ICR62的结合特异性并且它们的效应子功能通过改变的糖基化而被增强。优选的抗-EGFR抗体的特征在于它们包含大鼠ICR62抗体的至少一个(即，一个， 两个，三个，四个，五个，或六个)互补决定区(CDR)，或含有所述CDR的至少特异性决定残基并且包含来源于异源多肽的序列的其变体或截短形式。所谓“特异性决定残基”意思是直接参与与抗原相互作用的那些残基。具体地，优选的抗-EGFR抗体包含(a)重链CDRl 序列，其选自由下述序列组成的组SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO -.9, SEQ ID NO :10， SEQ ID NO =11, SEQ ID N0:12，和SEQ IDNO 13 ;(b)重链CDR2序列，其选自由下述序列组成的组SEQ ID NO :14，SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :16，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :18，SEQ IDNO :19，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :21，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，SEQID NO :24，SEQ ID NO 25,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO :29JPSEQ ID NO 30 ； 和(c)重链⑶R3序列SEQ ID NO :31。优选的抗-EGFR抗体还包含(a)轻链⑶Rl序列， 其选自由SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33组成的组；(b)轻链CDR2序列SEQ ID NO 34 ；禾口 (c)轻链 CDR3 序歹Ij SEQ ID NO :35。 更优选的抗-EGFR抗体的特征在于它们包含大鼠ICR62抗体的至少三个⑶R，或含有所述CDR的至少特异性决定残基的其变体或截短形式。本发明有用的最优选的抗-EGRF抗体包含a)在重链可变结构域中的 SEQ ID NO 1 的 CDRl，SEQ ID NO 16 的 CDR2 和 SEQ ID NO 31 的 CDR3，和b)在轻链可变结构域中的 SEQ ID NO 33 的 CDRl，SEQ ID NO 34 的 CDR2 和 SEQ ID NO 35 的 CDR3。本发明有用的优选抗-EGFR抗体的可能⑶R序列总结于表1(重链⑶Rs)和表 2 (轻链CDRs)中。表1.优选抗-EGFR抗体的重链⑶R氨基酸序列。*本发明提供用于在治疗癌症中组合应用的人源化抗-EGFR IgG1抗体和伊立替康，伴有或不伴有另外的药剂或治疗，如其它抗癌药物或放射疗法。本发明还包括药物组合物，其由在药用载体中的人源化抗-EGFR IgG1抗体和伊立替康的组合构成。