专利名称：一种检测水体中弧菌的多重荧光pcr试剂盒及检测方法目前致病性弧菌传统的检测方法还是通过微生物培养进行分离鉴定，尚不够完善，其需经过多个筛选步骤，需要多种培养基，耗时较长；另有利用弧菌的单克隆抗体检测的方法，该方法要求挑取单一的菌落大量增菌后利用免疫学方法鉴定，特异性较高，但两种方法检测所需时间均较长。在分子生物学检测方 面，FDA标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序。国内的检测试剂设计PCR检测方法时也只是能够同时检测3种弧菌，而且关注的都是01型和0139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，检测样品也主要是针对食品当中的弧菌的检测。但是除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已开始关注其他致病性弧菌以及弧菌在环境水体中的存在。例如，有害的水生生物和病原体通过船舶压舱水进入新环境已被世界环保基金(GEF)确定为全球海洋面临的重大威胁之一。《国际卫生条例(2005)》将国际航行船舶压舱水作为口岸的重要监管对象，作为检验检疫部门承担着对压舱水携带病原生物的监管职责，其中压舱水中就包括霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌的存在。四重荧光PCR技术原理是基于单色荧光PCR技术，是指在同一个荧光PCR扩增试验中同时扩增四个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高且容易漏检的问题。由于在水体中存有多种弧菌，因此，有必要研究一种方法，可有效富集水体中的细菌数量并可同时检测多个致病性弧菌。这样，可以在加快检测速度的同时大幅提高检出率，减少工作量和检测成本，以适应卫生检验的新的形式需求，与国际方法接轨。
本发明提供了一种水体中致病性弧菌的四重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，具有有效富集水体中的细菌数量，无需前增菌过程，并可同时检测创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌等4种致病性弧菌的优点，可以在加快检测速度的同时大幅提高检出率，减少工作量和检测成本。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种检测水体中弧菌的多重荧光PCR试剂盒，该试剂盒是在创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物，利用PCR技术结合细菌富集方法对创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌进行快速检测；此技术无需前增菌步骤，大大缩短了操作时间，同时减少了污染，具有潜在的应用价值。具体的说，该试剂盒包括浓度为5U/ul的TaqDNA聚合酶、多重荧光PCR反应母液、细菌富集试剂、DNA提取试剂。其中多重荧光PCR反应母液含有多重IOX荧光PCR反应缓冲液、创伤弧菌引物、创伤弧菌探针、溶藻弧菌引物、溶操弧菌探针、拟态弧菌引物、拟态弧菌探针、河弧菌引物、河弧菌探针、牛血清白蛋白；多重IOX荧光PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁；细菌富集试剂含有PEG8000、氯化钠；DNA提取试剂含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、乙二胺四乙酸、NP40。具体细菌富集试剂配制PEG8000和氯化钠溶于纯水配成PEG8000质量百分浓度为20%、氯化钠终浓度为200mM的细菌富集试剂，冰箱4 oC保存。DNA提取试剂含有终浓度20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸、终浓度的IOOmM氯化钾、终浓度2. 5mM的乙二胺四乙酸、质量百分终浓度1%的NP40，余量为超纯水，冰箱4 oC保存。多重10XPCR反应缓冲液含有终浓度IOOmM的三羟甲基氨基甲烷盐酸，终浓度500mM的氯化钾，质量百分终浓度50%的甘油，终浓度各为O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP (四种单核苷酸单体)，终浓度2mM的氯化镁，余量为超纯水；多重荧光PCR反应母液按下述体积比配制多重10XPCR反应缓冲液 2. 5ul，浓度 20mg/ml 牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VV Pf、VVPr、VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各O.2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul，探针 VVPb、VAPb、VMPb、VFPb 各 O. 4ul，无 RNA 酶 DEPC 水18. 3ul，配制混合后于冰箱-20°C保存。还可以有阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为连接有创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆载体；阴性对照品为无DNA酶的DEPC水。上述引物和探针是依据创伤弧菌WhA基因保守序列设计引物、探针VVPf: GTTAACGGCTGGAGCTGTC，VVPr: ACGGTCAAACAACGATCGGA,VVPb: ROX-CGGCAAACTTGGTTCCAACTGCCG-DABCYL, 依据溶藻弧菌collagenase基因保守序列设计引物、探针
VAPf: GTGGAACGAGCAATTTGTGC,
VAPr: CCCGACCATACATTTCATACTGT,
VAPb: HEX-CCGGGACAACAGAACTCGCGTTACCCGG-DABCYL,
依据拟态弧菌toxR基因保守序列设计引物、探针
VMPf: AGGAAACTGGAATCGATTTTTCC,
VMPr: GCTAACGGAATCAACATCGC,
VMPb: FAM-CGGGGATCAACAAAATCAGCCGAGTCCCCG-DABCYL ；
依据河弧菌toxR基因保守序列设计引物、探针
VFPf: GCCGTATCCTCTTCAGAACTT,
VFPr: GACGGCAACCAACAGAATCAA,
VFPb: CY5-CGGCGCAGTTATTACTCAGACGTCGCCG-DABCYL。利用该试剂盒检测水体中弧菌的方法，由下述步骤组成
a、细菌富集在无菌条件下，取待检水样与上述细菌富集试剂按100 1的比例充分混合，继而13000rpm离心20分钟，然后弃去上清，并加入O. 5ml的质量百分浓度O. 5%的无菌生理盐水将沉淀物充分打散得到细菌富集液；b、核酸DNA提取取50ul细菌富集液及50ul DNA提取试剂于I. 5ml离心管中，振荡混匀后，96-100°C水浴lOmin，13000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20°C环境下储存备用；
c、25ul反应体系配制取2ulDNA模板或阳性对照或阴性对照至PCR管中，加入22.6ul多重荧光PCR反应母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，进行多重荧光PCR扩增；
d、多重荧光PCR反应在四色荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为ROX、HEX、FAM及CY5通道，分别用于检测创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌；反应条件940C预变性3min;94°C变性15s，55°C退火40s，72°C延伸15s，40次循环。设置完成后，保存文件，运行程序；
e、检测结果判断出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性，没有出现S形扩增曲线，或者有扩增曲线但不呈S形、阈值超过40为阴性，出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验仍出现S形扩增曲线 ，阴性对照没有污染，可判断为阳性。本发明采用了创新的细菌富集试剂技术、DNA提取试剂技术、特异性荧光探针杂交PCR检测技术以及多重PCR技术，样本无需增菌培养，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，且一次能检测4种弧菌。本发明的有益效果主要体现在无需样本前增菌，细菌的检测敏感性高、特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现同时对创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌的快速、准确、特异检测。

一种检测水体中致病性弧菌的多重荧光PCR试剂盒，该试剂盒由多重荧光PCR反应母液、细菌富集试剂(含有质量百分终浓度20%的PEG8000、终浓度200mM的氯化钠)、DNA提取试剂(内含终浓度20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸、终浓度的IOOmM氯化钾、终浓度2. 5mM的乙二胺四乙酸、质量百分终浓度1%的NP40)、浓度为5U/ul的Taq DNA聚合酶组成，其中多重荧光PCR反应母液按下述体积比配制多重IOX荧光PCR反应缓冲液(内含终浓度IOOmM的三羟甲基氨基甲烷盐酸，终浓度500mM的氯化钾，质量百分终浓度50%的甘油，终浓度各为O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，终浓度2mM的氯化镁)2. 5ul，浓度20mg/ml牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VVPf、VVPr, VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各 O. 2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul,探针VVPb、VAPb、VMPb、VFPb各O. 4ul，无RNA酶DEPC水18. 3ul。还可以有阳性对照品连接有创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆载体；阴性对照品无DNA酶的DEPC水。上述引物及探针针对溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌、创伤弧菌核酸序列进行生物信息学分析，应用Clustalw等软件分析序列的同源性，设计并筛选本发明的各引物和探针序列，由上海英骏公司合成。实施例2
I、选取如下病原微生物，实验组溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌、创伤弧菌；对照组01群霍乱弧菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌和沙门氏菌，上述病原菌株均自环境样本分离培养保存溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌、创伤弧菌、Ol群霍乱弧菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌及沙门氏菌由本研究院周冬根等同志，在2011年3月左右于宁波市内各水体中采集、分离培养，联系电话为0574-87169626。2、模拟环境样本制备分别将O. 5ml的浓度均为I X 105CFU/ml的溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌、创伤弧菌、01群霍乱弧菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌及沙门氏菌与500ml的饮用水充分混合，制成浓度均为103CFU/ml的模拟环境样本。3、细菌富集在无菌条件下，取5份采集自船舶压舱水的待检水样50ml与O. 5ml细菌富集试剂充分混合，继而13000rpm离心20分钟，然后弃去上清，并加入O. 5ml的O. 5%的无菌生理盐水将沉淀物充分打散；
4、核酸DNA提取取50ul各模拟环 境样本和各份细菌富集液分别与50ulDNA提取试剂加入I. 5ml离心管中，振荡混勻后，96-100°C水浴lOmin, 13000rpm离心5min,取上清液作为DNA模板，_20°C环境下储存备用；
5、25ul反应体系配制取2ulDNA模板或阳性对照或阴性对照至PCR管中，加入22.6ul多重荧光PCR反应母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，进行多重荧光PCR扩增；
6、多重荧光PCR反应在四色荧光定量PCR仪(市售)上进行，探针检测模式设置为Reporter Dye: ROX、HEX、FAM及CY5通道，分别用于检测创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌；反应条件94°C预变性3min;94°C变性15s，55°C退火40s (检测荧光)，72°C延伸15s，40次循环。设置完成后，保存文件，运行程序；
7、检测结果判断方法出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性，没有出现S形扩增曲线，或者有扩增曲线但不呈S形、阈值超过40为阴性，出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验仍出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性，结果实验组溶藻弧菌、拟态弧菌、河弧菌及创伤弧菌检测均为阳性，而对照组中的01群霍乱弧菌、0139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌及沙门氏菌均为阴性，特异性高，用阳性对照品倍比稀释后检测灵敏度达到lOOOcopies/ml。待检水样结果4份样本检测结果为HEX通道呈S形扩增曲线，Ct值在19-23之间，为溶藻弧菌感染；1份样本检测结果为ROX通道呈S形扩增曲线，Ct值为37. 4，重复检测仍出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，为阳性创伤弧菌感染。实施例3
3份待检饮用水水样与实施例2中步骤3、4、5、6、7相同方式检测，结果I份待检饮用水水样CY5通道呈S形扩增曲线，Ct值在32，有河弧菌感染。


本发明公开了一种水体中致病性弧菌的四重荧光PCR检测试剂盒及检测方法，采用了创新的细菌富集试剂技术、DNA提取试剂技术、特异性荧光探针杂交PCR检测技术以及多重PCR技术，样本无需增菌培养，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，且一次能检测4种弧菌。本发明的有益效果主要体现在无需样本前增菌，细菌的检测敏感性高、特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现同时对创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌及河弧菌的快速、准确、特异检测。