专利名称：利用昆虫保幼激素类似物提高昆虫杆状病毒产量的方法 昆虫杆状病毒是昆虫的重要病原体，目前已至少从600多种昆虫(主要是鳞翅目昆虫)中发现杆状病毒的感染，并常在野外引起昆虫流行病，是调节昆虫种群密度的重要病原因子。昆虫杆状病毒对宿主具有高度专一性，一般一种病毒只能感染一或数种亲缘关系较近的宿主，对人、畜禽、鱼虾及天敌等安全无害，不污染环境。早在七十年代初，昆虫杆状病毒便被研制成一种安全的生物杀虫剂而在害虫防治中应用，并被联合国粮农组织和世界卫生组织推荐在农作物上使用，是一类极具发展前途的生物杀虫剂。据资料报道，自1973年美国的美洲棉铃虫(Heliothis zea)核多角体病毒杀虫剂问世以来，目前至少有十个商品病毒杀虫剂已登记注册(主要为昆虫杆状病毒)；我国也有两个昆虫杆状病毒杀虫剂已登记注册，近20种昆虫杆状病毒进入大田试验和生产示范。因此，利用昆虫杆状病毒防治农、林和其它经济作物害虫，已成当前国内外重要的生物防治手段之一。昆虫杆状病毒是专性寄生物，只能在活寄主细胞内增殖，因此，要培养大量病毒，首先必须得到大量活细胞。由于利用昆虫细胞系增殖昆虫杆状病毒作农用杀虫剂的生产成本极高，用户难以接受，因此目前主要是采用整体活寄主昆虫增殖的方法。此方法尽管较之用细胞培养的方法成本低得多，但与其它生物杀虫剂及化学杀虫剂相比，生产成本仍偏高。而导致昆虫杆状病毒生产成本偏高的重要原因是单位产量低，耗工大。这在利用小个体昆虫(如甜菜夜蛾、小菜蛾)增殖病毒时更突出。另外，随着为改变昆虫杆状病毒杀虫速度慢，寄主范围窄的缺点而通过基因工程手段将昆虫特异性酶、激素或毒素插入杆状病毒基因组中表达，或通过缺失病毒某种蛋白编码基因，从而导致害虫摄食量下降、蜕皮异常或中毒麻痹而加速害虫死亡等方面的深入研究，如何高效增殖这些重组病毒，充分发挥它们在害虫防治中的作用，也是当前面临而又必须解决的重要课题。总之，如何高效增殖昆虫杆状病毒，显著提高单位产量，降低生产成本，是当前困绕昆虫杆状病毒尤其是一些重组昆虫病毒工厂化生产的重要难题。为解决昆虫杆状病毒生产时单位产量低，耗工大的问题，就增殖环节而言，主要应提高病毒的感染率和单头寄主含量，两方面相辅相承，不可偏颇。因此，到目前止，某种昆虫的最适感染龄期和接种浓度均是以上面两指标及幼虫生长历期为依据而确定。据资料分析，寄主幼虫的最适感染龄期往往是在倒数第二龄。可是，由于幼虫的绝对生物量一般都是末龄增加最快，所以，当寄主幼虫于倒数第二龄感染，感染幼虫虽可蜕皮进入末龄并继续发育，但随感染时间的推移，幼虫取食量将逐渐减少，一般至末龄中后期停止取食，这就使感染幼虫无法在末龄中后期进一步摄取大量营养物供病毒增殖之用，从而大大降低单头幼虫病毒含量。此外，在工厂化大量增殖病毒时，要准确控制病毒接种量相对较难，往往不是造成接种量偏低，感染率下降，就因接种量过高，造成幼虫过早死亡而降低病毒产量，因此为避免以上问题和降低工厂化增殖病毒的技术难度，如能在幼虫末龄初期感染则最理想。但采取末龄感染，由于许多昆虫幼虫很快便转入预蛹期或化蛹，因此在感染幼虫细胞中虽然增殖了部分病毒，但却经常未待病毒充分增殖并形成大量包涵体即转入预蛹期或化蛹，因而显著降低病毒增殖量。保幼激素类似物(Juvenile hormone analogue，JHA)是一类人工合成并具有保幼激素活性的化合物，其主要功能是抑制昆虫发育和变态。用JHA处理昆虫幼虫，可阻止幼虫发生变态，延长幼虫期甚至产生超龄幼虫。早在七十年代，我国就已利用JHA处理家蚕以增加产丝量。此后有关这方面的报道更多，例如崔为正等用蜕皮激素处理五龄前家蚕，然后在五龄中期使用JHA，结果增加茧层量12.4～21.7％。Kadono等将4龄起蚕饥饿24小时，再用JHA处理，100％诱导出超龄幼虫，处理家蚕吐丝结茧后，虽茧层量未提高，但全茧量比对照提高30～40％；此后，他们进一步在4龄用高剂量JHA处理，诱导出的超龄永久幼虫，于6龄后期注射蜕皮激素，家蚕吐丝所结茧为巨型茧。赤井坎等在家蚕3～5龄幼虫期多次用JHA处理，可增加蚕层量20～25％。此外，利用JHA处理天蚕也有明显增丝效果。经对JHA增丝机理研究证明，JHA的增丝效果不仅是由于延长了幼虫期(即延长丝蛋白合成时间)，而且也由于直接促进了丝蛋白的合成作用。鉴于家蚕和天蚕利用JHA处理后可延长幼虫期，促进脂肪体蛋白合成及丝腺DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译，使丝蛋白合成量增加，而JHA对昆虫杆状病毒增殖有何影响，有关此方面研究目前尚无报道。
本发明的目的是提供一种利用昆虫保幼激素类似物提高昆虫杆状病毒产量的方法。该方法通过利用昆虫保幼激素类似物延长幼虫期，以提高幼虫病毒感染死亡率，同时促进昆虫杆状病毒的增殖，实现低成本、高效增殖昆虫杆状病毒以用作杀虫剂，服务于农业生产。本发明的方法是用对病毒寄主昆虫有效的昆虫保幼激素类似物在昆虫幼虫末龄初处理幼虫，同时进行病毒感染，然后继续人工饲养幼虫至其病毒感染死亡。
本发明方法所用的昆虫保幼激素类似物可以是其H类型化合物，如ZR-515(Methoprene)、ZR-512(Hydroprene)或ZR-619(Triprene)等；昆虫保幼激素类似物的用量一般为每头幼虫5～15μg；病毒感染浓度一般为5×106～1×108PIB/ml，每头幼虫喂食病毒感染液5～15μl。
本发明方法所用的昆虫幼虫优选甜菜夜蛾幼虫，昆虫杆状病毒优选甜菜夜蛾核多角体病毒，具体方法步骤是用人工饲料饲养甜菜夜蛾幼虫至5龄蜕皮0～1天，然后用丙酮稀释的保幼激素类似物ZR-515(Methoprene)，按常规方法以5～15μg/头量处理甜菜夜蛾幼虫，并让每头幼虫取食5×106～1×108PIB/ml甜菜夜蛾核多角体病毒感染液5～15μl，继续用人工饲料饲养甜菜夜蛾幼虫至病毒感染死亡。
经试验证实，按照本发明方法，用保幼激素类似物ZR-515(Methoprene)处理甜菜夜蛾幼虫后，可提高甜菜夜蛾核多角体病毒感染死亡率23.0～43.4％，提高单头病毒含量44.3～109.8％，提高病毒总产量1.4～2.2倍。表明本发明方法能有效提高病毒的感染死亡率和显著促进昆虫杆状病毒在虫体内的增殖，提高病毒产量，是实现低成本、高效增殖昆虫杆状病毒以用作杀虫剂的新途径。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1 保幼激素类似物处理甜菜夜蛾幼虫的效果表1 保幼激素类似物处理甜菜夜蛾幼虫的效果JHA处理剂量 幼虫成活率 延长幼虫期的时间虫龄 虫数(头)(μg/头)(％) (天)4龄初302 90.404龄初305 78.304龄初3010 56.704龄中302 94.204龄中305 84.904龄中3010 62.304龄末302 98.104龄末305 92.01.54龄末3010 86.525龄初302 100 05龄初305 100 1.75龄初3010 100 3在不同幼虫龄期分别用不同剂量保幼激素类似物处理甜菜夜蛾幼虫的效果如表1所示，所用的保幼激素类似物为ZR-515(Methoprene)。由表1可知，在幼虫4龄初、中或末用保幼激素类似物处理，均出现不同程度的死亡，导致此结果的原因主要是①部分幼虫因丙酮中毒死亡；②多数幼虫由于保幼激素类似物处理时，其溶剂丙酮对幼虫表皮造成伤害，进入5龄蜕皮时，一些幼虫因无法蜕皮而死亡，其中高剂量处理组更为明显，而5龄初处理则无此现象。另外，从延长幼虫期效果看，在4龄初和4龄中处理，不能延长幼虫期；4龄末和5龄初则需保幼激素类似物的处理剂量大于5μg/头才有效果，其中以10μg/头的剂量处理甜菜夜蛾5龄初幼虫效果最佳。实施例2 保幼激素类似物处理甜菜夜蛾幼虫并在末龄感染的最佳病毒感染浓度经保幼激素类似物(ZR-515)处理及未经处理的甜菜夜蛾幼虫，在不同病毒感染浓度下的病毒感染死亡率如表2所示。
表2 保幼激素类似物处理甜菜夜蛾幼虫并在末龄感染的最佳病毒感染浓度JHA处理剂量 病毒感染死亡率虫龄虫数(头) 病毒感染浓度(PIB/ml)(μg/头) (％)5龄初30 0 6×10632.75龄初30 10 6×10666.35龄初30 0 6×10752.35龄初30 10 6×10791.2由表2可知，经保幼激素类似物处理后的甜菜夜蛾幼虫，其病毒感染死亡率显著高于未处理组甜菜夜蛾幼虫。经比较，以6×107PIB/ml浓度感染5龄初处理保幼激素类似物的甜菜夜蛾幼虫，其不仅感染效果好，而且增殖的病毒数量最高。实施例3.保幼激素类似物对甜菜夜蛾核多角体病毒增殖的影响按本发明方法，经保幼激素类似物(ZR-515)处理的甜菜夜蛾幼虫，其病毒感染死亡率、平均单头病毒含量和病毒总产量如表3所示。
表3 保幼激素类似物对甜菜夜蛾核多角体病毒增殖的影响JHA处病毒感染 病毒感染 平均单头病毒虫数病毒总产量品系 虫龄 理剂量 浓度死亡率 含量(头)(×109PIB)(μg/头) (PIB/ml) (％)(×108PIB/头)广州品系 5龄初30106×10776.725.6 58.8广州品系 5龄初300 6×10733.312.2 18.2日本品系 5龄初30106×10786.724.2 65.9日本品系 5龄初300 6×10760.016.77 29.5荷兰品系 5龄初30106×10786.327.18 68.7荷兰品系 5龄初300 6×10763.315.3 25.1由表3可知，无论是甜菜夜蛾广州品系，还是甜菜夜蛾日本品系或荷兰品系，经保幼激素类似物处理的幼虫，其病毒感染死亡率、平均单头病毒含量和总产量均显著高于未处理组甜菜夜蛾。其中病毒感染死亡率广州品系保幼激素类似物处理组比未处理组提高43.4％、日本品系提高26.7％、荷兰品系提高23.0％；平均单头病毒含量广州品系处理组比未处理组提高提高109.8％、、日本品系提高44.3％、荷兰品系提高77.6％；病毒总产量广州品系处理组比未处理组高2.2倍、日本品系高1.4倍、荷兰品系高1.7倍。由此说明，保幼激素类似物可显著提高甜菜夜蛾的病毒感染和促进病毒在体内的增殖，从而提高病毒总产量。


本发明涉及昆虫保幼激素类似物在昆虫杆状病毒增殖中的应用，具体涉及一种利用昆虫保幼激素类似物提高昆虫杆状病毒产量的方法。本发明方法是用对病毒寄主昆虫有效的昆虫保幼激素类似物在昆虫幼虫末龄初处理幼虫，同时进行病毒感染，继续人工饲养幼虫至其病毒感染死亡。按照本方法，用保幼激素类似物ZR－515(Methoprene)处理甜菜夜蛾幼虫后，可提高甜菜夜蛾核多角体病毒感染死亡率23.0～43.4％，提高单头病毒含量44.3～109.8％，提高病毒总产量1.4～2.2倍。表明本发明方法能有效提高病毒的感染死亡率和显著促进昆虫杆状病毒在虫体内的增殖，提高病毒产量，是实现低成本、高效增殖昆虫杆状病毒以用作杀虫剂的新途径。