专利名称：一种昆虫基因检测方法昆虫是动物界中无脊椎动物的节肢动物门昆虫纲的动物，是所有生物中种类及数量最多的一群，是世界上最繁盛的动物，至今已发现100多万种。昆虫之所以能够长久兴旺的存在于地球之上，与其基因突变个体的大量存在不无关系。基因突变个体的大量存在给昆虫生存提供机会，但也给农业生产带来麻烦。由于昆虫个体变异迅速，造成农业生产中常用的农药在使用过程中由于抗药性个体的迅速出现，而大大缩短了该种农药的使用寿命。 在抗虫植物的推广过程中也存在同样的问题。对昆虫基因突变个体实时监测，有利于延长农药和抗虫植物的使用年限。现在对昆虫基因突变个体的监测一般通过生物测定和分子检测技术，相对于分子检测，生物测定技术耗时耗力。现如今的分子检测一般通过PCR检测或芯片技术。使用PCR 技术首先要提取昆虫的基因组DNA，设计基因检测引物，使用昆虫的基因组DNA作为模板进行PCR反应，对PCR产物进行分析，根据扩增片段的大小或序列测定进行昆虫基因变异情况的判断。基因芯片是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA探针(片段) 有序地固定在载体表面，从而形成贮存有大量信息的DNA芯片。与待测样品DNA作用后，即可在短时间内快速准确地获取样品中的基因突变信息。基因芯片需要专用的仪器设备，价格昂贵，且对技术要求较高。这些技术都需要提取DNA，由于昆虫卵相对较小，DNA含量低， DNA提取十分困难，所以DNA提取过程中一般使用昆虫的幼虫或成虫。而提取DNA的时候要杀死昆虫，造成该品系昆虫无法继续繁殖后代，影响对该品系昆虫的其他方面研究。因此，有必要提供一种成本低、灵敏度高的用于大规模昆虫基因检测的方法。
本发明提供了一种昆虫基因检测方法，其使用昆虫卵作为检测对象，以杂交膜为载体，利用Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA。本发明所述的昆虫基因检测方法包括以下步骤(1)将单个或多个昆虫卵分别破碎于杂交膜上；(2)使用裂解液处理步骤(1)获得的杂交膜上的破碎的昆虫卵；(3)将步骤⑵获得的杂交膜在2 X SSC溶液中清洗；(4)将步骤(3)获得的杂交膜烘干以固定DNA ；(5)将步骤(4)获得的杂交膜置于杂交袋中，作标记，将预热的杂交液加入杂交袋中，将杂交袋内的空气排空并将杂交袋密封，然后将密封的杂交袋放入杂交炉中预杂交 0. 5-4小时；(6)对步骤( 获得的杂交膜根据目标探针标记类型进行Southern杂交检测。3上述昆虫基因检测方法中，步骤(1)所述杂交膜可为尼龙膜，所述多个昆虫卵可通过施加机械压力的方式被破碎于所述杂交膜上。步骤(2)所述的裂解液包括氯化钠100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、EDTA 50mmol/L、SDS 0.5% (w/v)、蛋白酶K 2-%ig/ml，所述裂解液的pH值为7. 4。步骤O)的处理温度可为65°C，处理时间可为0. 5-2小时(优选1小时)。步骤(3)所述2XSSC溶液包括氯化钠0. 3mol/L、柠檬酸钠0.03mol/L，所述 2XSSC溶液的pH值为7.0。步骤(3)的清洗次数可为2次，每次10分钟，并于清洗时不断摇动杂交膜。步骤的烘干方式可包括以下方式的任意一种于烘箱中在120°C下烘30分钟，在80°C下于真空中烘2小时，经254nm紫外光照射2分钟。步骤(5)所述的杂交液包括6XSSC，5XDenhardt，0. 5% (w/v) SDS 和 100 μ g/ml 的鲑鱼精DNA，所述杂交液加入杂交袋的比例可为8-12mL/100cm2 (优选lOmL/lOOcm2)，所述预热温度可为42°C，所述密封的杂交袋在杂交炉内的预杂交温度可为42°C。步骤(6)所述目标探针用带有标记物的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸标记，步骤(6)包括用酶化学法检测所述Southern杂交的结果。本发明所述的昆虫基因检测方法成本低、灵敏度高，可用于大规模的昆虫DNA检测。由于昆虫产卵量十分高，且根据孟德尔遗传规律推断，每只雌虫的卵中都可能有数粒遗传基因相同的卵存在，因此，直接使用昆虫卵作为检测对象，就可以保证与检测卵具有相同遗传背景的昆虫继续存活，从而可以继续繁殖，继续对其研究。之所以能够使用昆虫卵作为研究对象，是因为本发明不需要直接提取昆虫卵的DNA，而是通过特殊的裂解液直接将昆虫卵DNA裂解到杂交膜上，这种特殊裂解液是针对昆虫卵的特殊性，根据已有的细胞裂解液改进而来，因为尼龙膜带有正电荷，释放的DNA将被杂交膜直接吸附。而且本发明所使用技术是比较成熟的Southern杂交技术，成本低，对技术条件无特殊要求。使用本方法无需直接提取昆虫卵的DNA，而是将单粒卵或多粒卵的DNA直接固定于杂交膜上，结合Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA，从而判断该品系昆虫中的基因变异情况。本发明仅使用昆虫卵作为检测对象，可以方便的进行大规模昆虫DNA检测。本发明使用Southern杂交技术，检测灵敏度高，克服了昆虫卵小、DNA难以提取的难题，且每条探针可以重复使用，大大减少了检测成本。本发明仅用数粒昆虫卵即可推断出该品系昆虫基因变异情况，不影响该品系的正常饲养繁殖。总之，本发明所述的昆虫基因检测方法具有如下优点1.操作简单，结果稳定。本发明使用的Southern杂交技术是传统的分子生物学技术，技术成熟，检测灵敏度高。2.应用广泛，方便大规模检测。本发明几乎可以检测所有昆虫的卵，每张杂交膜可同时检测数百粒卵。3.成本低。本发明中所用的检测探针可以重复利用，大大减小了检测成本。

图1所示为杂交膜(尼龙膜)上卵破碎位置的颜色反应结果。

将杂交后的杂交膜在室温下用IOmL含有0. 1% SDS的2 X SSC (氯化钠0. 3mol/L， 柠檬酸钠0. 03mol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次5分钟；再将杂交膜在68°C的温度下用IOmL含有0. 1 % SDS的0. 1 X SSC (氯化钠15mmol/ L，柠檬酸钠1. 5mmol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次15分钟，不断摇动；再用IOOmL漂洗液(马来酸缓冲液，含有0. 3% Tween-20,短暂洗涤5分钟，然后将尼龙膜放入IOOmL的的Blocking solution (Roche公司产品，目录号11745832910) (封闭液和马来酸溶液以1 10混合)溶液中，并于室温下放置30分钟；然后将杂交膜放入到20mL抗体复合物溶液(Roche公司产品，目录号 11745832910)(每次使用前将Anti-Dig-Ap以IOOOOrpm离心5分钟，取上清液用封闭液进行1 5000倍稀释)中，并于室温下放置30分钟；将尼龙膜放入IOOmL 洗液(0. IM 顺丁烯二酸，0. 15M NaCl ；pH7. 5 ；0. 3 % (ν/ν) Tween-20)中洗涤2次，每次15分钟；再将尼龙膜夹入20mL检测液(0. IM Tris-HCl,0. IM NaCl，pH9. 5)中进行平衡2-5 分钟；弃检测液，在黑暗条件下，加入IOmL新配的酶化学显色液(Roche公司产品，目录号1174583^10)显色6小时以上，不要摇动；用50mL双蒸水(ddH20)洗膜5分钟终止显色反应，根据尼龙膜上卵破碎位置的颜色反应判断结果，有颜色变化且颜色变深证明含有缺失区DNA，为敏感品系棉铃虫；未发生颜色变化证明不含有缺失区DNA，为Bt抗性棉铃虫。上述颜色变化仅在显色反应后才出现， 在显色反应之前的所有步骤，尼龙膜上的卵破碎位置不发生颜色变化。结果参见图1，显示 4粒孵化后5天的卵和5粒新产的卵都能观察到颜色变化，与预期结果一致，证明本发明的方法具有较高的灵敏度。实施例2采用于2010年7月份从河南安阳中国农业科学院棉花研究所东试验场棉田采集的32粒棉铃虫卵进行基因检测，具体方法如下(1)破碎使用圆头组织研磨杵施加机械压力使单个昆虫卵破碎于尼龙膜上，按同样方法使多个昆虫卵分别破碎于尼龙膜上。并使用敏感品系棉铃虫DNA(从敏感品系棉铃虫个体提取出的DNA)作为阳性对照。(2)裂解使用裂解液于65°C的温度下处理尼龙膜上的破碎的昆虫卵1小时，所述裂解液包括氯化钠 100mmol/L、Tris-HCl 1 Ommo 1/L、EDTA50mmol/L、SDS 0.5%、蛋白酶 K ang/ml，所述裂解液的pH值为7. 4。(3)洗膜将处理后的尼龙膜放入2XSSC溶液(氯化钠0. 3mol/L，柠檬酸钠 0. 03mol/L, ρΗ7· 0)中清洗2次，每次lOmin，不断摇动。(4)固定将清洗后的尼龙膜置于烘箱中在120°C的温度下烘30分钟来固定DNA。(5)预杂交将处理好的待杂交的尼龙膜小心置于杂交袋中，作好标记，将预热至 42°C 的杂交液(6X SSC, 5XDenhardt, 0. 5% (w/v) SDS 禾口 100 μ g/ml 的鲑鱼精 DNA)，按照 lOmL/lOOcm2的比例加入杂交袋中，将杂交袋内的空气排空，并用封口机将杂交袋密封，然后将密封的杂交袋放入杂交炉中于42°C的温度下预杂交3小时。(6)检测将预杂交后的杂交膜根据目标探针标记类型进行Southern杂交检测。
IHig Yang et al. (2007) (Applied and Environmental Microbiology, 2007ipH 21期)的报道，钙粘蛋白基因由于部分片段缺失而造成棉铃虫对Bt杀虫蛋白产生抗性，而敏感品系中含有该基因片段。根据棉铃虫是否含有这段序列，可以判断该棉铃虫是敏感品系还是Bt抗性品系。针对钙粘蛋白缺失片段，设计PCR引物在敏感品系的DNA中扩增出缺失区DNA序列，纯化后使用罗氏地高辛标记试剂盒(Roche，产品目录号1174583四10)中提供的带有地高辛标记物的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸对DNA序列进行标记。将地高辛标记的探针煮沸5分钟变性，迅速置于冰浴，从杂交炉中取出杂交袋，从一角剪开小口，加入5 μ L相应的探针，重新封口，再放入杂交炉中，于42°C的温度下杂交过夜。将杂交后的杂交膜在室温下用IOmL含有0. 1% SDS的2 X SSC (氯化钠0. 3mol/L， 柠檬酸钠0. 03mol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次5分钟；再将杂交膜在68°C的温度下用IOmL含有0. 1 % SDS的0. 1 X SSC (氯化钠15mmol/ L，柠檬酸钠1. 5mmol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次15分钟，不断摇动；再用IOOmL漂洗液(马来酸缓冲液，含有0. 3% Tween-20)短暂洗涤5分钟，然后将尼龙膜放入IOOmL的的Blocking solution (Roche公司产品，目录号11745832910) (封闭液和马来酸溶液以1 10混合)溶液中，并于室温下放置30分钟；然后将杂交膜放入到20mL抗体复合物溶液(Roche公司产品，目录号 11745832910)(每次使用前将Anti-Dig-Ap以IOOOOrpm离心5分钟，取上清液用封闭液进行1 5000倍稀释)中，并于室温下放置30分钟；将尼龙膜放入IOOmL 洗液(0. IM 顺丁烯二酸，0. 15M NaCl ；pH7. 5 ；0. 3 % (ν/ν) Tween-20)中洗涤2次，每次15分钟；再将尼龙膜夹入20mL检测液(0. IM Tris-HCl,0. IM NaCl，pH9. 5)中进行平衡2-5 分钟；弃检测液，在黑暗条件下，加入IOmL新配的酶化学显色液(Roche公司产品，目录号1174583^10)显色6小时以上，不要摇动；用50mL双蒸水(ddH20)洗膜5分钟终止显色反应，根据尼龙膜上卵破碎位置的颜色反应判断结果，有颜色变化且颜色变深证明含有缺失区DNA，为敏感品系棉铃虫；未发生颜色变化证明不含有缺失区DNA，为Bt抗性棉铃虫。结果参见图1，显示32粒卵都能观察到颜色变化，说明32粒卵都含有缺失区DNA，证明田间采集的32粒卵都为Bt敏感品系，没有对Bt抗性的个体。综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围， 因此，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


本发明涉及一种昆虫基因检测方法，其使用昆虫卵作为检测对象，以杂交膜为载体，结合Southern杂交技术，使用标记的目标探针检测昆虫卵中的DNA。所述方法成本低、灵敏度高，可以方便的进行大规模昆虫DNA检测。