一种增强生物相容性的人工骨支架材料及其制备方法[0002]在整形外科及生物医学工程中，制备得到性能优异的骨支架材料仍是关键问题之一。作为人体骨植入材料，该支架需要提供与天然骨相类似的微环境，利于细胞的粘附、增殖与分化，可引导血管的长入，具有较高的生物活性并且不可引起机体的免疫排斥炎症反应。[0003]生物相容性是制备支架材料过程中需要考虑的核心因素。而影响支架材料生物相容性的因素除了支架材料的自身结构之外，还有材料表面的物理化学性质及形貌特征。骨支架材料作为一种植入性材料，当其被植入人体之后，首先与血液发生作用，引起血浆蛋白及血小板的粘附而引起凝块现象。研究表明，具有一定的亲水特性的表面特性材料可以减少此类蛋白质的粘附，从而提高植入材料的生物相容性。因此，学者建议构建即具有一定的疏水特性又具有一定亲水特性的表面性质的支架材料。[0004]支架材料作为体内植入物，在植入初期细胞与支架材料的应答也是非常重要的一方面。支架材料需在植入部位提供一定的抗压支持，并具备合适的孔径及孔隙率，能够引导细胞及血管的长入，从而介导新骨的形成。而初始细胞的粘附与支架材料表面的化学组分、表面地势及粗糙程度大大相关。材料的化学组分应无毒副作用，不会影响细胞的增殖、分化，构架的支架材料表面应适宜细胞的贴壁和粘附，提高改善细胞与支架材料的应答过程。[0005]关于胶原蛋白-羟基磷灰石支架材料的构建已有相关研究，但制备工艺繁琐复杂，不利于放大化生产，或是微孔孔径不符合相应的技术需求(50-150--m)，孔径相对较小，不利于细胞的向内攀爬、生长及血管组织的长入。
[0006]本发明的目的是提供一种增强生物相容性的人工骨支架材料及其制备方法，生物相容性良好，制备工艺简单，微孔孔径适宜，利于放大化生产。[0007]本发明所采用的技术方案是:
一种增强生物相容性的人工骨支架材料的制备方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中，制备得到质量分数为20-40%的胶原蛋白溶
液；
步骤二:调节胶原 蛋白溶液的pH值至5-7 ；
步骤三:按照谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2-15U/g的比例添加谷氨酰胺转移
酶；
步骤四:按照胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1: (2-4)比例添加纳米羟基磷灰石，得到粘稠状乳浊液；
步骤五:将步骤四的粘稠状乳浊液转移至模具中，于30-55°C下反应24-36h，放置冷
却；
步骤六:90°C下进行酶灭活5min，放置冷却；
步骤七:超低温冰箱-80°C下预冻3h，之后真空冷冻干燥48h。
[0008]步骤一中，胶原蛋白为动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶，或采用基因工程法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
[0009]步骤二中，pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，摩尔体积浓度为0.01-lmol/L ;或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.01-1mol/L0[0010]所述的一种增强生物相容性的人工骨支架材料的制备方法制得的增强生物相容性的人工骨支架材料。
[0011]本发明具有以下优点:
本发明中的增强生物相容性的人工骨支架材料，以谷氨酰胺转移酶作为交联剂，没有有毒物质及有机溶剂的引入与残留，有效的降低了产物的安全隐患，提高了其生物相容性；通过调节原料分子间及分子内的交联度可实现产品的降解速率可控性，同时产物即保留了羟基磷灰石的骨诱导性、骨传导性，同时又不会影响胶原蛋白对细胞的粘附、增殖等性能；提供的胶原蛋白基纳米羟基磷灰石复合人工骨具有适宜的微观结构，孔径在100-300 μ m之间，孔隙率在70-85%之间，适合细胞及血管组织的长入，有利于水分、营养物质等的传输；提供的胶原蛋白基纳米羟基磷灰石复合人工骨具有利于细胞粘附的地势形貌，表面粗糙，为细胞及相关生长因子提供了更多的粘附位点；提供的胶原蛋白基纳米羟基磷灰石复合人工骨表面具有一定的亲水特性又具有一定的疏水特性，降低了血小板等的粘附，大大的提高了材料的生物相容性及材料与机体的应答过程。



[0012]图1为支架材料浸提液的体外细胞毒性分析，图中，MEM为细胞培养液，Scaffold为支架材料在培养液中的浸提液，纵轴为细胞成活率，横轴为时间。
[0013]图2为支架材料浸提液对细胞形态的影响分析，图中，A为细胞培养液，B为材料在培养液中的浸提液。
[0014]图3为小鼠成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)与支架材料共培养3d扫描电镜(SEM)分析。

[0015]下面结合对本发明进行详细的说明。
[0016]本发明涉及的一种增强生物相容性的人工骨支架材料的制备方法，以胶原蛋白为有机相，羟基磷灰石为无机相，采用交联技术使胶原蛋白发生分子间及分子内交联反应构建三维网状多孔结构，羟基磷灰石利用范德华力、氢键等物理作用力分散于胶原蛋白多孔网状结构中。本发明中选用酶作为交联剂，无有毒物质及有机溶剂的引入及残留，同时通过调节原料分子间及分子内的交联度可实现产品的降解速率可控。具体制备方法如下:步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中，制备得到质量分数为20-40%的胶原蛋白溶液。
[0017]胶原蛋白为动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶，或采用基因工程法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
[0018]步骤二:调节胶原蛋白溶液的pH值至5-7。
[0019]pH值调节剂选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液，摩尔体积浓度为
0.01-lmol/L ;或选自盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度为0.01-lmol/L。
[0020]步骤三:按照谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2_15U/g的比例添加谷氨酰胺转移酶。
[0021]步骤四:按照胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1: (2-4)比例添加纳米羟基磷灰石，得到粘稠状乳浊液。
[0022]步骤五:将步骤四的粘稠状乳浊液转移至模具中，于30_55°C下反应24_36h，放置冷却。
[0023]步骤六:90°C下进行酶灭活5min，放置冷却。
[0024]步骤七:超低温冰箱-80°C下预冻3h，之后真空冷冻干燥48h。
[0025]实施例1:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中，制备得到质量分数为20%的胶原蛋白溶液。
[0026]胶原蛋白为动物组织中提取的全长胶原蛋白、胶原蛋白多肽、明胶。
[0027]步骤二:调节胶原蛋白溶液的pH值至5。
[0028]pH值调节剂选取氢氧化钠溶液、盐酸溶液，摩尔体积浓度均为0.01-lmol/L。
[0029]步骤三:按照谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为2U/g的比例添加谷氨酰胺转移酶。
[0030]步骤四:按照胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1:2比例添加纳米羟基磷灰石，得到粘稠状乳浊液。
[0031]步骤五:将步骤四的粘稠状乳浊液转移至模具中，于30°C下反应24h，放置冷却。
[0032]步骤六:90°C下进行酶灭活5min，放置冷却。
[0033]步骤七:超低温冰箱-80°C下预冻3h，之后真空冷冻干燥48h。
[0034]实施例2:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中，制备得到质量分数为30%的胶原蛋白溶液。
[0035]胶原蛋白为采用基因工程法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
[0036]步骤二:调节胶原蛋白溶液的pH值至6。
[0037]pH值调节剂选自氢氧化钾溶液、硫酸溶液，摩尔体积浓度均为0.01-lmol/L。
[0038]步骤三:按照谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为8U/g的比例添加谷氨酰胺转移酶。
[0039]步骤四:按照胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1:3比例添加纳米羟基磷灰石，得到粘稠状乳浊液。
[0040]步骤五:将步骤四的粘稠状乳浊液转移至模具中，于40°C下反应30h，放置冷却。
[0041]步骤六:90°C下进行酶灭活5min，放置冷却。
[0042]步骤七:超低温冰箱-80°C下预冻3h，之后真空冷冻干燥48h。[0043]实施例3:
步骤一:将胶原蛋白溶解于去离子水中，制备得到质量分数为40%的胶原蛋白溶液。
[0044]胶原蛋白为采用基因工程法生产的重组胶原蛋白、类人胶原蛋白。
[0045]步骤二:调节胶原蛋白溶液的pH值至7。
[0046]pH值调节剂选自碳酸钠溶液、磷酸溶液，摩尔体积浓度均为0.01-lmol/L。
[0047]步骤三:按照谷氨酰胺转移酶与胶原蛋白的比例为15U/g的比例添加谷氨酰胺转移酶。
[0048]步骤四:按照胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的质量比为1:4比例添加纳米羟基磷灰石，得到粘稠状乳浊液。
[0049]步骤五:将步骤四的粘稠状乳浊液转移至模具中，于55°C下反应36h，放置冷却。[0050]步骤六:90°C下进行酶灭活5min，放置冷却。
[0051]步骤七:超低温冰箱-80°C下预冻3h，之后真空冷冻干燥48h。
[0052]参见图1的支架材料浸提液的体外细胞毒性分析，图中，MEM为细胞培养液，Scaffold为支架材料在培养液中的浸提液，纵轴为细胞成活率，横轴为时间。如图所示，细胞在纯细胞培养液中及在支架材料的培养液的浸提液中的增殖结果没有显著性差异，支架材料没有细胞毒性。
[0053]参见图2的支架材料浸提液对细胞形态的影响分析，图中，A为细胞培养液，B为材料在培养液中的浸提液。从图中可以观察到，细胞在纯培养液及支架材料培养液浸提液中中均成长梭形、三角形及多角形形态，支架材料的浸提液对细胞的形态没有显著性影响。
[0054]参见图3的小鼠成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)与支架材料共培养3d扫描电镜(SEM)分析。如图所示，细胞能很好的粘附在材料的孔壁上，分布均匀，维持球状的形态，材料具有较好的细胞相容性。
[0055]本发明采用的交联技术与传统交联技术不同，虽然交联技术是组织工程领域的一种常用技术手段，在骨组织工程的应用中，常用交联剂来改善人工骨的抗压能力及降解性能等，但是，现常用化学交联剂，如戊二醛、碳化二亚胺等，通常本身存在毒性问题，对于宿主存在安全隐患，本发明中以酶——谷氨酰胺转移酶(该酶常用于海绵的制备，业界认为该酶更适用于纯蛋白体系的交联反应)作为交联剂来改善所制备的胶原蛋白/纳米羟基磷灰石人工骨的水溶性及力学强度，反应之后，将酶进行灭活处理，全制备过程没有有毒有害或者存在潜在危害物质或试剂的引入，大大的提高了人工骨材料的生物相容性，另外，所涉及的反应物均无生物学毒性，降低了产物对人体可能存在的安全隐患，同时产品还保留了羟基磷灰石的骨传导性又不会影响胶原蛋白的促细胞生产性能。
[0056]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。