专利名称：前列腺素类化合物、组合物和治疗外周血管疾病和肺动脉高压的方法：本发明涉及修饰的前列腺素类化合物，尤其涉及其用于治疗外周血管疾病和肺动脉高压的含长效前列腺素的组合物。前列腺素类物质包括前列环素，它是一种由机体产生的前列腺素类似物并且涉及维持血管的正常功能。天然前列环素生来并不稳定，其有效寿命短于约6分钟。包括前列环素类在内的前列腺素类物质似乎通过三种途径维护血管正常发挥机能，1)它们扩张血管，在必要时，确保适当的血流；2)它们防止血小板聚集；和3)其参与调节血管周围平滑肌细胞的增殖，否则将收缩血管且阻碍血液流动。某些血管疾病的特征在于血管壁内层的降解、血小板聚集和平滑肌细胞机能的破坏。这些病症导致血管阻塞，并且影响它们提供无阻碍血液流动流经循环系统的能力。包括一种或多种上述病症的疾病是外周血管疾病和肺动脉高压。虽然各疾病影响着特定区域的血管，但这两种疾病的特征均在于血管缩小，其中血管不期望地收缩，致使血流减少，导致血压和血管阻力增高。另外，这些疾病表现出减少产生天然前列腺素类物质如前列环素。肺动脉高压是一种进行性的、威胁生命的血管疾病，难以诊断和治疗，目前无法治愈。其特征在于使心脏和肺之间的血管(称作肺部血管)内的血压增高，但机体其它部位的血压正常。这种高血压是由肺部血管的变窄引起。一种情况是和受影响血管内前列环素生产的减少相吻合。肺动脉高压通常引起心脏右侧劳损，因为心脏把血液泵到肺内。早期肺动脉高压的患者通常不知道他们患有这种疾病。然而，随着疾病的进行，患者感到呼吸困难、昏厥发作等，使他难于进行正常的日常活动。患有未治疗晚期肺动脉高压的患者常常致残并且可能死于心衰。传统上，肺动脉高压被认为由两种不同的情况组成原发性肺动脉高压和继发性肺动脉高压。原发性肺动脉高压被定义为不具有可识别具体病因的肺动脉高压。继发性被定义为具有已知病因如心脏、肺或肝脏机能障碍或硬皮病(一种结缔组织的疾病)的肺动脉高压。此处所用术语“肺动脉高压”包括原发性和继发性肺动脉高压。成千上万的美国人已被诊断出患有原发性肺动脉高压，同时更多的人被确诊为患有晚期继发性肺动脉高压。按照1989年″Chest″(胸科医师美国学会的官方出版物)中所公开的报告，在美国男子人群中肺动脉高压在年龄为35至44之间的男性中的流行率为8％至13％。它还报导，在年龄为65至更高年龄的男子中肺动脉高压的流行率超过20％。原发性肺动脉高压和晚期继发性肺动脉高压对前列环素的存在表现出应答。当肺系统外的血管和淋巴血管受到影响时，这种病症一般被称作外周血管疾病。此类疾病包括但不限于缺血性脑血管疾病、动静脉瘘、缺血性腿部溃疡、静脉炎、静脉机能不全、坏疽、肝肾综合征、非开放性导管动脉骨化、非阻塞性肠系膜局部缺血、动脉炎淋巴管炎等。然而，人们还不了解外周血管疾病的准确原因，糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、吸烟、缺乏锻炼和心血管病常常和这种疾病有关。在这种疾病的早期，患者首先没有症状，随后在步行时感到轻度到重度的疼痛。随着该疾病恶化，患者在静止时感到腿部疼痛，并且创伤愈合延迟，有时会导致溃疡、坏疽和截肢。晚期外周血管疾病患者的平均存活期约为6年。外周血管疾病在美国影响着约6百万人。另外，美国每年确诊出约350,000新的外周血管疾病的病例。外周血管疾病也对前列腺素、包括前列环素的存在有应答。
前列腺素类物质可以用于治疗人体中的外周血管疾病和肺动脉高压，因为他们通过防止不期望的血管狭窄对血液流动产生积极作用。然而，许多前列腺素及其包括前列环素在内的类似物具有非常短的有效寿命，因此需要不断地和持久地治疗以便向患者提供有效治疗。迄今为止，前列腺素类物质及其类似物的应用在外周血管疾病和肺动脉高压的治疗中严重受限制，这归因于其化学不稳定性、短的有效寿命和有限的给药方式。
前列腺素类物质的短的有效寿命归因于a)分子的活性基团在酶的作用下迅速失活，和b)其低分子量使它们易于被清除或排泄到体外。
前列腺素类物质具有一般为羟基或羧基形式的活性位点。酶可以迅速将这些活性基团灭活，由此使化合物失效。为了克服这个问题，一直采用连续输注或频繁给予高剂量的前列腺素类化合物使该化合物在患者中保持在治疗有效水平。然而，这样的给药方案是不利的，因为疗法昂贵，并且意外副作用的可能性相对较高。一些副作用包括恶心、肿胀、胃肠道不适、颌疼、皮疹和头痛。在某些患者中，严重的副反应致使治疗中断。
多数前列腺素类物质及其类似物如前列环素业已被制备，目的在于发现能够提供较高稳定性、更宽范围的给药方式、更有效的活性和/或较长有效寿命的药学上可接受的试剂。研究人员已经寻找到可以经口服有效给药的前列腺素类物质及其类似物，提供更少介入和更方便的医药治疗。前列腺素类物质及其类似物的现有口服形式一般具有至多1.5小时的有效寿命，并且在某些情况中仅为数分钟。短的有效寿命要求患者频繁摄取该药物，致使给药成为患者的难题，尤其对于患有慢性疾病的那些患者。
已有建议说生物活性物质如蛋白质、酶等和聚合物的偶联能够提高活性物质在体内的有效寿命、水溶性和抗原性。譬如，美国专利No.4,179,337公开了将肽或多肽与聚乙二醇(PEG)和类似的水溶性聚醚类化合物偶联，该文献在此引入作为参考。还可以参见，NucciM.，ShorrRGL&Abuchowski A.，″Advanced Drug Delivery Reviews″，6133-1511991；Harris JM(ed.)；和″Polyethylene Glycol ChemistryBiotechnicaland Biomedical Application″，Plenum Press，NY，1992。一般通过治疗剂与如数倍摩尔过量的聚合物反应可以制成偶联物，所述聚合物业已改性为含有末端连接基团，该连接基团确保活性物质与聚合物结合。以这种方式改性的多肽表现出降低了的免疫原性/抗原性，并且趋于在血流中具有比其未改性形式更长的有效寿命。
为了使聚醚和活性物质偶联，至少一个末端羟基被转化为反应性官能团。这个过程常常被称作“活化”并且产物称作“活化聚醚”。按照类似方法也可以“活化”或“官能化”其它基本上无抗原性的聚合物。
活化聚合物与具有亲核性官能团作为连接位点的治疗剂反应。一种常用作连接位点的亲核性官能团是赖氨酸的ε-氨基。游离羧基、适当活化的羰基、氧化的糖基部分和巯基也可以用作连接位点。
在聚合物和母体生物活性部分之间可以形成具有可水解键(键合)的生物活性聚合物偶联物，成为前药(其中在体内最终释放出母体分子)。业已公开了数种制备前药的方法。前药包括生物活性母体化合物的化学衍生物，其在给药时最终将活性母体化合物释放在体内。前药是适宜的，因为它们确保了生物活性化合物在体内作用的启动和/或持续时间的改进。前药常常是活性化合物的生物上惰性或基本上失活的形式。活性药物的释放速率受到若干因素的影响，包括连接生物活性化合物和前药载体(如聚合物)的连接基的水解速率。
虽然前列腺素及其类似物如前列环素有希望作为治疗剂，但需要a)提高此类化合物的稳定性，b)延长此类化合物的有效寿命，和c)确保此类化合物能够以更加适宜患者而不是目前所采用的给药方案给药。
因此，如果可以开发出前列腺素类物质及其类似物和采用它们的组合物，使其具有改进的稳定性、持续时间足以确保以合理次数给药的有效寿命和以更适宜患者而不是现有疗法采用前列腺素及其类似物的方式，那将是药物治疗领域中的显著进步，尤其对于外周血管疾病和肺动脉高压的治疗而言。
本发明提供用于治疗外周血管疾病和肺动脉高压的化合物、组合物和所述化合物和组合物的给药方法。本发明的化合物具有提高了的化学稳定性和有效寿命，在温血动物中其改进了所述化合物以药学可接受组合物形式用于治疗外周血管疾病和肺动脉高压的释放。通过修饰已知前列腺素化合物的一个或多个活性位点可以获得改进的稳定性、有效寿命和更可接受的给药方式和剂量方案。
因此，本发明的一个方面中，本发明的前列腺素类化合物或其类似物的一个或多个活性位点提供减慢化合物代谢速率的药学可接受基团。代谢速率的减慢使活性化合物的有效寿命增长，其a)提供更有效的活性化合物的给药，和b)确保更适宜患者的给药方案。
在本发明的另一方面中，提供一种治疗表现肺动脉高压和/或外周血管疾病的温血动物的方法，包括给予该动物治疗有效量的本发明的经修饰前列腺素类化合物及其类似物。
本发明的另一方面中，提供具有下式Ia或Ib的化合物[P-T]n-Z IaP-[T-Z]nIb其中P是前列腺素类化合物或其类似物，T表示P的修饰活性基团，Z是和T键合的减慢该化合物代谢速率的药学可接受基团；和n是至少1的整数；及其药学可接受盐。
图4表示一个剂量的mPEG20kDa-酯-化合物X作为静脉内快速浓注给药对绵羊肺部动脉血压的影响，该绵羊肺动脉高压是由静脉内给予肺动脉高压剂引起；和图5表示mPEG5kDa-酯-化合物X和天然化合物X以气溶胶的形式给药对各绵羊的肺部动脉血压的影响，绵羊的肺动脉高压是由静脉内给予肺动脉高压剂引起。
发明详述本发明涉及新的前列腺素类化合物及其类似物，其中至少一个活性位点连接在惰性、无抗原性、无免疫原性的基团上，该基团具有当对温血动物(包括人)给药时保护该活性位点的结构，由此使该化合物具有较长的有效寿命。因此，更多的化合物在更长的时间内通过处理靶向区域(例如患病组织和血管区域，如肺动脉)来有效治疗血管疾病。由于利用了更多的活性化合物，给药方案可以减轻患者的负担。此处所用术语″有效寿命″是指本发明化合物在温血动物中以其活性形式存在的持续时间。
至少一个活性基团的保护一般可以增加前列腺素化合物的有效寿命，使它们比天然或未保护形式的前列腺素类化合物更加适合不同的给药方式。
此处所用术语″前列腺素化合物及其类似物″在下文中将总称为″前列腺素类化合物″，是指所有前列腺素类化合物及其变型，它们具有至少一个活性基团(例如COOH和/或OH)并且至少最小限度地对温血动物中的外周血管疾病和肺动脉高压有效。此处所用术语″本发明前列腺素化合物″是指所定义的前列腺素化合物，其具有本发明所述的修饰。此处所用术语″活性基团″是指前列腺素化合物上的位点，其能够结合或与靶向组织(如血管组织)反应。
本发明包括所用种类的本发明前列腺素(PG)化合物。例如，本发明采用的本发明前列腺素类化合物包括修饰的PGA、PGB、PGC、PGD、PGE、PGF和PGI类化合物以及上述的亚类。前列腺素类化合物可以分离或提取自温血动物原料或利用所属领域普通技术人员已知的方法合成制得。
优选的本发明前列腺素类化合物由结构式II表示 其中Z1和Z2独立地选自氢和之前在结构式I中为Z定义的基团，条件是Z1和Z2中的至少一个不是氢；和X选自O或NH。
更加优选的结构式II的化合物是第1、2和3组定义如下的化合物，其中对于第1组的化合物Z1是和X结合并减慢该化合物的代谢速率的药学可接受聚合物；和X选自O和NH，和Z2选自H和乙酰基；对于第2组的化合物Z1是氢；
X是O，和Z2是减慢该化合物的代谢速率并且通过酯基连接于氧的药学可接受聚合物；和对于第3组化合物Z1是第1组定义的药学可接受聚合物；X是O或NH，和Z2是第2组定义的、经酯基连接于氧的药学可接受聚合物。
优选的化合物还是结构式III表示的化合物 其中Z1和Z2包括如上面结构式II定义的相同基团；f是1至3的整数；X选自O和NH；和R选自氢和烷基，优选具有1-6个碳原子。
更加优选的结构式III的化合物是第4、5和6组的化合物，其中对于第4组的化合物Z1是和X结合并减慢该化合物的代谢速率的药学可接受聚合物；X选自O和NH，和Z2选自氢和乙酰基；对于第5组的化合物
Z1是氢，X是O，和Z2是乙酰基，或减慢该化合物的代谢速率并且经酯基或醚基连接于氧的药学可接受聚合物；对于第6组的化合物Z1第4组定义的药学可接受聚合物，X选自O和NH，和Z2是如第5组定义的药学可接受聚合物。
非常优选的化合物是那些其中Z1和/或Z2基团是具有结构式CH3OCH2CH2(OCH2CH2)a的聚乙二醇，其中a是1至约1000。
特别优选的本发明前列腺素类化合物是那些具有结构式IV的化合物 其中a和X定义如上。优选a是约6至600，首选是约6至460。
本发明还涉及一种患有包括外周血管疾病和/或肺动脉高压在内的血管疾病的温血动物的治疗方法，包括给予该温血动物有效量的结构式I的化合物。含有所述化合物的适合以上述目的施用给温血动物的组合物是本发明的一部分。
外周血管疾病的特征在于流向腿部和足部的血液减少，同时局部缺血。噬斑在血管内衬层上的沉积和主动脉的逐步增厚和硬化是这种疾病的特征。器质性外周血管疾病还伴随着炎症和组织损伤。慢性轻度至重度的疼痛、可动性的丧失、坏疽、缺血性溃疡、创伤延迟愈合和失去四肢通常与外周血管疾病有关。
肺动脉高压的特征在于肺内血管狭窄和肺动脉血压危险性增高。内皮细胞和平滑肌细胞之间的异常相互作用引起平滑肌收缩是这种疾病的特征。器质性肺动脉高压还伴随着炎症和组织损伤引起瘢痕组织，其进一步使血管变狭窄并且使血管壁增厚。慢性轻度至重度疼痛、可动性的丧失、最终心衰和死亡与肺动脉高压有关。
这两种血管疾病的特征在于血管的异常缩小引起血流减少和血管阻力增高。向患有外周血管疾病的患者施用本发明的前列腺素类化合物，可以促进增加血液流经患病血管，由此增强局部缺血组织的氧合作用。此外，本发明前列腺素类化合物的抗血小板聚集和细胞保护活性必然能够通过抑制炎症反应来促使损伤组织愈合。
关于肺动脉高压，本发明前列腺素类化合物可以引发血管扩张，导致肺内小动脉中平滑肌的松弛，降低舒张血压，预防血凝块的形成，并且逆转肺内的瘢痕。这些作用联合引起肺动脉压和肺部血管阻力大幅度降低。此外，在外周血管疾病的情况中，本发明前列腺素类化合物的固有抗血小板聚集和细胞保护活性还能够通过抑制炎症反应来促使损伤组织愈合。
在本发明的一个方面，本发明前列腺素类化合物的一个或多个活性基团(例如COOH和OH)连接于惰性、非抗原性和非免疫原性的直链、支链和/或环状聚合物和共聚物。此外，聚合物必须能够以适合将本发明前列腺素转运至温血动物的靶向区域的速率与本发明的前列腺素类化合物分离。对于任何聚合物保持连接在前列腺素化合物的程度，其应不对外周血管疾病和肺动脉高压的治疗产生不良影响。
为了使前列腺素和聚合物如聚醚偶联，聚合物的一个或多个羟基被转化为能够进行偶联反应的反应性官能团。
活化聚合物与前列腺素类化合物反应，由此连接优先发生在游离羧基和/或羟基上。如果可利用或被利用在前列腺素类化合物上，适当的活化羰基、氧化的碳水化合物部分和巯基也可以用作偶联位点。
在本发明的一个优选方面中，羧基或羟基和活化聚醚之间形成酰胺或酯键。聚合物被尿烷形成键或类似的键活化，并且使聚合物易于经羧基或其它基团连接于前列腺素化合物的其它官能团也属于本发明。
在基本上非抗原性聚合物中，聚醚类化合物(PAO)尤其是单活化的、以烷基为末端的聚醚如聚乙二醇类(PEG)和尤其是以单甲基为末端的聚乙二醇类(mPEG)。双活化聚醚也被考虑用来交联前列腺素化合物或提供连接其它部分(如靶向试剂)的方式使聚合物-前列腺素偶联物定位在靶向区域内，如肺或肢体血管内。
适合的聚合物、尤其是PEG或mPEG基本上在重量上有所改变。本发明一般采用分子量为约200至约80,000道尔顿的聚合物。优选分子量约2,000至42,000道尔顿，并且特别优选分子量约5,000至28,000道尔顿。
本发明优选作为保护基的聚合物在室温下可溶于水。此类聚合物的非限定实例包括聚醚均聚物如PEG和mPEG，或聚丙二醇类、聚氧乙烯化多元醇、及其共聚物和嵌段共聚物。除了mPEG以外，以C1-4烷基为末端的聚合物也适用。
作为另一种含PAO聚合物，可以采用有效的非抗原性材料，如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、含碳水化合物聚合物等。前列腺素类化合物的修饰可以进一步包括但不限于乙酰化、羧基化、葡糖基化、磷酰化、脂化和酰化。所属领域的普通技术人员将理解上述内容仅仅是举例说明，所有具有本发明所述品质的聚合物材料均可以被考虑。
前列腺素类化合物与上述保护基偶联生成本发明的前列腺素类化合物，其可以有效地将活性化合物转运到靶向区域，并且使本发明的前列腺素化合物在该靶向区域内保持比已知前列腺素化合物更长的时间。因此，本发明前列腺素类化合物特别适合于外周血管疾病和肺动脉高压的治疗。
如上所述，许多应用在外周血管疾病和肺动脉高压疗法中的已知前列腺素类化合物在温血动物中具有非常短的有效寿命，通常少于1小时。根据本发明，提供了本发明的前列腺素类化合物，它们具有可以持续达数小时的改进的有效寿命，较长的有效寿命可以减少本发明前列腺素类化合物的给药次数，由此使本发明的前列腺素类化合物可以以较低的剂量单位量和较低的频率给药。
本发明前列腺素类化合物的活性基团包括COOH和OH。这些活性基团的一个或多个由下文详细描述的保护基保护。保护基一般可以具有500,000或更高的分子量。在本发明的优选形式中，当OH未保护时，分子量至少为5,000道尔顿的基团与COOH偶联，更优选至少20,000道尔顿。分子量至少为5,000道尔顿的保护基可以减慢该化合物的排泄，由此能够提高在温血动物中的有效寿命。
所述保护基是任何可以起保护活性基团(COOH和OH)不被过早代谢但可以很容易地以受控方式与活性基团分离和/或与该活性基团连接但对该化合物的功能无不良影响的基团。所述保护基包括，例如聚合物、直链和支链烷基、芳烷基、芳基、酰基、杂环基、亚烷基，其全部可以被选自例如烷基、芳基和芳烷基等的取代基取代。
在可以和活性基团偶联的聚合物中包括聚二醇类、聚乙烯聚合物、聚酯、聚酰胺、多糖和聚合酸、脂质、氨基酸、核酸、碳水化合物，和它们的联合形式。
优选的聚二醇包括聚乙二醇和聚丙二醇。
优选的多糖是选自多糖B的那些。
在多元酸中本发明优选聚氨基酸和聚乙酸。
在上述种类的聚合物中，优选的聚合物是聚乙二醇类化合物(PEG)。
除了上述聚合物以外，所述聚合物如葡聚糖、纤维素聚合物和淀粉类也可以用于本发明。
所述聚合物可以通过一个基团如酰胺基、酯基等连接于活性COOH或OH基团。
结构式I的化合物一般用作治疗血管疾病(包括外周血管疾病和肺动脉高压)药物组合物的组成部分，该组合物含有药学可接受载体。出于这种目的所用的化合物一般是以0.5至100mg/kg/天，优选约25至35mg/kg/天的量给药。
可以通过例如采用常规固态或液态载体或稀释剂，以及适合预期给药方式的药学添加剂(例如赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂等)、按照如药剂领域中已知的技术配制上述含有至少一种结构式I的化合物的药物组合物。
结构式I的化合物可以以任何适合方式给药，例如口服给药，如片剂、胶囊、颗粒或粉末；舌下给药；经颊给药；非肠道给药，如皮下、静脉内、肌肉内，或胸骨内注射或输注技术(例如灭菌可注射含水或非水溶液或混悬液)；鼻部给药如喷射吸入；局部给药如乳剂或软膏方式；直肠给药如栓剂；以含有无毒、药学可接受赋形剂或稀释剂的剂量单位制剂给药。通过应用适当的含有本发明化合物的药物组合物，本发明的前列腺素类化合物可以是被即时释放或延迟释放，或特别是在延迟释放的情况中，可以采用装置如皮下植入物或渗透泵。本发明也可以以脂质体形式给药。
口服给药的组合物实例包括混悬液，其可以含有例如微晶纤维素提供疏松作用，藻酸或藻酸钠作为助悬剂，甲基纤维素作为粘度增强剂，和甜味剂或矫味剂，如所属领域已知的那些；和即时释放片剂，其可以含有例如微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其他赋形剂、粘合剂、填料、崩解剂、稀释剂和润滑剂，如所属领域已知的那些。本发明的化合物也可以经口腔转运通过舌下和/或经颊给药。铸模片剂、压缩片剂或冻干片剂是可采用的示例剂型。组合物实例包括那些将本发明化合物和速溶稀释剂如甘露糖醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精配制。在这些制剂中还包括高分子量赋形剂，如纤维素(微晶纤维素)一起。所述制剂中也含有有助于粘膜附着的赋形剂，例如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如Gantrez)，和控释试剂，例如聚丙烯酸共聚物(例如卡巴浦尔934)。加入润滑剂、助悬剂、矫味剂、着色剂和稳定剂可以易于制备和应用。
鼻用气雾剂或吸入给药的组合物实例包括存在于盐水中的溶液，其可以含有例如苄醇或其他适宜的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂，和/或其他增溶或分散剂，譬如所属领域已知的那些。
非肠道给药的组合物实例包括可注射溶液或混悬液，其含有例如适宜的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，如甘露糖醇、1，3-丁二醇、水、林格氏溶液(一种等渗氯化钠溶液)；或其他适当的分散剂或湿润剂和助悬剂，包括合成甘油一-或二酯，和脂肪酸，包括油酸。
直肠给药的组合物实例包括栓剂，其可以含有例如适宜的无刺激赋形剂，如可可脂或合成甘油酯，它们在常温下为固体，但在直肠腔中液化和/或溶解释放出药物。
局部给药的组合物实例包括局部载体，例如Plastibase(和聚乙烯胶凝的矿物油)。
所属领域普通技术人员可以测定出本发明前列腺素类化合物的有效量，包括成年人的例举剂量为约0.5至100mg本发明前列腺素类化合物/kg体重/天，其可以以单剂量或分开的剂量形式给药，例如每天给药1至4次。应理解，对于任何特定对象可以改变具体剂量水平和给药次数，这取决于多种因素，包括特定化合物的活性，对象的种族、年龄、体重、全身健康、性别和饮食，给药方式和次数，排泄速率，药物联用，和特定病症的严重性。治疗优选的对象是患有血管疾病的动物，首选哺乳动物如人，和宠物，如狗、猫等。
一般地，与已知天然或非偶联的前列腺素类化合物相比，本发明前列腺素类化合物获得预期效果、即扩张有关患病脉管系统所需要的剂量明显较低。由于已知天然或非偶联形式的已知前列腺素类化合物在体内快速代谢，这些药物需要以较大剂量长时间连续输注才能在被治疗患者中维持有效的血液水平。然而，在其他副作用中，由高血液水平的已知前列腺素类化合物引起的低血压、心动过速和腹泻限制了已知前列腺素的可给药量。此外，前列腺素类化合物的高费用在价格上妨碍了以大剂量静脉内给药。本发明的方法提供了本发明前列腺素类化合物以低成本和低副作用有效给药。
本发明的前列腺素类化合物可以经皮下以液体重构形式的冻干粉末形式给药，液体重构冻干粉末可以另外含有防腐剂、缓冲剂、分散剂等。优选地，用静脉内注射常用的介质如无防腐剂灭菌水重构该前列腺素类化合物。通过连续静脉内或皮下输注或通过静脉内注射可以完成给药。为了连续输注，可以将日剂量加入普通盐水或其他溶液中，将该溶液通过机械泵或通过重力输注。
下列实施例举例说明本发明的实施方式。在不脱离本发明实质和范围下，所属领域技术人员很容易理解对本发明的改变、改进和差异，本发明的范围是由本申请组成部分的权利要求书定义的。
将200mg具有下列结构式的化合物X
置于含有mPEG5k胺(2.5g)、2-羟基苄基三唑(HOBT，67mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，61mg)和二环己基碳二亚胺(DCC，140mg)的圆底烧瓶内。反应物和60ml无水二氯甲烷混合。该混合物在室温下搅拌过夜，此后蒸发除去溶剂。把残余物溶解在25ml的1，4-二氧六环中，过滤除去不溶物。浓缩溶剂，随后沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶异丙醇中。过滤收集沉淀，真空下干燥。产物收率为2.5g(93％).1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，PEG)，7.897(t，-PEGNH-CO-(化合物X))，4.49(d，(化合物X)-OH1)，4.24(d，(化合物X)-OH2)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，4.436(s，(化合物X)CH2CONHPEG)，7.045(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
在圆底烧瓶中，将化合物X(400mg)和吡啶(200μl)在35ml的无水二氯甲烷中混合，向该混悬液中加入500μl的乙酸酐。化合物在数小时内变均相，该溶液在室温下搅拌过夜。浓缩溶剂，向残余物中加入磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)。将该混合物快速搅拌30分钟，用二氯甲烷提取该混合物3次。合并的有机相用硫酸钠干燥，蒸发除去溶剂。得到油状产物，化合物X二乙酸酯。产量为340mg(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)。
在圆底烧瓶中，将mPEG5k(3.8g)、上步制得的化合物X二乙酸酯(320mg)、2-羟基苄基三唑(HOBT，103mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，93mg)和二环己基碳二亚胺(DCC，238mg)溶解在50ml无水二氯甲烷中。该溶液在室温下搅拌过夜，蒸发除去溶剂。残余物溶于35ml的1，4-二氧六环，过滤除去不溶物。浓缩溶剂，沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶异丙醇中。过滤收集沉淀，真空下干燥。产量为3.2g(78％)1HNMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4.77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
在圆底烧瓶中，把化合物X(200mg)和氢氧化钠(21mg)在40ml无水乙腈中混合。向该混悬液中加入90mg溴苄，将该混合物回流2天。过滤除去固体，浓缩溶剂，残余物在真空下干燥。得到油状产物，化合物X-苄酯。产量为210mg(100％).1H NMR(DMSO-d6)δ7.37(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，5.19(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，4.83(s，(化合物X)-CH2COOBz)，4.49(d，(化合物X)-OH1)，4.24(d，(化合物X)-OH1)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
在圆底烧瓶中，mPEG 20k(3g)、化合物X-苄酯(上步制备，100mg)、HOBT(3mg)、DMAP(25mg)和DCC(42mg)溶于40ml无水二氯甲烷中。该溶液在室温下搅拌过夜，蒸发除去溶剂。将残余物溶解在30ml的1，4-二氧六环中，过滤除去不溶固体。浓缩溶剂，随后沉淀在100ml的50∶50/乙醚∶异丙醇中。过滤收集沉淀。真空下干燥。产量为2.7g(90％).1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，2.48(t，mPEG-OCH2CH2COO-(化合物X))，7.35(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，5.17(s，C6H5-CH2-OCO-(化合物X))，4.83(s，(化合物X)-CH2COOBz)，0.857(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
存在于1，4-二氧六环(30ml)中的mPEG-化合物X苄酯(上步制得，2.7g)的溶液用H2(2atm压力)和1g的Pd/C(10％)氢化过夜。过滤除去催化剂，催化剂用新制二氯甲烷洗涤。利用旋转蒸发浓缩合并的溶液，将残余浆液加入300ml乙醚中。过滤收集产物并且真空下干燥。产量为2g(74％).1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(br m，PEG)，2.48(t，mPEG-OCH2CH2COO-(化合物X))，4.61(s，mPEG-(化合物X)-CH2COOH)，0.857(t，(化合物X)-CH3)，7.025(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
方法富血小板血浆(PRP)的制备从至少14天内没有摄取任何药物的健康志愿者中采集血液，通过静脉穿刺收集到3.15％(w/v)柠檬酸三钠(9∶1 v/v)中。血液在800g下离心15分钟制成PRP。PRP进一步在12,000g下离心1分钟制成PPP。
血小板聚集的光度测量利用双通道Payton血小板凝集计测量血小板聚集，该仪器用PRP(0％)和PPP(100％)分别校正透光度。将PRP的试样(500μl)加入硅化比色杯中，搅拌(1000转/分钟)并加热至37℃。测试前将血小板温育1分钟建立稳定的基线。把次最大浓度的凝集剂胶原(1μg/ml)加入PRP中，在4分钟内随着透光率的增加测定血小板聚集作用。
抗聚集反应令化合物X(1-100ng/ml)和化合物1-3(0.1-10mg/ml)分别和PRP一起温育1分钟，随后加入胶原(1μg/ml)，一种凝固剂。利用加入胶原后4分钟内观察的透光率峰的增量与对照值比较计算出血小板聚集的抑制百分比。利用采自至少3名志愿者的PRP重复这个试验。
试验结果在表1中给出。表1中的结果例证了化合物X和化合物1至3在上述试验条件下对人血小板聚集作用的浓度依赖性效应。
用含水载体和PPP温育后的抗聚集反应在各试验中，令化合物X(30和300ng/ml)的样本和化合物1(0.3和3mg/ml)、化合物2(0.03、0.3和3mg/ml)和化合物3(3mg/ml)的样本与500μl含水载体(乙酸盐缓冲液)在37℃下一起温育不同的时间，包括15分钟、1小时和4小时。温育期后，取50μl含有相应样本化合物的含水载体加入新制PRP(450μl)中，测定胶原刺激后的抗聚集活性。利用采自至少3名志愿者的PRP重复这个试验。化合物X和化合物1-3在和含水载体(乙酸盐缓冲液)温育15分钟、1小时和4小时后对人血小板聚集的影响分别在表2中详细给出。化合物X和化合物1-3在和PPP温育15分钟、1小时和4小时后对人血小板聚集的影响分别在表3中详细给出。表2和3中的数据表示n个供体的平均值和标准偏差。
结果化合物X对血小板聚集的影响如表1所示，化合物X(1-100ng/ml)在加入胶原之前和PRP一起温育1分钟，引起胶原诱发的血小板聚集的浓度依赖性抑制。在较高浓度(30和100ng/ml)下，化合物X完全抑制聚集反应(参见表1)。化合物X抑制50％聚集反应的浓度(ID50)测定出为20ng/ml。
参考表3，化合物X(3和300ng/ml)与PPP温育15分钟、1小时和4小时对于抗血小板活性没有显著作用。同样地，化合物X(30和300ng/ml)与含水载体单独15分钟、1小时和4小时的温育对于抗血小板活性的水平也没有明显影响，如表2所示。化合物1对血小板聚集的影响化合物1(0.1-3mg/ml)在加入胶原之前与PRP温育1分钟，引起血小板聚集的浓度依赖性抑制，如表1所示。最高浓度(3mg/ml)下，化合物1完全抑制对胶原的聚集反应(参见表1)。化合物1在温育1分钟后抑制血小板聚集的活性比化合物X的抗聚集活性低约105倍。
如表3所示，化合物1的抗聚集活性在分别与PPP温育1小时和4小时后是以时间依赖的方式增高。1小时后，活性提高7倍；4小时后，活性比1分钟温育后观察到的活性提高了约22倍(参见表3)。
通过比较，化合物1和含水载体单独的温育在任何试验时间点对抗血小板活性都没有影响(参见表2)。化合物2对血小板聚集的影响如表1所示，在所评估的最高浓度(10mg/ml)下，化合物2在与PRP温育1分钟时产生约20％的血小板聚集抑制率。较低浓度的化合物2在1分钟温育后没有显著的抗血小板活性(参见表1)。
如表3所示，观察到化合物2的活性在和PPP温育1小时和4小时后以时间依赖性方式大大提高。当在PPP中温育1小时这种活性比1分钟的温育提高了50倍。此外，这种活性在温育4小时后比1分钟温育后观察到的活性提高了至少3,500倍(参见表3)。
然而，化合物2和含水载体单独的温育对抗血小板活性在任何试验时间点都没有上述作用(参见表2)。化合物3对血小板聚集的影响如表1所示，化合物3(0.3-10mg/ml)与PRP温育1分钟，引起血小板聚集的浓度依赖性抑制。在最高浓度(10mg/ml)时，化合物3完全抑制该聚集反应(参见表1)。
化合物3(300μg/ml)以1分钟温育后无效的浓度和PPP一起温育4小后，可以引起活性增高，达到40％血小板聚集的抑制率(参见表3)。由于在这样的温育期后活性较弱，所以没有进一步评价其他浓度。
化合物3和含水载体的温育在任何试验时间点都对于抗血小板活性没有影响(参见表2)。
结论上述有关化合物X和化合物1-3的发现表明，分子量为5,000至20,000道尔顿的PEG部分的包含以及乙酸酯基化可以降低化合物X的抗(血小板)聚集活性。然而，这些化合物的活性在和人血浆但不是单独的缓冲液一起温育约4小时期间有所提高，这表明存在对这些衍生物的酶促水解，由此活性化合物可以长时间释放。
表1化合物X和化合物1-3对人血小板聚集的浓度依赖性作用
表2化合物X和化合物1-3在和含水载体(乙酸盐缓冲液)温育后对人血小板聚集的影响
表3化合物X和化合物1-3在和人PPP温育后对人血小板聚集的影响
实施例5静脉内给药的化合物X和化合物1-3在麻醉大鼠中的体内全身血液动力学作用介绍这个研究报导了化合物1-3和化合物X比较在硫喷妥钠麻醉大鼠中的生物活性的效价、活化和持续时间。观察各化合物在快速浓注静脉内注射后对血压(BP)和心搏率的影响。评价启动时间、最大反应以及反应回归到基线值的50％所需的时间用于对比有效寿命。
材料和方法用硫喷妥钠麻醉雄性Wistar大鼠(INTRAVAL_，120mg kg-1i.p.)。插入导管便于呼吸。将右颈动脉插导管并且和血压传感器(SpectramedP23XL)相连，用于测量平均动脉血压(MAP)和心搏率(HR)，在四道Grass 7D多种波动描记器上连续记录(Grass，Mass.，USA)。在左股静脉或右颈静脉插管用于给药。试验动物的体温利用直肠探针式温度计维持在37±1℃，该温度计与恒温毯式控制单元(Harvard Apparatus Ltd)相连。
15分钟稳定期后，给动物静脉内注射一次选定剂量的各种化合物，并且连续监测3小时的血液动力学参数，以确定被研究化合物的作用时间。
结果化合物X分别以0.1mg/kg和1mg/kg的静脉内剂量的给药引起MAP的即时、剂量相关性衰减，和剂量相关性心搏率加快。约70mmHg的MAP最大衰减出现在化合物X给药后的第1分钟内。化合物X的有效寿命与回归到基线值的50％的MAP反应直接相关，化合物X在0.1mg/kg剂量时的有效寿命约为15分钟，在1.0mg/kg剂量时化合物X的有效寿命约为30分钟。
化合物1以静脉内剂量为0.1mg/kg和1mg/kg的给药引起MAP的即时、剂量相关性衰减，其与心搏率的剂量相关性加快有关。60mmHg的MAP最大衰减出现在化合物1给药后的第1分钟内。有效寿命是回归到基线值的50％之前的MAP衰减持续时间的函数，对于10mg/kg和30mg/kg的化合物1，有效寿命分别约为15分钟和约30分钟。
对于化合物2，即时的MAP衰减出现在10和30mg/kg剂量的给药时，与心搏率的剂量相关性加快有关。注射10mg/kg化合物2后，30mmHg的MAP最大衰减出现在该化合物给药后的10分钟内。有效寿命是由10mg/kg化合物2引起的MAP衰减持续时间的函数，该有效寿命约为125分钟。注射30mg/kg化合物2后，30mmHg的MAP最大衰减出现在化合物给药后的5分钟内。此后MAP似乎向基线回归。然而，在约30分钟时MAP出现第2次衰减(其如同第1次衰减般明显)。由30mg/kg化合物2引起的两次观察到的MAP衰减的有效寿命分别为105-160分钟。
当化合物3以30mg/kg的剂量给药时，可以观察到小但即时的MAP衰减。然而，在注射化合物3后的45和120分钟时，MAP出现渐进式衰减。化合物3注射后135-165分钟内MAP的这种延迟性衰减向基线回归。30mmHg的MAP最大衰减出现在该化合物给药后的75分钟内。由30mg/kg引起的MAP衰减的有效寿命大于105分钟。
结论已经证实化合物X引起基本上为剂量相关性的MAP衰减。与化合物X相似，化合物1引起MAP在数量和时间上相似的剂量相关性衰减。化合物2和3产生较小的MAP衰减，但它们各自的作用时间相对较长。化合物2引起血压明显且长时间的衰减，该化合物在10mg/kg的剂量下与心搏率的明显加快无关。化合物2引起的MAP即时衰减不如化合物X那样明显，此发现在安全性方面具有优越性。
在圆底烧瓶中，将化合物X(400mg)和吡啶(200μl)在35ml的无水二氯甲烷中混合，向该混悬液中加入500μl的乙酸酐。混合物在数小时内变均相，该溶液在室温下搅拌过夜。浓缩溶剂，向残余物中加入磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)。将该混合物快速搅拌30分钟，用二氯甲烷提取该混合物3次。合并的有机相用硫酸钠干燥，蒸发除去溶剂。得到油状产物，化合物X二乙酸酯。产量为340mg(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCG3)，0.84(t，(化合物X)-CH3).实施例7mPEG20K-酯-化合物X二乙酸酯的合成此后称作“化合物5”以下列方式制备第4组的化合物，其中Z1是分子量约20,000道尔顿的mPEG，X是O和各Z2是乙酰基。
在圆底烧瓶中，将mPEG 20千道尔顿(5.2g)、化合物X二乙酸酯(140mg)、1-羟基苄基三唑(HOBT，35mg)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP，30mg)和二环己基碳二亚胺(DCC，75mg)溶解在60ml无水二氯甲烷中。该溶液在室温下搅拌过夜，蒸发除去溶剂。残余物与35ml的1，4-二氧六环混合，过滤除去不溶固体。真空下浓缩溶液，随后加入200ml的50∶50/乙醚∶异丙醇中。过滤收集沉淀，真空下干燥。产量为4.8g(92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-OCOCH3)，2.00(s，(化合物X)-OCOCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4.77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
化合物6和7分别是mPEG 20kDa-酰胺-化合物X和mPEG20kDa-酰胺-化合物X二乙酸酯并且按照类似于实施例1的化合物1制备。每种化合物6和7是第4组的化合物，其中Z1是分子量约为20,000道尔顿的mPEG和X是NH。对于化合物6，Z2是氢，对于化合物7，Z2是乙酰基。
方法富血小板血浆(PRP)的制备从至少14天内没有摄取任何药物的健康志愿者中采集血液，通过静脉穿刺收集到3.15％(w/v)柠檬酸三钠(9∶1 v/v)中。血液在800g下离心15分钟制成PRP。PRP进一步在12,000g下离心1分钟制成PPP。共12名志愿者献血用于该研究。
血小板聚集的光度测量利用双通道Payton血小板凝集计测量血小板聚集，该仪器用PRP(0％)和PPP(100％)分别校正透光度。将PRP的试样(500μl)加入硅化比色杯中。搅拌(1000转/分钟)并加热至37℃。将血小板温育1分钟建立稳定的试验前基线。把次最大浓度的凝集剂胶原(1μg/ml)加入PRP。在4分钟内随着透光率的增加测定血小板聚集作用。
抗聚集活性令化合物X(1-100ng/ml)和化合物4(1-300ng/ml)和PEG偶联衍生物，化合物5-7(0.1-10mg/ml)分别和PRP一起温育1分钟，随后加入胶原(1μg/ml)，一种凝固剂。利用加入胶原后4分钟内观察的透光率的峰增量与对照值比较计算出血小板聚集的抑制百分比。利用采自至少3名志愿者的PRP对被研究化合物重复这个试验。
与含水载体和PPP温育后的抗聚集反应在各试验中，令不同浓度的化合物X(30和300ng/ml)和化合物4和化合物5-7与500μl PPP或含水载体(乙酸盐缓冲液)在37℃下一起温育不同的时间，包括15分钟、1小时和4小时。温育期后，取PPP或含水载体的试样加入新制PRP(450μl)中用于测定抗血小板活性。利用采自至少3名志愿者(50μl)的PPP对各化合物重复这个试验。
结果化合物X对血小板聚集的作用化合物X(1-100ng/ml)和PRP温育一(1)分钟，引起胶原诱导血小板聚集的浓度依赖性抑制。在较高浓度(30和100ng/ml)，化合物X完全抑制该聚集反应。化合物X抑制50％聚集反应的浓度(IC50)为19±1ng/ml。化合物4对血小板聚集的影响化合物4、化合物X二乙酸酯(1-300μg/ml)和PRP温育一(1)分钟，引起血小板聚集的浓度依赖性抑制。在最高浓度(300μg/ml)，化合物4完全抑制对胶原的聚集反应，抑制50％聚集反应的浓度为68±2μg/ml。化合物4在温育一(1)分钟后抑制血小板聚集的活性比化合物X的抗聚集活性低约3×103倍。
化合物4的抗血小板活性在与PPP温育后第1个15分钟后提高。15分钟后，活性提高了约10倍，同时IC50为5±0.2μg/ml。当该化合物在盐水中温育的过程中也可以观察到这种效果。然而，当在PPP中温育达4小时观察到活性没有进一步提高。化合物5对血小板聚集的影响化合物5在最高评估浓度(10mg/ml)时与PRP一起温育一(1)分钟时引起约10％的血小板聚集抑制率。较低浓度的化合物5在这种1分钟温育后没有显著的抗血小板活性。
高浓度的化合物5的活性在与PPP温育一(1)和四(4)小时后以时间依赖方式提高。当在PPP中温育四(4)小时后这种活性提高了十(10)倍以上，同时IC50为513±18μg/ml。然而，化合物5与含水载体的温育在任何试验时间点对抗血小板活性都无影响。化合物6对血小板聚集的影响化合物6(0.1-3mg/ml)与PRP温育一(1)分钟，引起血小板聚集的浓度依赖性抑制。在最高浓度(3mg/ml)下，化合物6接近最大抑制聚集反应。化合物6的IC50为600±34μg/ml。
化合物6(100μg/ml)以一(1)分钟后无效的浓度与PPP温育四(4)小时，引起活性提高，达到85％的血小板聚集抑制率。化合物6的在(4)小时温育后的IC50为60±5μg/ml。由于在上述温育期后活性微弱，所以没有进一步评价其他浓度。
化合物6和含水载体的温育对抗血小板活性在任何试验时间点没有影响。化合物7对血小板聚集的影响化合物7(10mg/ml)以最高浓度与PRP温育一(1)分钟，无法显著抑制聚集反应。
化合物7(10mg/ml)与PPP或含水载体四(4)小时的温育，表现出活性没有提高。由于在上述温育期后活性微弱，所以没有进一步评价其他浓度。
结论本发明研究证实了前列环素的苯并茚衍生物，化合物X在人富血小板血浆中的有效体外抗血小板聚集活性，利用光学凝集计测定。在本研究中这种化合物在与血小板混悬液温育一(1)分钟后，其功效类似于上述的实施例4。在上述研究中，通过和无血小板血浆或含水载体在37℃下温育四(4)小时对于抗血小板活性没有影响，证明了其在生理条件下的化学稳定性。
本研究的发现表明，化合物X具有明显高于二乙酸酯衍生物，化合物4的抗血小板活性，二乙酸酯的活性约低3,000倍。这种乙酰化衍生物在与血浆或含水载体温育时其活性在开始十(10)分钟内提高了约10倍，但这种活性的提高在温育四(4)小时后不再增高。这种早期增高的机理可以反映出二乙酸酯在与PPP介质温育时的瞬时不稳定性。
本研究还表明，化合物X具有比化合物4-7明显高的抗血小板活性。化合物6在与富血小板血浆温育一(1)分钟后是三种PEG偶联衍生物(化合物5-7)中活性最高的，但有效性明显低于化合物X，活性低约3×104倍。
在于贫血小板血浆(PPP)温育四(4)小时的作用下，化合物5-7的抗血小板活性有所变化。利用人血浆无法体外试验大于四(4)小时的时间点，因为血小板聚集反应在收集后6小时快速衰减。化合物5和6的活性在四(4)小时的温育后提高了10倍以上，当在盐水中温育时没有观察到这种作用。这些发现表明这些PEG偶联衍生物(化合物5-7)的活性基团在人血浆中存在的酶的作用下、在37℃下温育四(4)小时后以时间依赖方式释放，即在人血浆中这些分子上的酯基和乙酸酯基分别水解。然而，应注意到由这些化合物观察到的活性提高基本上低于实施例4中研究的某些化合物。
有关化合物5-7的上述发现表明，分子量20,000道尔顿的PEG部分以及乙酸酯基的包含降低了化合物X的抗聚集活性。然而，化合物5和6的活性在与人血浆温育四(4)小时时提高，这表明这些取代基水解。在与人血浆温育4小时后观察到这些化合物的活性提高了10倍，但当单独在缓冲液中温育时活性不提高，这表明这些衍生物中的酯键和酰胺键被酶促水解，同时释放活性基团。上述发现证实了创造出基于PEG取代的化合物X的缓释衍生物，它们可以在人血浆中活化。实施例 9化合物X和化合物4-7在麻醉大鼠中的体内全身血液动力学影响介绍在本研究中，观察化合物4-7在硫喷妥钠麻醉大鼠中的心血管活性。测定在快速浓注静脉内注射后这些化合物对血压(BP)和心搏率的影响。记录启动的时间和最大反应，以及反应回归到基线所需的时间。各化合物以单剂量向各只动物给药，建立剂量—反应曲线。
在它们的其他作用中，化合物4-7体外引起肠系膜动脉的浓度依赖性松弛，当静脉内给予麻醉大鼠时，这造成平均动脉血压(MAP)的可测量减少。为了证实化合物4-7比化合物X的有效寿命有所改进，申请人寻找到测量MAP随时间的变化，外推出化合物的有效寿命，其被定义为反应回归到基线值的50％所需要的时间。
材料和方法本研究包括选用硫喷妥钠(Intraval_，120mg kg-1i.p.)麻醉的雄性Wistar大鼠插入导管便于呼吸。将右颈动脉插导管并且和血压传感器(Spectramed P23XL)相连，用于测量平均动脉血压(MAP)和心搏率(HR)，连续记录在4道Grass 7D多种波动描记器(Grass，Mass.，USA)。在左股静脉或右颈静脉插管用于给药。试验动物的体温利用直肠探针式温度计维持在37±1℃，该温度计与恒温毯式控制单元(HarvardApparatus Ltd)相连。
15分钟稳定期后，给动物分别静脉内注射选定单剂量的天然化合物X和化合物4-7，并且连续监测3小时的血液动力学参数，以确定被研究化合物的作用时间。
结果化合物4分别以1、3和10mg/kg的静脉内剂量的给药引起MAP快速的、剂量相关性衰减，其与心搏率的剂量依赖性加快相关联。注射1mg/kg后，约30mm Hg的MAP最大衰减出现在该化合物给药后30分钟。由1mg/kg的化合物4引起的MAP衰减的有效寿命约为110分钟。
一个剂量的化合物X的给药(1mg/kg i.v.)引起与最高剂量的化合物4(10mg/kg i.v.)相似的MAP最大衰减。当和化合物X进行比较时，化合物4引起的MAP衰减实质上持续时间更长，同时其有效寿命约为90分钟，而化合物X的为30分钟。化合物4的作用时间比10倍最大剂量的化合物X所激发的作用时间长。这个发现表明，由该衍生物观察到的作用时间的增加是超大剂量的化合物X所无法获得的。此外，化合物4引起的心动过速比化合物X引起的心动过速开始得慢。应注意化合物4引起的心动过速在化合物注射后3小时仍然非常显著。
化合物5(3、10和30mg/kg i.v.)的给药引起MAP剂量相关性衰减，其不如化合物4或化合物X所引起的那样明显，并且其与心搏率的明显加快无关。反应在15分钟后达到其最大值，同时作用时间非常长，有效寿命约为120分钟。
化合物6(3、10和30mg/kg i.v)的给药引起MAP即时、剂量相关性衰减，其启动缓慢并且出现在较高剂量，在该化合物注射后3小时达到最大。在10分钟内最大衰减约为60mm Hg。然而，该反应的起始相的持续时间较短，随后是一个血压向静止值恢复的平缓相。令人感兴趣地，化合物6没有引起心搏率明显改变。
化合物4和化合物6均使MAP快速和明显衰减。然而，在化合物4的情况中，MAP的衰减还伴随着心搏率的明显加快。虽然化合物4所产生的MAP衰减持续较长的时间，但是MAP的快速衰减和造成的心动过速对于安全性而言是不利的。
相反，化合物7(3、10和30mg/kg i.v)引起MAP渐进式衰减，其在135-165分钟后才达到其平台水平。该渐进式衰减逐步进行并且在3小时试验期结束时达到约30mm Hg的最大值。MAP的这种衰减与心动过速无关。
结论本发明化合物的心血管性能能够定义某些结构—活性关系，由此设计表现出较长的作用时间的化合物X衍生物。此外，上述化合物可以制成缓慢开始起作用，其使任何初期低血压危象的可能性最小化。比较5,000或20,000道尔顿PEG偶联的化合物的性能，虽然两种PEG的大小在MAP性能和降血压作用的时间上没有差异，但存在一种趋势，含有20,000道尔顿PEG的化合物对心搏率的作用较小。需要进一步考虑潜在的临床优越性或反射性心动过速缺失有关的问题。
比较经酰胺或酯键与PEG取代基相连的化合物的性能，表明对于酰胺键，MAP衰减的启动比用酯键观察到的更缓慢，并且没有观察到诱发反射性心动过速。
化合物2的皮下给药(30mg/kg s.c.)引起MAP大的衰减，其启动缓慢并且在该化合物注射后45分钟时达到最大。此外，化合物2引起心搏率加快。当与实施例5的化合物2的静脉内给药(30mg/kg i.v)对比时，皮下给药引起的MAP的长时间持续衰减更加明显，但启动较慢。3小时时，产生较大的数值，它大于同一化合物静脉内给药所产生的数值。值得对这种和其他化合物的皮下给药进行进一步的分析。
所述化合物8按照类似于实施例1的化合物1的方法制备。该化合物为第4组的化合物，其中Z1是分子量约为20,000道尔顿的mPEG，X是NH和Z2是乙酰基。
结果化合物4分别以1、3和10mg/kg的皮下剂量的给药引起MAP剂量相关性衰减，其还和心搏率的剂量依赖性加快有关。注射1mg/kg后，26mm Hg的MAP最大衰减出现在该化合物给药后60分钟，并且在210分钟时出现另一次28mm Hg的最大衰减。由化合物4的三种剂量分别引起的MAP衰减的有效寿命分别为＞300、＞330和＞300分钟(参见表5).
化合物X(0.1、0.3和1mg/kg s.c)的给药引起MAP的快速、剂量相关性衰减，其与心搏率的剂量依赖性加快有关。(参见表4)。皮下注射1mg/kg后，约70mm Hg的MAP最大衰减出现在该化合物给药后15分钟。当和化合物X相比，化合物4引起的MAP衰减持续时间长很多。化合物4引起的心动过速在启动时比化合物4引起的心动过速要慢很多，应注意化合物4引起的心动过速对于10mg/kg的剂量在该化合物注射后6小时仍然明显。在较低剂量下，对于1mg/kg和3mg/kg，心搏率分别在注射后约5分钟和45分钟稳定。
化合物7的给药(3、10和30mg/kg)引起MAP渐进式、进行性剂量相关性衰减，其连续衰减至注射后6小时。活性的数值比天然化合物X和化合物4低。对于3、10和30mg/kg的剂量MAP的最大衰减分别为35、29和25mm Hg。全部最大衰减是在注射后约330至360分钟出现(参见表6)。
化合物8(3、10和30mg/kg s.c.)引起MAP的缓慢剂量相关性衰减，并且在最大剂量注射后约240分钟达到约24mm Hg的最大值。有效寿命大于120分钟。(参见表7)。
表4化合物X(皮下给药)约6小时期间测量的平均动脉压(mm Hg)
表5化合物4(皮下给药)约6小时期间测量的平均动脉压(mm Hg)
表6化合物7(皮下给药)约6小时期间测量的平均动脉压(mm Hg)
表7化合物8(皮下给药)约6小时期间测量的平均动脉压(mm Hg)
实施例12mPEG350Da-酰胺-化合物X二乙酸酯此后称作“化合物9”按照下列方式制备第4组的化合物，其中Z1是分子量约350道尔顿的mPEG，X为NH和各Z2是乙酰基。
在圆底烧瓶中，将化合物X(400mg)、mPEG(350Da)胺(360mg)、HOBT(15mg)和DCC(267mg)在20ml无水二氯甲烷中混合，混合物在室温下搅拌过夜。过滤除去不溶固体，有机溶液用5％(重量)碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥，真空下除去溶剂。所得产物溶于10ml的乙腈，过滤除去不溶固体。向该溶液加入乙酸酐(3ml)和吡啶(0.3ml)。所得溶液在40℃下加热过夜。向该溶液加入300ml的5％(重量)碳酸氢钠溶液，该混合物在室温下搅拌30分钟。该混合物用二氯甲烷提取，有机相用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH2)洗涤并且用硫酸钠干燥。除去溶剂并且在真空下干燥该产物。产量为600mg(72％)。1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(br m，PEG)，7.897(t，-PEGNH-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.864(t，(化合物X)-CH3)，4.436(s，(化合物X)-CH2CONHPEG)，7.045(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族化合物)。
在圆底烧瓶中，将化合物X(3g)和三乙胺(TEA，1.5μl)在100ml无水乙腈中混合。向该溶液中加入3ml的乙酰氯。该混合物室温下搅拌过夜。此溶液与5％(重量)碳酸氢钠溶液混合，室温下搅拌30分钟。水相用二氯甲烷提取。有机相用磷酸盐缓冲液(0.1M，pH2)洗涤，随后硫酸钠干燥。产量为3.3g(80％)。1H NMR(DMSO-d6)1.91(s，(化合物X)-O1COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3).
在圆底烧瓶中，将mPEG(350Da)(550mg)、上步制得的化合物X二乙酸酯(750mg)、HOBT(60mg)、DMAP(150mg)和DCC(375mg)溶于30ml无水二氯甲烷。该溶液在室温下搅拌过夜。经过滤除去不溶性固体，用5％(重量)碳酸氢钠溶液和磷酸盐缓冲液(0.1M，pH2)洗涤该溶液。有机相用硫酸钠干燥，真空下浓缩。所得产物溶于10ml乙腈中，过滤除去不溶性固体。蒸发除去溶剂，得到的产物为澄清油。产量1g(76％)。1H NMR(DMSO-d6)δ 3.5(brm，PEG)，4.23(t，-PEGOCH2CH2O-CO-(化合物X))，1.91(s，(化合物X)-O′COCH3)，2.00(s，(化合物X)-O2COCH3)，0.84(t，(化合物X)-CH3)，4 77(s，(化合物X)-CH2COOPEG)，7.03(t，化合物X芳族质子)，6.7(d+d，化合物X芳族质子)。
上述研究评价了多种与不同分子量的基团相连的化合物X的衍生物。在那些研究中，5,000和20,000道尔顿的PEG的高分子量聚合物通过酯或酰胺键连接于天然化合物的不同区域，同时还研究了乙酰化游离羟基的效果。其全身性血液动力学性能是在静脉内快速浓注给药后的麻醉大鼠中进行研究，在后面的研究中，是在皮下快速浓注后进行。本研究评价了分子量350的PEG衍生物在静脉内或口服给药后对大鼠全身动脉血压的作用。
化合物评价本研究中所用化合物是乙酰化mPEG 350Da化合物X-酰胺(mPEG350-NHCO-化合物X-Ac)，此后称作“化合物9”，其中分子量为350道尔顿的PEG是经酰胺键与化合物X的羧基连接并且化合物X的羟基被乙酰化。
通用方法本发明的这组研究是针对上述化合物在硫喷妥麻醉大鼠中的心血管活性。在这些研究中，观察到化合物9在快速浓注静脉内和口服给药后对血压(BP)和心搏率的影响。测定启动的时间和最大反应，以及反应回归到基线值的50％所需要的时间。各化合物以单剂量给予各组的各个动物，建立剂量—反应关系，测定静脉内给药后3小时和口服给药6小时的心血管参数。
用硫喷妥钠(INTRAVAL_，120mg/kg i.p.)麻醉雄性Wistar大鼠(250-330g)。插入导管便于呼吸。将右颈动脉插导管并且和血压传感器(Spectramed P23XL)相连，用于测量平均动脉血压(MAP)和心搏率(HR)，连续记录在4道Grass 7D多种波动描记器(Grass，Mass.，USA)。在左股静脉或右颈静脉插管用于给药。试验动物的体温利用直肠探针式温度计维持在37±1℃，该温度计与恒温毯式控制单元(HarvardApparatus Ltd)相连。
15分钟稳定期后，化合物9以静脉内快速浓注给药(3、10和30mg/kg)。
静脉内给药的方法将化合物9溶于绝对乙醇得到200mg/ml的储备液，其保存在-20℃的冰箱中。在使用前即时取出储备液的试样，并且溶于盐水中。大鼠接受3、10和30mg/kg的化合物9，也就是接受0.3ml的1.5％、5％和15％的乙醇。在对照组中，大鼠接受最高浓度的乙醇，0.3ml的15％乙醇溶液。
15分钟稳定期后，化合物9(3、10和30mg/kg)以静脉内快速浓注给药。
口服给药的方法将橡胶导管置于胃内(经食道)便于口服给药。20分钟稳定期后，化合物9共计1ml的大丸剂经此导管给药。
化合物9溶于绝对乙醇中得到200mg/ml的储备液中，将其保存在-20℃的冰箱内。在使用之前即时取出储备液的试样，并且溶于盐水中。接受30mg/kg化合物9的大鼠也就是接受1.0ml的15％乙醇。在对照组中，大鼠接受1ml的15％乙醇溶液。
本研究是在未禁食动物中进行，它们在餐后胃内含有食物，或研究之前15小时未进食的大鼠。
静脉内给药的结果在麻醉大鼠中，静脉内注射化合物9(3、10和30mg/kg i.v.)引起MAP快速剂量依赖性衰减(参见表8A)，但对心搏率的影响不显著。采用最大剂量，这种降血压反应在15分钟内达到其峰值，而且具有较长的作用时间，同时有效寿命至少为120分钟。应注意，较高剂量的化合物9可以引起心搏率暂时性衰减(参见表8B)。
表8A化合物9的静脉内给药的剂量反应(平均动脉压，mm Hg)
表8B化合物9的静脉内给药的剂量反应(心搏率)
口服给药的结果在麻醉大鼠中，化合物9(30mg/kg)对进食或饥饿大鼠的口服给药均引起MAP衰减，该衰减启动缓慢，进行性衰减并且长时间作用(参见表9A)。MAP的衰减在120分钟后达到其峰值，并且在6小时的观察期结束时MAP始终被抑制。在观察期6小时结束时观察到约33mmHg的MAP最大衰减。然而应注意，含有乙醇载体(0.3ml 15％乙醇)也引起MAP小的、渐进式衰减，其启动缓慢并且在6小时后达到20mmHg的最大值(参见表9A)。对化合物9的血管减压反应在进食或饥饿大鼠之间没有差异。
乙醇载体引起心搏率进行性衰减(参见表9B)，这种衰减比试验药物本身引起的任何心搏率衰减都更加显著(参见表9B)。
表9A对化合物9的口服给药的反应(平均动脉压，mm Hg)
表9B对化合物9的口服给药的反应(心搏率)
结论这些在大鼠中化合物9的静脉内给药的发现表明，该分子具有快速启动的作用和长时间的效应。然而，虽然分子量低10倍，但化合物9作为降血压药的效价可以和早期研究报导的mPEG 5kDa-酰胺化合物X(化合物1)的相比。其原因不很清楚，但可以反映出向活性物质的缓慢转化。这种可能性难以用PEG衍生物的现有知识作出解释，但可代表酰胺键的酶促水解的重要特征，以及去除保护性的乙酰基成为羟基。低分子量PEG可以比更刚性更高分子大小的PEG基团受到更少约束，并且不会使化合物X上的酰胺键充分暴露，令该分子不易被攻击并且释放出活性物质。不同大小取代基如何影响化合物X的苯并茚化学主链上静电荷的分布仍不清楚，但这也可以调控PEG类似物的水解速率或随后释放游离天然化合物X的速率，假设游离天然化合物X是诱发降血压反应的活性物质。
经酰胺键连接5,000道尔顿或20,000道尔顿PEG的二乙酰化化合物，其静脉内给药的早先研究显示，乙酰化作用导致该分子产生小的MAP渐进式衰减，同时恢复速率缓慢。MAP的渐进式衰减与反射性心动过速无关。相反，在本发明研究中，化合物9具有快速启动的作用，并且和心搏率的初始衰减有关。因此，在通过酯基或酰胺基相连的分子量为5,000或20,000道尔顿的PEG中经乙酰化保护的羟基，不调控低分子量化合物中活性物质的释放。这是否也适用于低分子量乙酰化酯类衍生物还有待于进一步研究。但是，这对于未连接PEG的化合物X的乙酰化形式同样产生快速启动的作用具有重要意义。这表明，这种在肠胃外给药后减弱作用的快速启动的化学途径只有大于350道尔顿的PEG衍生物才能实现。
口服给药后，虽然衰减的大小在载体(含有乙醇作为溶剂用于溶解所提供的油)所引起的小的MAP渐进式衰减的作用下难以辨认，但最高剂量的化合物9的确产生了MAP渐进式衰减。由于这种作用的数值，没有再研究更低剂量。然而，比较禁食和进食大鼠中的这种血压降低作用，数据表明在这两种条件下生物利用度相当。由于化合物9在静脉内给药和口服给药后的血压性能的差异性，这些研究中难于测定出