专利名称：一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物的制作方法普鲁兰多糖是麦芽三糖通过α-l，6-糖苷键连接而成的直链寡糖，而普鲁兰酶是指能够高效水解普鲁兰多糖的ー类水解酶。根据普鲁兰酶对底物特异性及水解产物的种类，可以将普鲁兰酶分为4种类型I型普鲁兰酶(EC 3. 2. I. 41)、II型普鲁兰酶(EC3. 2. I. 41)、新普鲁兰酶(EC 3. 2. I. 135)和异普鲁兰酶(EC 3.2.1.57)。I型普鲁兰酶可 以水解普鲁兰多糖和支链寡糖中的α -I, 6-糖苷键生成麦芽三糖和直链寡糖；而能水解普鲁兰多糖中的α-1，6-糖苷键同时也能水解其它多糖中的α-1，4-糖苷键的为II型普鲁兰酶；新普鲁兰酶和异普鲁兰酶作用于普鲁兰多糖中α -I, 4-糖苷键分别产生潘糖和异潘糖。由于I型普鲁兰酶对α -1,6-糖苷键的特异性及可以将最小単位的支链分解，在淀粉制糖エ业中与糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普鲁兰酶在以淀粉为原料的发酵エ业中有着广泛的应用前景。普鲁兰酶与糖化酶并用时，在降低糖化酶用量一半的同时可以使DE值上升至高达98%，从而大大提高原料的利用率和葡萄糖的收率，例如应用在酒精エ业中，可以显著提高淀粉的转化率，降低生产成本。普鲁兰酶与β_淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖，从而可以生产出80%以上的超高麦芽糖浆，在α-糖苷酶的作用下，超高麦芽糖浆转化为功能性异麦芽低聚糖，可以用于糖尿病人，肥胖病人以及儿童糖果中使用，有效地防止龋齿。在啤酒生产的糖化エ艺中，添加普鲁兰酶可以有效地提高麦汁中可发酵性糖的含量，提高麦汁的利用率、缩短糖化时间，生产出优级干啤酒。普鲁兰酶还可以用来生产具有稳定的凝胶性能、良好的韧性和增稠作用的直链淀粉，进而利用直链淀粉生产出可生物降解的薄膜或是作为添加剂或辅料用于食品エ业和纺织エ业中。此外，普鲁兰酶还存在较强的反向合成能力，在高底物浓度下可以将麦芽糖基等接枝到环糊精分子上，制备得到麦芽糖基环糊精等。由于普鲁兰酶在酒精、食品、环保产业上极其重要的用途，它将和淀粉酶、糖化酶ー样成为ー个与国民经济发展相关的重大产业。普鲁兰酶的生产和应用主要由诺维信和杰能科等国际公司所垄断。从20世纪60年代Bender在出芽短梗霉{Aureobasidium的发酵液中发现普鲁兰酶到80年代初，普鲁兰酶的研究一直处于产酶微生物的筛选和酶学性质的鉴定方面。近几年，国际上对普鲁兰酶的研究主要集中在普鲁兰酶在革兰氏阴性细菌中的分泌机制。而国内针对普鲁兰酶的研究主要集中在普鲁兰酶生产菌的筛选、发酵优化及普鲁兰酶编码基因的异源表达等方面，筛选获得的产酶微生物主要包括产气气杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，以及高温厌氧菌、嗜热古细菌、海栖热袍菌、深海古菌等极端微生物。但是其酶活较低，一般野生菌发酵普鲁兰酶活力均低于10 U/mL，且不能有效分泌至胞外，因而很难达到エ业化生产的要求。目前，尚没有通过筛选利用黑座克雷伯氏菌发酵生产普鲁兰酶的报道。本发明筛选获得产胞外普鲁兰酶的菌株黑座克雷伯^mebsiella variicolaXCTCC NO M 2012108，并通过发酵培养条件优化使该菌株产胞外普鲁兰酶的活力达到11 U/mL。
( I)要解决的技术问题 本发明的目的是提供一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是通过筛选获得可以生产普鲁兰酶的新菌株，而且通过培养基成分及培养条件优化进一步提高野生菌株生产普鲁兰酶的能力，并进一歩考察该菌株所产普鲁兰酶的酶学性质，以开发其生产和应用价值。(2)技术方案 本发明首先从微生物出发，筛选能够高效生产胞外普鲁兰酶的菌株。在此基础上，对该菌种的培养基成分及培养条件进行优化，并考察以该菌种进行发酵生产的普鲁兰酶的酶学性质及水解普鲁兰的过程中产物的组成变化，进而确定普鲁兰酶的类型。—、产胞外普鲁兰酶菌株的筛选及分类鉴定 培养基 基本培养基支链淀粉 10 g/L，酵母粉 5 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 ·7Η20 I g/L, NH4Cl2g/L, pH 5. O0鉴别培养基红色普鲁兰多糖10 g/L，蛋白胨10 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 · 7H20I g/L, NH4Cl 2 g/L，琼脂 20 g/L, pH 5. 0o初始发酵培养基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 2 g/L, pH 5. 0。主要试剂 3，5-ニ硝基水杨酸购于国药试剂公司 红色普鲁兰购于美国Sigma-Aldrich公司
普鲁兰购于上海TCI试剂公司
酵母粉购于Oxiod
蛋白胨购于Oxiod
菌种的培养和筛选
将所采集的土壤样品适量加入到基本培养基中于40°C、200 rpm的恒温摇床上振荡培养48小吋。取培养物进行适当稀释之后，涂布于鉴别培养基的平板上，于37°C的培养箱中进行培养2天左右。将其上生成较大透明圈的菌落接种于发酵培养基中于上述条件下进行培养48小时左右，同时接种于斜面上进行菌种的保存。菌种在装液量为10%的50 mL摇瓶中于30°C、150 rpm振荡培养48小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的測定和产酶菌株的再次确认。普鲁兰酶測定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH
5.O醋酸缓冲中的10 g/L普鲁兰相混合于50°C水浴中保温30分钟。加入DNS试剂300μ L摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出以流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以O. 5 cm比色杯，測定反应液的吸光度值。酶活单位定义在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于Iμ mo I葡萄糖的还原糖所需的酶为I个酶活单位(U)。产酶菌株的分类鉴定
利用细菌基因组DNA提取试剂盒(VI0GENE公司)提取产酶菌株的基因组，以细菌的通用引物 27F (5，- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3，)和 1492R (5，- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，)扩增其 16S rDNAoPCR 反应体系ddH20 37. 75 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L，dNTP (2· 5 mmol/L)4 yL，引物 27F (20 pmol/μ L)1 yL，引物 1492R (20 pmol/μ L) I μ L，基因组 DNA I μ L, Taq DNA polymerase (5 U/ μ L) 0. 25 μ L。PCR 反应过程94 °C 预变性 5 min ；98°C 10 s，55°C 15 s，72°C 4 min，进行 30 个循环；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化PCR反应获得的DNA片断，纯化后进行测序，并提交NCBI (登录号为HM037179)对菌株进行分类鉴定。通过比对，结果显示得到的产酶菌株为黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO :M2012108。ニ、发酵培养基成分的优化 培养基成分优化
分别考察了碳源、氮源、磷源及硫酸镁等对菌株产胞外普鲁兰酶的影响，并经过正交实验最终确定所得菌株黑座克雷伯氏菌GWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108发酵培养基的成分为
优化发酵培养基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L,MgSO4 · 7H20 0. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超纯水配制，pH 6· 5。培养条件优化
分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对转化及菌体量的影响。最终确定了出发菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M2012108培养条件为起始pH5. 0 7. O,装液量10 20%，摇床转速100 300 rpm,培养温度30 37°C，培养时间48 72小时。优化后，黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieWa variicolaXCTCC NO M 2012108产胞外普鲁兰酶的能力达到11 U/mL。三、胞外普鲁兰酶的制备及其酶学性质 胞外普鲁兰酶酶液的制备
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接种于优化发酵培养基装液量为10 20%的250 mL摇瓶中于3(T37°C、10(T300 rpm振荡培养48 72小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心30分钟，弃去细胞，得到的上清即为胞外普鲁兰酶的粗酶液，用于普鲁兰酶最适PH值、温度的測定及普鲁兰多糖的水解。pH值对普鲁兰酶活性的影响
将普鲁兰酶的粗酶液超滤浓缩10倍后，取适量用不同pH的缓冲液进行稀释至I U/mL左右，与溶于相同缓冲液、具有相同pH值的10 g/L的普鲁兰多糖溶液等体积混合后于50°C的水浴中保温30分钟后測定普鲁兰酶的活力，以确定其作用的最适pH值。以pH 5.0、50°C測定的普鲁兰酶酶活作为100%，计算不同pH对普鲁兰酶活力的影响。结果发现该普鲁兰酶在ρΗ5· (Γ7· O的范围内保持90%以上的活力，当pH低于5. O时活力明显下降。温度对普鲁兰酶活性的影响
将普鲁兰酶的粗酶液超滤浓缩10倍后，取适量用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲液进行稀释至I U/mL左右，与溶于相同缓冲液、具有相同pH值的10 g/L的普鲁兰多糖溶液等体积混合后于45 70°C的水浴中保温30分钟后測定普鲁兰酶的活力，以确定其作用的最适作用温 度。以pH 5. 0、55°C測定的普鲁兰酶酶活作为100%，计算不同温度对普鲁兰酶活力的影响。结果发现该普鲁兰酶在55°C时活力最高，当温度高于55°C后普鲁兰酶的活力明显下降。普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物及其类型
将普鲁兰酶的粗酶液超滤浓缩10倍后，取适量用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲液进行稀释至5 U/mL左右，与溶于相同缓冲液、具有相同pH值的10 g/L的普鲁兰多糖溶液等体积混合后于55°C的水浴中保温，分别在0、10、20和30分钟取样后加入沸水浴中保持10分钟灭活普鲁兰酶。冷却后加入3倍体积的无水こ醇沉淀蛋白和未被水解的普鲁兰，离心去除沉淀后，利用高效液相色谱测定上清液中成分的变化情況。结果发现，随着时间的延长，产物中麦芽三糖的量逐渐增加，因此确定黑座克雷伯氏菌variicola)CCTCCM2012108所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶。高效液相色谱测定普鲁兰酶水解普鲁兰多糖上清液中成分的条件液相色谱柱Kromasil NH2，示差折光检测器，流动相为こ臆/水(7 3)，流速I mL/min，进样量50 μし黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBavariicola) CCTCC NO M 2012108
菌落形态为灰白到乳白色粘液菌落，表面光滑，有光泽，菌落不透明。菌体形态为短粗杆状，大小O. 5 0. 8Xf 2 ym，単独、成双或短链状排列。无芽孢，无鞭毛，有较厚的荚膜，革兰氏阴性，不运动，氧化酶阴性，其生长不需要特殊的生长因子。生理生化特征表现为甲基红试验为阴性，VP试验为阳性，可以发酵葡萄糖，L-阿拉伯糖、乳糖、D-甘露醇、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖和D-山梨醇，可以利用柠檬酸盐等，脲酶试验为阳性，精氨酸双水解酶和鸟氨酸脱羧酶为阴性，赖氨酸胶羧酶为阳性。最适生长温度为37°C左右，最适pH为
6.5 7. 5之间。(3)有益效果
本发明通过筛选得到一株具有产较高胞外普鲁兰酶的菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M 2012108。经过培养基组成和培养条件优化后，用该菌株进行发酵产胞外普鲁兰酶时可以获得达到11 U/mL的普鲁兰酶。用该菌株所产胞外普鲁兰酶水解普鲁兰多糖时所得到的主要产物为麦芽三糖，从而确定该菌株所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶。生物材料样品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏单位中国典型培养物保藏中心，简写CCTCCJii :中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO M2012108，保藏日期为2012年4月11日。

实施例I
采用黑座克雷伯氏菌variicola) CClCC NO M 2012108发酵生产胞外普
鲁兰酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接种于优化发酵培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中于30°C、100 rpm振荡培养48小吋。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心30分钟，弃去细胞，得到的上清即为胞外普鲁兰酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲中的10 g/L普鲁兰相混合于50で水浴中保温30分钟，测得普鲁兰酶酶活为5U/mL ο实施例2
采用黑座克雷伯氏菌OWeZwieBa variicola) CClCC NO M 2012108发酵生产胞外普
鲁兰酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接种于优化发酵培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中于37°C、200 rpm振荡培养72小吋。培养结束后，将发酵 液于10000 rpm离心30分钟，弃去细胞，得到的上清即为胞外普鲁兰酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、pH 5.0醋酸缓冲中的10 g/L普鲁兰相混合于50°C水浴中保温30分钟，测得普鲁兰酶酶活为11U/mL ο


一种产胞外普鲁兰酶的方法及其专用微生物，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。本发明筛选得到一株产胞外普鲁兰酶的新菌种，分类命名为黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)SHN-1，保藏编号CCTCC NOM2012108。以该菌株作为出发菌种，经过发酵培养基和产酶培养条件的优化，最终获得的胞外普鲁兰酶酶活达到11U/mL。通过对黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108产胞外普鲁兰酶酶学性质的考察，确定了该普鲁兰酶的最适pH值为pH5.0、最适温度为55℃，其水解普鲁兰类型为I型普鲁兰酶。本发明有助于了解产胞外普鲁兰酶菌种的生物多样性，对于今后改善胞外普鲁兰酶的生产工艺、促进胞外普鲁兰酶的高效生产具有指导意义。