专利名称：一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用的制作方法胚胎的冷冻是胚胎的保存方法，将胚胎置于冷冻液中保护并采取特殊的降温程序，使胚胎在超低温(液氮_196°C，液氦_269°C )下停止代谢。需要使用胚胎时，再通过特定的解冻程序使其恢复生存能力，从而达到长期保存胚胎的目的。为了性别鉴定和其它基因检测与分析，常常需要利用显微操作技术将胚胎组织切割下一小部分用于分析，将剩余部分冷冻保存备用。 但胚胎被切割取样后会对胚胎造成损伤，如透明带破损、胚胎细胞数量减少、破坏细胞连接等，使胚胎对冷冻的耐受性降低。冻后的胚胎无论在形态正常率、冻后回收率，还是在胚胎发育率等方面都不够理想。冷冻液主要包括两种慢速程序化冷冻液和玻璃化冷冻液。常规冷冻就是慢速程序化冷冻，慢速程序化冷冻液的组成和配比不是固定不变的，目前最常用的是乙二醇+蔗糖或者再添加些其他成分的，一般在牛胚胎的冷冻上研究较多。由于胚胎的质量、种属、发育阶段和培养条件的不同，使得冷冻效果存在差异，冷冻液的组成也会随之变化，但用于保存取样胚胎的效果较好的冷冻液鲜有报道。1983年Lehn-Jensen发现透明带在冷冻解冻过程中起一种物理屏障作用,可抵抗病毒和微生物。目前，针对取样胚胎冷冻的报道较少，且有关的报道，冷冻效率都很一般。而常规的由乙二醇和蔗糖组成的乙二醇冷冻液，由于冷冻保护剂选择不当，大都存在冷冻取样胚胎效率低以及取样胚胎冻后的发育率和移植成功率较低的问题。因此，急需一种可保存取样胚胎的冷冻液。阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan, AG),分子量为530000,为高分子量非渗透性抗冻保护剂，在药物和食品工业中应用较多，经常被用作食品添加剂，并具有免疫等活性，所以对细胞毒性较小，但将其作为冷冻保护剂的报道几乎没有，且在常规冷冻保护液中添加高分子量非渗透性抗冻保护剂，此前从未有过报道。
为解决上述领域的需求和不足，本发明提供一种用于保存胚胎的冷冻液，其制备方法及应用。本发明冷冻液通过在常规胚胎冷冻液中添加特定浓度的高分子量非渗透性抗冻保护剂阿拉伯半乳聚糖，解决了常规乙二醇冷冻液用于冷冻取样胚胎发育率低的问题。一种用于保存胚胎的冷冻液，含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有阿拉伯半乳糖、含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS，其配比为阿拉伯半乳糖0.4 5g :乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g::含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 910 930ml。所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为 0. 0021g/ml ；配制时，将乙二醇、蔗糖和阿拉伯半乳糖溶解于含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中。当所述冷冻液各组分的配比为阿拉伯半乳糖0. 46 4. 6g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS920ml时，本发明冷冻液胚胎发育率高于对照组的胚胎发育率，根据本领域常识，本发明冷冻液总体效果优于对照组。当所述冷冻液各组分的配比为阿拉伯半乳糖2. 76 3. 68g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS920ml时，根据对比数据，本发明冷冻液总体效果较佳，这个区间内的冷冻液效果差异不显著，且冷冻效果比较稳定，没有忽高忽低的变化。将阿拉伯半乳聚糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果。 当所述冷冻液各组分的配比为阿拉伯半乳糖2. 76g:乙二醇80ml:蔗糖30 32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，冷冻效果达到最好。所述冷冻液各组分的用量为阿拉伯半乳糖0. 0276g，乙二醇0. 8ml，蔗糖0. 315008g，含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS9. 2ml，为最佳比值，在这个比值下，本发明冷冻液效果最好。上述冷冻液中，所述胚胎是经切割取样的取样胚胎。上述冷冻液的制备方法，包括如下步骤(I)将阿拉伯半乳聚糖加入容器中，再加入缓冲溶液PBS，4°C静置溶解；(2)再加入蔗糖，4°C静置溶解；(3)再加入牛血清白蛋白BSA，勿摇动，4°C静置溶解；(4)再加入缓冲溶液PBS，得到混合液；(5)取步骤(4)所得混合液与乙二醇相混合，密封，4°C冰箱静置；上述各成分的配比为阿拉伯半乳糖0. 4 5g :乙二醇75 85ml:鹿糖30 40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS910 930ml，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为 0. 0021g/ml。上述冷冻液在保存取样胚胎中的应用。技术效果本发明是在常规冷冻液中添加非渗透性的高分子抗冻保护剂阿拉伯半乳聚糖、BSA(牛血清白蛋白)等，这些物质不能透过细胞膜，在急速降温过程中其黏滞性增加，对损伤创面有胶性保护作用，而且细胞外液浓度高，有助于细胞内液脱出，防止细胞内部大冰晶的形成，所以对胚胎起到保护作用。阿拉伯半乳聚糖是一种重要的植物活性多糖，早期在食品和日用化工中作添加齐U，近年来发现其具有明显的免疫活性，成为一种新型的免疫促进剂。阿拉伯半乳聚糖对细胞毒性小，且其具有胶性的特质，当对胚胎进行冷冻时，细胞内部就不会形成大的冰晶从而减少对细胞造成伤害，甚至可能在达到适当的浓度时，能够在细胞外部形成特殊的保护膜，阻止细胞外冰晶对细胞造成损伤。在解冻期间，阿拉伯半乳聚糖是缓冲渗透压物质，通过降低解冻时细胞的膨胀速度来减少渗透性损伤的发生。乙二醇为低分子量渗透性冷冻保护剂，在几种常用的低分子量冷冻保护剂中，乙二醇毒性最低，渗透性最好，添加蔗糖能够降低溶液的毒性，而血清含有许多成分，包括能量基质、氨基酸、维生素、激素、生长因子和细胞因子，作为胚胎的营养和能量底物，是其它物质不能取代的最佳选择。但由于犊牛血清易造成动物病原菌污染，本发明使用牛血清白蛋白(BSA)替代犊牛血清，排除掉病原菌污染的问题，而且其中成分无很大变化。本发明冷冻液以常规冷冻液(乙二醇+蔗糖)为基础，添加特定浓度的作为高分子量非渗透性抗冻保护剂的阿拉伯半乳聚糖，本发明充分利用乙二醇，蔗糖，阿拉伯半乳聚糖和牛血清白蛋白之间的相互配合、相互支持、协同作用。本发明冷冻液用于取样胚胎的冷冻，取样胚胎冷冻后的发育率高。本领域常识，一种冷冻液的胚胎发育率高于对照组的胚胎发育率，那么这种冷冻液效果就优于对照组。透明带受损胚胎常规冷冻液添加阿拉伯半乳聚糖，对冷冻效果的影响结合表I和表2，可以看出当溶液中阿拉伯半乳聚糖的重量与总冷冻液的体积之比分别为0. 00276g/ml和0. 00368g/ml时，冷冻效果达到较好，并且这两种冷冻液的冷冻效 果之间差异不显著，且冷冻效果较稳定，没有忽高忽低的变化。将阿拉伯半乳聚糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果。在解冻期间，阿拉伯半乳聚糖作为高分子量冷冻保护剂具有阻止解冻时形成冰晶的作用，并与蔗糖协同作用缓冲细胞内外液较高的渗透压差，防止在细胞内部冷冻剂没有完全脱除时细胞过度膨胀。另外，所以将胚胎常规乙二醇冷冻液中添加适量的阿拉伯半乳聚糖，能够显著提高胚胎解冻后的培养发育率。透明带受损胚胎二次冷冻和鲜胚冷冻，冷冻效果比较长期的研究表明，胚胎在冷冻及解冻过程中，都会受到一系列的伤害，如低温会引起细胞膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢；冷冻保护剂中主要是渗透性冷冻保护剂会对胚胎产生化学毒害作用，温度越高、作用时间越长、浓度越大，则毒性就会越大，这种毒性会造成细胞变脆崩裂、透明带硬化、微管微丝的聚合和解聚、染色体和DNA损伤等，以及胚胎冷冻和解冻时的冰晶损伤等。经对比实验证实，本发明冷冻液具有如下优点I.取样胚胎解冻后培养发育率显著高于常规冷冻液；2.当阿拉伯半乳聚糖的重量与总冷冻液的体积之比在0. 00276 0. 00368g/ml之间时，冷冻效果较好，且冷冻效果较稳定，没有忽高忽低的变化，将阿拉伯半乳聚糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果；3.本发明冷冻液尤其对取样胚胎冷冻效果较好。图I胚胎冷冻装管示意图
白蛋白的量同上。实施例3. 0. OlEAS冷冻液的配制配制步骤同实施例1，加入0. Olg的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。实施例4. 0. 02EAS冷冻液的配制配制步骤同实施例1，加入0.02g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。实施例5. 0. 04EAS冷冻液的配制配制步骤同实施例1，加入0.04g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。实施例6. 0. 05EAS冷冻液的配制配制步骤同实施例1，加入0.05g的阿拉伯半乳聚糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清
白蛋白的量同上。实施例7.本发明冷冻液的使用方法本发明采用慢速程序化冷冻，使用方法如下①将冷冻仪组装接入电源，倒入液氮，选择冷冻仪的0程序进行冷冻，此程序为_6°C植冰，降温速度为0. 50C /min, _35°C投入液氮。②装管，本发明采用六段法装管，先装入两段冷冻液，然后第三段装入胚胎，后面三段再装入冷冻液，最后塞入贴有标签的细管塞。(如图I)③胚胎放入冷冻液平衡5min，装管后将细管放入已降温至_6°C的冷冻仪中并再次平衡5min后植冰(植冰点见图I )，植冰后按下RUN键(IOmin后仪器开始以0. 5°C /min的速度开始降温);5min后检查植冰；当冷冻仪温度降到_35°C时将细管投入液氮并装入CANE中放入液氣进彳丁保存。实施例8. EAS系列冷冻液(添加阿拉伯半乳聚糖冷冻液)和常规乙二醇冷冻液(EGFREEZE)进行透明带受损胚胎二次冷冻-解冻观察用实施例1-6所得冷冻液，对透明带受损胚胎进行二次冷冻、解冻、CO2培养箱培养试验，同时以常规乙二醇冷冻液(EG FREEZE)为对照组，比较本发明冷冻液和常规冷冻液(EG FREEZE)的冷冻效果。表I透明带受损胚胎二次冷冻-解冻培养结果
实施~冷冻液冷冻解冻胚胎回培养24h~培养24h~培养48h~培养48h 例胚胎存活收率!％ 发育数发存率％发育胚数发育率％ _数数_
I (T005EA~10 7 70. OOab~I14.29a I14.29a
S
20. OlEAS 10 9 90. OOab I11.11s I11. Ila
30.02EAS 10 770. OOab I14.29a 228.57a
40.03EAS 10 10 100. OOa 220. OOa 330. OOa
50.04EAS 10 7 70. OOab 342.86* 342.86°
60. 05EAS 15 S5 33b 337. 5Cf 450. OOa对照 EG 20 1*d 75.00* 2 13.33* 2 13.33°
J|_注同列肩标小写字母相同者差异不显著(P > 0. 05)，肩标小写字母不同者差异显著(P < 0. 05)。如表I所示，在胚胎回收率方面，只有0. OlEAS和0. 03EAS高于对照组(P > 0. 05)，其余四种冷冻液中，0. 05EAS的胚胎回收率最低；培养24h发育率和培养48h发育率，只有0. OlEAS低于对照组(P > 0. 05)，其余五种冷冻液均高于常规乙二醇冷冻液(EG FREEZE),但差异不显著(P > 0. 05)。因此，总的来说，本发明冷冻液的效果都优于常规冷冻液。结合EAS系列冷冻液的透明带受损胚胎二次冷冻解冻观察试验的结果，挑选出0. 03EAS和0. 04EAS两种冷冻液进行后续的鲜胚冷冻试验。实施例9.透明带受损鲜胚冷冻-解冻培养仍以常规乙二醇冷冻液(EG FREEZE)为对照，将0. 03EAS冷冻液和0. 04EAS冷冻液，对透明带受损鲜胚进行冷冻、解冻、CO2培养箱培养试验，比较本发明冷冻液和常规乙二醇冷冻液(EG FREEZE)的冷冻效果。表2
实施冷冻液~SI Si 培养24h培养24h培~养培~~例胚胎数存活数冋收率％ 发育K数发育率％ 48h发48h发
_胚数首率％
~0.03EAS 403792. 50" 2670. 27to 3081.08Aa


本发明公开了一种用于保存胚胎的冷冻液，特别是用于保存取样胚胎的冷冻液。本发明冷冻液含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有阿拉伯半乳糖、含牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的缓冲溶液PBS，其配比为阿拉伯半乳糖0.4～5g∶乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 910～930ml；所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml；配制时，将乙二醇、蔗糖和阿拉伯半乳糖溶解于含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中。本发明充分利用乙二醇，蔗糖，阿拉伯半乳聚糖和牛血清白蛋白之间的相互配合、相互支持、协同作用以及充分发挥各组分的特点，本发明冷冻液对取样胚胎解冻后的发育率高于常规乙二醇冷冻液。