专利名称：肽和多肽药物的稳定类似物的制作方法肽和多肽药物的稳定类似物本申请是以下申请的分案申请申请日2004年5月17日；申请号 200480019850. 0 (PCT/US2004/015488)；发明名称同上。多肽和肽药物被广泛应用于医疗实践中，它们易于制备(或用重组DNA技术或肽合成的方法)，保证了它们在未来的数年内仍然能够在各种情况下使用。多肽药物，如激素、 细胞因子和生长因子是治疗性药物的重要组成部分。然而，某些天然多肽在体内会因蛋白水解和异构化作用迅速失活。当人们期待药物一段时间内在血中保持在一个恒定并持久的水平时，这种失活将带来很大不便，因为必须反复给药。在某些情况下，多肽的一个或多个水解产物还可能成为完整多肽活性的拮抗剂，在这种情况下，单纯补充给药是不足以克服水解产物的拮抗作用的。进一步说，有一类肽类激素在血中存在较长时间是很有益处的，这类激素包括胰高血糖素样肽1和肽2(GLP-1和GLP-2)、葡萄糖依赖的促胰岛肽(GIP)、神经肽Y(NPY)、 胰多肽(PP)和肽YY(PYY)。GLP-I是在葡萄糖代谢和胃肠道分泌和代谢中发挥调节功能的重要多肽激素，目前的研究表明GLP-I是胰腺β细胞生长因子，或许还与其他器官中的细胞分化有关。GLP-2是一个由33个氨基酸组成的肽，对胃肠道疾病有治疗作用， 特别是已知GLP-2是一种营养因子，有加强和维持胃肠道正常功能的作用，同时还能促进肠道组织的生长(见，例，美国专利序号5，834，428 ；5, 789，379 ；和5，990，077 ；和国际公开号W098/5^00)。GIP是由小肠内分泌细胞合成并分泌的含42个氨基酸的肽(见 R. A. Pederson,等，Endocrinology 99, 780-785 (1976) and T.B.Usdin,等，Endocrinology 133，2861-2870 (1993))，灌注试验显示，GIP可抑制胰高血糖素对肝的作用而加强胰岛素的作用。另外，GIP对肝脏血流有双重作用，即增强门静脉血流，抑制肝动脉血流。神经肽Y是胰多肽家族中的一员，含36个氨基酸，在哺乳动物的中枢和周围神经系统中呈高浓度存在，是已知的最强有力的增加食量的物质，可能还与II型糖尿病有关(见美国专利 6410701、6075009、5026685、5328899 和 K. Tatemoto，Proc. Natl. Acad. ki. USA 79， M85-5489(1982))。肽YY (PYY)和胰多肽(PP)是结构上相关的肽类激素，与记忆力丧失、 抑郁、焦虑、癫痫、疼痛、高血压及睡眠和饮食障碍有关。此类多肽激素和其他多肽类因子相信是由丝氨酸蛋白酶的脯氨酸后 (post-proline)切割组成员降解的，如二肽基肽酶IV (DPP IV)。DPPIV是膜相关丝氨酸肽酶，切割肽链上N端二肽，肽链次末(Pl)位最好是脯氨酸残基，或如果N端(P》是组氨酸或一个大芳香族氨基酸如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸时，次末(Pl)位最好为丙氨酸残基。 GLP-UGIP 和 GLP-2 的氨基端序列分别为 His-Ala-Glu、Tyr-Ala_Glu 和 His-Ala-Asp。NPY、 PP和PYY的氨基端序列分别为Tyr-Pro-Ser、Ala-Pro-Leu和Tyr-Pro-Ile。由此，提示了 DPP IV在体内对这类多肽类激素和其他多肽的调节作用。DPP IV介导从上述有生物活性的肽激素的N端切除Xaa-Ala或Xaa-Pro 二肽(这里Xaa为一个氨基酸残基)导致激素失活或变为拮抗剂。丝氨酸蛋白酶导致的肽类激素被切割和失活是蛋白水解过程极大限制治疗性多肽使用的一个例子。找到能够在蛋白水解，如DPP IV介导的失活作用下仍保持稳定的肽类药物的类似物将有很大意义，也即是说，本领域有着对蛋白水解抗性肽类激素的需求。发明概述本发明总的来说提供了抗蛋白酶切割(如抗蛋白水解)的肽或多肽类似物(P’ ！ 类似物)的组合物。本发明的一个方面关系到一个发现，即对脯氨酸后切割蛋白酶底物的P’工位置 (酰胺切割位点的羧基端一侧的残基)进行修饰后，产生的底物类似物与天然底物相比，对酶介导的切割的敏感性有很大程度的降低，但却保留了天然底物的生物学活性。例如，用一个氨基酸类似物修饰脯氨酸后切割丝氨酸蛋白酶DDP IV底物的P’工位残基(具DPP IV 切割位点)，得到一个对DDP IV的切割不敏感，但又保留了天然底物的生物学活性的底物类似物。本发明的另一个方面关系到一个更普遍的观察，即用一个具有四取代的Ci3碳的氨基酸类似物修饰蛋白酶底物的P’ ！位残基(具切割位点)，得到的底物类似物在体内的半衰期明显延长，相对天然底物来说，其生物有效期可能延长和/或清除可能减缓。基于此发现及它对多种蛋白酶切割底物的适用性，本发明提供了一个制备这些蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶底物的P’ ！类似物的方法。本发明还提供了含有一个或多个的题述P’ ！类似物的药用组合物，示例性药用组合物含一个或多个用药学上可接受的载体或赋形剂配制的P’ ！类似物。本发明的另一个方面是治疗受试者疾病的方法，包括给予治疗有效剂量的一个或多个的P’ ！类似物，该题述P’ ！类似物可以单独给药，也可作为包括适于治疗特殊疾病适应症的其他疗法的治疗方案的一部分来用药。例如，P’工类似物可单独用于治疗糖尿病，也可在使用时结合饮食控制和运动，和/或联合使用胰岛素。更进一步，示例性的联合治疗方法包括给予？类似物的同时，也给予切割其天然多肽的特定酶的抑制剂，这样的抑制剂可能是某种特殊的酶特异性的(如DDPIV特异性抑制剂)或更宽泛地针对一类酶(如，丝氨酸酶抑制剂)。本发明的另一个方面是关于题述P’ ！类似物在诊断方面的用途。本发明的另一个方面是关于题述？类似物在生产提供蛋白酶抗性肽的药物方面的用途。本发明的另一个方面是P’ ！类似物在生产治疗性药物方面的用途。本发明还有的一个方面是关于实施商业计划的方法，包括类似物及其药用组合物、和/或含有P’ ！类似物的试剂盒的鉴别、生产、推销、发放和给予准许。在上述诸方面中，本发明料想到类似物作为多肽类激素类似物，如胰高血糖素样肽、NPY、PPY、肠泌素、GLP-1、GLP-2和GIP的类似物的组合物和方法，本发明认识到可以在任何可被蛋白酶切割的多肽或肽类激素的切割位点上进行修饰而生成一个具有蛋白酶抗性的P’工类似物。更进一步，本发明认识到根据我们对酶的切割位点的认识和本申请中提供的方法，能够很容易地设计出具有多种多样蛋白酶抗性的P’工类似物。这类蛋白酶的例子包括金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。附图简述图1为天然GLP-I被DPP IV降解的图解。GLP-1被DDP IV迅速降解-静脉给药后两分钟；-皮下给药后30分钟。 图2为两个不同的GLP-I (7-37)类似物抵抗DDP IV切割的HPLC/MS结果概述。 图3为3- 二甲基-天冬氨酸GLP-I的初步鉴定实验，显示出3_ 二甲基-天冬氨酸取代的GLP-I类似物保持天然GLP-I的功能活性。左边的图形显示GLP-I和GLP-I (3-DMA) 以相似但不相同的亲和力与其受体结合。右边的图形显示GLP-I和GLP-I (3-DMA)具有基本相同的信号转导能力，这一点是暴露于GLP-I和GLP-I类似物后，通过测定cAMP的产生得出的。图4为3- 丁基-甲基甘氨酸GLP-I的初步鉴定实验，显示3_ 丁基-甲基-甘氨酸取代的GLP-I (GLP-1 (BM))类似物保持天然GLP-I的功能活性。图形显示GLP-I和 GLP-I (BM)具有基本相同的信号转导能力，这一点是暴露于GLP-I和GLP-I类似物后，通过测定cAMP的产生得出的。图5显示GLP-I (7-37)酰胺用人DDP IV处理2小时后(下)与未处理过的肽(上)的HPLC/MS结果比较。注意GLP-I (7-37)被DDP IV处理后出现时间依赖的肽损失。图6显示含有叔-亮氨酸(TLE)残基替代P’工谷氨酸的GLP-I类似物用人DDP IV处理2小时后(下)与未被DDP IV处理过的肽(上)的HPLC/MS结果比较。注意该 TLE-GLP-I类似物对DPP IV的降解有图7显示叔-亮氨酸(TLE)在一个丝氨酸蛋白酶凝血酶的模型底物的P^位置上的取代导致了一个具有凝血酶抗性的肽类似物的生成。图8显示使用三个不同剂量GO μ g、4 μ g、0. 4 μ g)的毒蜥外泌肽_4的糖尿病小鼠与生理盐水对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图9显示使用40 μ g剂量的GLP-I (TPA1B4)类似物的糖尿病小鼠与生理盐水对照或GLP-I对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图10显示使用三个不同剂量(800 μ g、80 μ g、8 μ g)的GLP-1 (TPA1B4)类似物的糖尿病小鼠与生理盐水对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图11显示使用20mg/kg剂量的GLP_1 (TPA1B4)类似物的糖尿病小鼠与生理盐水对照或GLP-I对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图12显示使用20mg/kg剂量的GLP_1 (TPA1B4)类似物的糖尿病小鼠与生理盐水对照或GLP-I对照的糖尿病小鼠体内不同时间的血糖水平。图13显示使用三个不同剂量(8 μ g、0. 8 μ g、0. 08 μ g)的毒蜥外泌肽_4的糖尿病小鼠与生理盐水对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图14显示使用800 μ g剂量的GLP-I的糖尿病小鼠与生理盐水对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图15显示使用8 μ g和0. 8 μ g两个剂量的GLP-1类似物(P1732)的糖尿病小鼠与生理盐水对照的糖尿病小鼠体内不同时间血糖变化的百分比。图16显示式(II)的示例性实施方案，其中天然存在的氨基酸在位(3-位) 用R1和R2修饰。发明详述I.概况本发明总的来说涉及肽和因对蛋白水解酶的切割敏感性降低而体内半衰期延长，且保留了天然底物的活性的P’ ！类似物。本发明中的P’ ！类似物包括其活性和/或体内半衰期通常由蛋白水解调节的生长因子、细胞因子、肽类激素和其他多肽和肽的类似物。本发明的一个方面涉及发现对脯氨酸后切割蛋白酶底物的位(酰胺切割位点羧基端的一侧的氨基酸残基)进行修饰能产生较之天然底物对酶切割的敏感性大大降低了的底物类似物，而且天然底物的生物活性仍然存在。例如，用一个氨基酸类似物对脯氨酸后切割丝氨酸蛋白酶DPP IV底物的P’ ！位(DPP Ive切割位点)进行修饰，生成一个极大降低了对DDP IV切割敏感性的底物类似物，而且天然底物活性还被保留了下来。用另一个天然氨基酸替代P’工位氨基酸残基是一种选择，在优选实施方案中，取代 P’ ！位氨基酸残基是一个非天然的氨基酸类似物，甚至更优选的，是用一个保留了与其相似的立体构型和/或电荷性状的结构类似物来取代。本发明的某些实施方案提供了一个修饰过的多肽，经修饰后该多肽对脯氨酸后切割蛋白酶，如对二肽基肽酶IV(DPPIV、)水解作用的敏感性降低，该多肽在P’ i位的残基被一个氨基酸或式I的氨基酸类似物所修饰。本发明的发明名称为肽和多肽药物的稳定类似物。本发明涉及抗蛋白酶水解的肽和多肽类似物的组合物、其药学用途及其制备方法。