专利名称：人乳腺癌基因分型实时荧光定量pcr检测方法乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，全世界每年约有一百多万妇女患有乳腺癌，并且大约有50万名妇女死于该疾病。近年来，在中国乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，尤其是在沿海经济发达地区，乳腺癌发病率已居于女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌预后与癌细胞的侵袭和早期转移密切相关而转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。如何早期将具有潜在转移危险的患者筛选出来，给予有针对性的治疗是提高乳腺癌生存率的关键所在。ER、PR和HER-2受体的状态既与患者的预后相关，又能预测治疗的反应性。因此，在临床上，被作为一种公认的基因分型及预后因子而纳入治疗指南，其检测结果作为制定患者治疗方案及预后判断的最重要指标。雌激素受体(ER)属于能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，介导雌激素的多向效应。与雌激素结合时，热休克蛋白分离，丝氨酸与苏氨酸磷酸化，然后受体与另一 ER单体发生二聚化作用，激活E-ER复合物，并促进受体二聚物与位于靶基因启动子区域的雌激素反应原件(ERE)结合，诱发或抑制基本转录机制的装配，刺激靶基因转录，从而调节雌激素促进细胞增生，分化和维持正常的生理功能。ER在人体内广泛分布，除生殖系统夕卜，其它组织如骨骼、心脏、血管、神经、肝脏、皮肤等均有发现。ER包括ERa、ERi3两种亚型。ERa的表达状态与乳腺癌患者的预后明显相关，并指导内分泌治疗，是选择治疗方案的重要标志物(Speirs V, Kerin MJ. Prognostic significance of oestrogen receptorbeta in breast cancer. Br J Surg, 2000,87 (9) :1248-9)。Ricketts 等发现在正常人乳腺组织中ERa表达水平较低，平均为4 fmol/mg，肿瘤发生后，根据ERa表达水平的高低可以将乳腺癌病人分为ERa阳性和ERa阴性两类，早期的乳腺癌病人大约有60%为ERa阳性，癌组织中ERa表达升高，可以达到100 fmol/mg，其中2/3的病人对内分泌治疗有效。超过1/3的早期病人为ERa阴性，癌组织中几乎检测不到ERa的表达。而且随着肿瘤的发展，部分ERa阳性病人可能转变为ERa阴性，同时内分泌治疗也失去疗效(Ricketts D, Turnbull L, Ryall G, et al. Estrogen and progesterone receptorsin the normal female breast. Cancer Res, 1991, 51 (7): 1817 1822)。英国诺丁汉城市医院国家卫生联合协会Rakha等对1944例对可手术的原发侵袭性乳腺癌的长期随访资料显示ER阳性乳腺癌多见于年长、绝经后妇女，肿瘤分化程度中等，对三苯氧胺(TAM)和芳香化酶抑制剂等内分泌治疗有效；ER阴性多见于年轻、绝经前妇女，肿瘤分化程度低，对内分泌治疗基本无效(Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, et al. Biologic andclinical characteristics of breast cancer with single hormone receptor positivephenotype. JClin Oncol, 2007, 25(30) : 4772-8)。ER 阳性如有复发时常倾向于皮肤、软组织或骨转移；ER阴性则倾向于内脏转移，预后效果较ER阳性差。孕激素受体(PR)是核受体超家族中的一员，与其它的核受体一样，可以配体或非配体方式，通过与共活化分子和共抑制分子相互作用调控靶基因的转录，影响其转录活性，进而影响乳腺的正常发育，导致肿瘤的发生。PR基因主要编码两个异构体PR-A和PR-B。PR-B是一个转录活化因子，PR的主要活性形式，而PR-A则表现为PR-B转录活性的抑制因子。二者在多数正常的孕激素靶向细胞中的共表达水平是相似的，它们之间的平衡调控着多种其它基因。当PR-A和PR-B的比例明显改变时，就会造成孕激素信息传递的改变，这种异常的信号与乳腺癌的发生发展有关，而且PR-A/PR-B的比值越高，患者的预后越差(Rebecca L, Arnett-Mansfield, Anna deFazio, et al. Relative Expression ofProgesterone Receptors A and B in Endometrioid Cancers of the Endometrium..CANCER RESEARCH，2001，61 :4576 - 4582，)。Shyamala 等发现在 PR-A 过量表达的转基因小鼠中，乳腺组织的分支增多，导管增生现象明显，而且细胞与细胞之间的粘附能力减弱(Shyamala G,Yang X, Silberstein G, et al. Transgenic mice carrying an imbalancein the native ratio of A to B forms of progesterone receptor exhibit development 的转基因小鼠中，乳腺组织的血管发育不全，腺管、腺泡发育异常(Shyamala G, Yang X，Cardif RD, et al. Impact of progesterone receptor on cell-fate decisions duringmammary gland development. PNAS, 2000, 97 (7) : 3044-9)。Graham 等通过免疫印迹分析了 202例PR阳性的乳腺癌标本发现，59%的肿瘤组织中PR-A的表达水平高于PR-B的表达水平，其中25%的肿瘤PR-A的表达水平高于PR-B 4倍以上。另一项对53例PR阳性乳腺癌的研究表明，PR-B的过表达与Her-2/neu的低表达相关，提示预后良好。而PR-A的过表达与更差的分化表型和更高的肿瘤分级有关。PR-A过表达的乳腺癌细胞系，表现出明显的形态学改变和粘附特性的丧失，提示PR-A的过表达对乳腺是不利因素。最近有学者应用PR敲除的小鼠模型证明，PR在二甲基苄基蒽诱导的乳腺癌发生过程中起作用。用抗孕激素药物和PR反意寡核苷酸则可明显抑制肿瘤的生长。人表皮生长因子受体2 (HER-2)属于受体酪氨酸激酶(RTK)类癌基因，是表皮生长因子受体家族的成员之一。Her基因定位于染色体17q2f 22区，转录4. 8 kb的mRNA，编码185 ku具有酪氨酸激酶活性的单链跨膜糖蛋白(Gupta D, Middleton L P, Whitaker M J,Abrams J. Comparison of fluorescence and chromogenic in situ hybridization fordetection of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Am J Clin Pathol, 2003, 119:381- 387)。Her家族有4个成员，分别为Her-l、Her-2、Her-3和Her-4，位于细胞膜上，具有相似的结构。当HER受体细胞外结合区与表皮生长因子(EGFR)或其他生长因子相结合时，受体的酪氨酸激酶就会被活化，继而启动细胞内一连串的信号传导通路，可激活多种转录因子，引起细胞的增值、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应。HER蛋白在细胞膜上以无活性单体形式存在，必须形成同源或异源二聚体才能产生活化信号，HER2的异源二聚体大大减弱了 EGFR跟与cabl的偶联，减少了 EGFR在细胞内吞过程中的降解，促进EGFR循环回到细胞膜，使EGFR在细胞膜过度表达，加速了细胞的增殖，导致肿瘤形成和增长加快(ffingens M, Walma T, Vaningen H, et al. Structural analysis of an epidermalgrowth factor/transforming growth factor-alpha chimera with unique ErbB bindingspecificity. J Biol Chem, 2003, 278(40): 39114-39123)。HER2是与肿瘤生长、侵袭、转移有关的重要分子，是乳腺癌预后不良的独立危险因素。在20% 30%的乳腺癌中，存在HER2基因扩增引起HER2 mRNA和HER2受体蛋白的过度表达，而且在乳腺癌的早期阶段就可开始出现(Van de Vijve MJ. Assessment of theneed and appropriate method for testing for the human epidermal growth factorreceptor-2 (HER-2). Eur J Cancer, 2001, 37 (Suppl I): Sll一17)。临床研究发现，由于HER2/neu蛋白定位于浆膜，其扩散限制于双向，即使中等水平HER2过度表达也能产生受体结构上活化。免疫组化染色发现乳腺癌细胞的HER2蛋白水平比邻近正常乳腺上皮高10-100倍。HER2高表达与淋巴结转移、肿瘤分期晚呈正相关，与ER、PR呈负相关，且表达越高，预后越差，对TAM治疗反应率很低，但对赫赛汀治疗明显(杨顺娥，李迅.雌激素受体β和人类表皮生长因子受体2在乳腺癌中的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志，2007，29(10) : 767-768)。肿瘤的分型是对肿瘤进行诊断、判断预后、选择治疗方法以及进行各项研究的基 础，目前的分类还都是以组织病理学为基础的形态学分类，尽管这样基于病理组织学的传统分类对于临床肿瘤病人的治疗有着较好的指导意义。但肿瘤在分子水平具有高度的异质性，形态相同的肿瘤其分子遗传学改变不尽一致，从而导致肿瘤的预后及对治疗的反应差别很大。从分子水平对肿瘤进行分类，能更精确的判断肿瘤的生物学行为、估计预后并选择或研究更有针对性的个性化治疗方案。乳腺癌的主要基因如ER、PR和HER-2基因表达分型与药物选择和预后等密切相关，在临床检测中，ER、PR基因表达量高低与抗孕类激素药物敏感性有直接关系，直接决定了在临床中使用的药物是否有效，同时HER-2基因表达分型与药物赫赛汀敏感性有直接关系，直接决定了在临床中使用的药物是否有效，人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR(qPCR)方法的建立与应用，可对乳腺癌预后用药等提供直接理论依据。传统技术中，对ER、PR和HER-2的检测主要有赖于免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)和酶联免疫吸附法(ELISA)，这些方法费时费力，无法对正常人群的这三种基因分型进行检测。本发明采用的qPCR技术具有灵敏度高，结果可靠，快捷等特点，利用SYBR Green I法qPCR对人群或乳腺癌患者的ER、PR和HER-2基因进行遗传检测，从分子水平上为临床医生提供可靠的乳腺癌预后估计指标，方便其准确地预测患者的预后，从而进行及时、合理的个体化治疗。本发明克服了现有技术存在的常规PCR不能定量、可能存在非特异性扩增等缺陷，提出了一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR检测方法，具有兼具DNA扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性的有益效果。
本发明提出了一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，以人乳腺癌基因ERa (SEQ ID 9)、PR (SEQ ID 10),HER-2 (SEQ ID 11)作为扩增的靶基因序列，以18S rRNA (SEQ ID 12)作为内参基因，分别设计与所述ER a、PR、HER-2、18S rRNA基因相对应的特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法检测待测样品和对照样品的Ct值，计算靶基因表达量；利用△ ACT法对靶基因表达量进行分析，所述靶基因表达量=2_ΛΛετ，AACt= ( CT；target- CT；18S) (detected)- ( CT，target_ CT；18S) (control);当所述靶基因表达量彡 I 时，所述ERa、PR、HER-2基因为阴性分型；当所述靶基因表达量> I时，所述ER a、PR、HER-2基因为阳性分型。)(_trol);当所述靶基因表达量彡I时，所述ERa、PR、HER-2基因为阴性分型；当所述靶基因表达量> I时，所述ERa、PR、HER-2基因为阳性分型。本发明中，所述方法是以pMD 19_T作为质粒载体，分别以基因片段ER a (SEQ ID13),PR (SEQ ID 14),HER-2 (SEQ ID 15)、18S rRNA (SEQ ID 16)构建重组质粒作为标准品O本发明中，与所述ERa基因相对应的引物序列为 正向5’- ACCGAAGAGGAGGGAGAATG-3’ (SEQ ID I) 反向5，- AACAAGGCACTGACCATCTG-3’ (SEQ ID 2) 本发明中，与所述PR基因相对应的引物序列为 正向5’_ TTCACCAGGTCAAGACATACAG-3’ (SEQ ID 3) 反向5’_ GTTGCCTCTCGCCTAGTTG-3’ (SEQ ID 4) 本发明中，与所述HER-2基因相对应的引物序列为
正向5’_ TTACCAGTGCCAATATCCAGG -3’ (SEQ ID 5)
反向5’_ TCCAGAGTCTCAAACACTTGG -3’ (SEQ ID 6)
本发明中，与所述18S rRNA基因相对应的引物序列为
正向5’_ ATACCGCAGCTAGGAATAATGG-3’ (SEQ ID 7)
反向5’_ TCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’ (SEQ ID 8)
本发明中，“标准品”是指在为了确保待测样品的cDNA浓度在实时定量PCR线性范围内，确保检测的客观的准确性，制备的已知拷贝数的一系列质粒样本，在临床样本检测ERa、PR、HER-2及18S rRNA的基因表达中，将实时定量检测的临床样本的ERa、PR、HER-2及18S rRNA的Ct值与已知拷贝数的一系列质粒样本的Ct值进行比较，如果实时定量检测的临床样本的特定基因的Ct值在已知拷贝数的一系列质粒样本的Ct值的线性范围中，则可以确保检测的准确性。本方法中以pMD 19-T作为质粒载体，分别以基因片段ERa (SEQ ID 13),PR (SEQID 14)、HER-2 (SEQ ID 15)、18S rRNA (SEQ ID 16)构建重组质粒作为标准品，以确保待测样品的cDNA浓度在实时定量PCR线性范围内，确保检测结果的客观的准确性。本发明中，靶基因表达量=2_ΛΛσ，其中，Λ ACt=(
Ct，target ^T, 18S) (detected) (
CT，target- CT，18S)(_tMl)的公式中，CT，target 表示人乳腺癌基因 ERd (SEQ ID9)、PR(SEQ ID10), HER-2 (SEQ ID 11)的 qPCR 检测 Ct 值，CT，18S 表示内参基因 18S rRNA (SEQ ID 12)的qPCR检测Ct值。(
Ct，target ^T, 18S) (detected) 是待测样品ERa、PR、HER-2基因与内参基因18S rRNA的qPCR检测(^值之差，(CT；target- CT，18S) (_tMl是对临床中通过免疫组化(IDC)方法检测为阴性的乳腺癌组织的cDNA模板样本的ERa、PR、HER-2基因与内参基因18S rRNA的qPCR检测Ct值之差。本发明通过实时荧光定量PCR( qPCR)技术对人乳腺癌基因ERa、PR、HER-2进行分型检测，进而制定个体化治疗的方法。本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高灵敏度的荧光定量PCR对人乳腺癌基因ER a、PR、HER-2进行分型检测方法。该方法是通过设计特异的qPCR核酸引物进行PCR扩增，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，进而定量定性分析ER a、PR、HER-2型。
本发明提供一组人乳腺癌基因分型检测基因ERa、PR、HER-2、内参基因18S的qPCR引物，所述人乳腺癌基因分型检测基因ERa、PR、HER-2、内参基因18S的qPCR引物序列为
DERa的基因序列(SEQ ID 9)，详见NCBI编号:NM_000125，其qPCR引物核酸序列
为
正向5，- ACCGAAGAGGAGGGAGAATG-3’ (SEQ ID I)
反向5，_ AACAAGGCACTGACCATCTG-3’ (SEQ ID 2)
2)PR的基因序列(SEQID 10)，详见NCBI编号NM_000926，其qPCR引物核酸序列
为正向5’- TTCACCAGGTCAAGACATACAG-3’ (SEQ ID 3)
反向5’_ GTTGCCTCTCGCCTAGTTG-3’ (SEQ ID 4)
3)HER-2的基因序列(SEQ ID 11 )，详见NCBI编号NM_001005862，其qPCR引物核酸序列为
正向5’_ TTACCAGTGCCAATATCCAGG -3’ (SEQ ID 5)
反向5’_ TCCAGAGTCTCAAACACTTGG -3’ (SEQ ID 6)
4)内参基因18SrRNA基因序列(SEQ ID 12)，详见NCBI编号NM_003286，其qPCR引物核酸序列为
正向5’_ ATACCGCAGCTAGGAATAATGG-3’ (SEQ ID 7)
反向5’_ TCGCTCTGGTCCGTCTTG-3’ (SEQ ID 8)
本发明构建了人乳腺癌分型检测基因ERa、PR、HER-2、内参基因18S rRNA的qPCR检测方法，具体如下
l)qPCR扩增及建立检测标准曲线
(I)模板的制备
将制备的标准品作10倍系列稀释，以稀释液(Easy dilution)为模板。具体稀释浓度如下1，1:10，1:100，1:1000，1:10000。制备的标准品是扩增的特异性的基因片段ERa (SEQ ID 13)、PR (SEQ ID 14)、HER-2 (SEQ ID 15)、内参基因 18S rRNA (SEQ ID 16)的 PCR 产物转化 pMD 19_T 后纯化的质粒。质粒作为标准品的初始浓度为I. O X IO8拷贝每反应体系的质粒DNA，随后以1:10，1:100，1:1000，1:10000倍比稀释，用于制备检测标准曲线。


本发明公开了一种人乳腺癌基因分型实时荧光定量PCR检测方法，以人乳腺癌基因ERα(SEQID9)、PR(SEQID10)、HER-2(SEQID11)作为扩增的靶基因序列，以18SrRNA(SEQID12)作为内参基因，分别设计与所述ERα、PR、HER-2、18SrRNA基因相对应的特异性引物，采用实时荧光定量PCR方法检测待测样品和对照样品的CT值，计算靶基因表达量；利用ΔΔCT法对靶基因表达量进行分析，所述靶基因表达量=2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT,target-CT,18S)(detected)-(CT,target-CT,18S)(control)；当所述靶基因表达量≤1时，所述ERα、PR、HER-2基因为阴性分型；当所述靶基因表达量＞1时，所述ERα、PR、HER-2基因为阳性分型。本发明操作简便，检测灵敏度高，检测时间短，特异性、重复性好，结果准确可靠，可定性、定量检测，可用于一般人群或乳腺癌患者的基因分型鉴定，为乳腺癌患者提供了个性化用药的重要理论指标，对乳腺癌患者预后具有重要意义，具有很强的推广性和实用性。