专利名称：雪松疫霉的分子检测方法及其引物的制作方法雪松疫霉根腐病菌、Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)引起雪松根部腐烂病。该病害1920年在美国华盛顿西雅图里首次发现。目前该病菌广泛分布于世界各地(Smith I Μ. Phytophthora lateralisEPPO Bulletin, 2009. 39(1) 43-47. )0 该病害于2010年在我国台湾省首次报道(Brasier C M, Vettraino A M, Chang T T, et al. Phytophthora lateralis discovered in an old growth Chamaecyparis forest in Taiwan [J], Plant Pathology, 2010， 59(4): 595-603)，大陆地区尚未发现，是一类危险性植物检疫性病害。雪松疫霉根腐病菌不仅危害雪松，还可以侵染美国扁柏、短叶红豆杉、美国尖叶扁柏、猕猴桃、扁柏、杜松、侧柏、杜鹃花属植物(James W, Claire S. Pest Risk Analysis For Phytophthora lateralis [Z].2006.)。该病害诊断困难，按常规方法分离会产生很多杂菌，影响病原菌的准确分离。 同时，疫霉形态特征复杂，变异快，且A hterahi与其它病原菌如A cinnamomi、P. gonapodyides %%iX/rf ^(Torgeson D C, Young R A, Milbrath J A. Phytophthora root rot diseases of Lawson cypress and other ornamentals[M]. Agricultural Experiment Station, Oregon State College, 1954)。因此，常规的病害诊断技术难以快速准确鉴定该病原菌。随着分子生物学技术的发展，国内外对很多疫霉的分子检测进行了不少研究。现已证明，由于tRNA序列在真菌(卵菌)种间高度变异、而在种内稳定，因此该序列为病原菌的分子检测提供了理想的靶序列。
本发明所要解决的技术问题是提供一种雪松疫霉的分子检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测雪松疫霉，速度快、准确、灵敏度高、稳定可靠。本发明提供的技术方案是一种用于检测雪松疫霉的引物，其上游引物序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。一种检测雪松疫霉的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物。一种利用上述引物检测雪松疫霉的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为 192bp的DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。上述的检测雪松疫霉的方法，进一步地，所述PCR反应的扩增体系为10.0 μ L SYBR Premix Ex TaqTM(2Χ) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L) 各0.4 yL，模板2 μ L，用灭菌水补足体积至20 μ L0所述的检测雪松疫霉的方法，所述PCR反应的反应程序为94° C预变性30 s ；94° C 变性 5 s, 46° C 退火 34 s，40 个循环；95° C 15 s，60° C 1 min, 95° C 15 s, 60° C 15 s。进一步地，为提高检测雪松疫霉的灵敏度，本发明还提供另一种用于检测雪松疫霉的引物，包括两对引物，即第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。本发明还提供另一种检测雪松疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。本发明还提供另一种检测雪松疫霉的方法，其过程是提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的 DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为192bp的 DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。本发明具有以下有益效果本文通过设计一对特异性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的A lateralis。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于出入境植物和植物产品的检验检疫和田间调查，对控制雪松疫霉传入我国具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其它病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。本发明对从GenBank中得到A lateralis和其它疫霉种的tRNA序列进行分析， 设计了一对特异性引物T1/T2 (核苷酸序列如SEQ ID No. 1/SEQ ID No. 2)，利用该引物对其它15种疫霉和其它真菌进行特异性扩增，发现只能从A lateralis中扩增得到一条 192 bp的条带，其它菌株均无扩增条带出现，表明该对引物具有种的特异性。以真菌的 rDNA-ITS序列设计特异性引物来进行病害的诊断和植物病原真菌的分子检测，得到广泛应用，曾有学者利用rDNA-ITS序列的差异设计了 A lateralis的特异性引物(Winton L Μ, Hansen E Μ. Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees, water, and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction[J]. Forest Pathology, 2001，31 (5) : 275-283)，但是A lateralis与P.應的ITS序列高度相似，无法将两者区分(Martin F N，Tooley P W. Phylogenetic relationships of Phytophthora ramorum, P. nemorosa, and P. pseudosyringae, three species recovered from areas in California with sudden oak death[J]. Mycological Research, 2003， 107(12): 1379-1391)。而本发明使用这对引物则可较容易将二者区分开来。高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否把PCR快速检测技术直接应用在出入境植物和植物产品的检验检疫中。在25 μ L反应体系中，普通的PCR方法能检测到10 pg P. lateralis基因组DNA。曾经报道套式PCR能把检测灵敏度提高l(Tl 000倍 (Zhang ZG, Li Y Q, Fan H, et al. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water[J]. Plant Pathology, 2006, 55 (6): 770-775 ；Ippolito A, Schena L, Nigro F. Detection of Phytophthora nicotianae and P. citrophthora in citrus roots and soils by nested PCR[J]. European Journal ofPlant Pathology, 2002. 108(9) 855-868)，而在本发明建立的体系中采用套式PCR技术将检测A hterWis基因组DNA的灵敏度提高到了 1 fg，效率提高了 10，000倍，这对于靶标病原物的量非常低或存在PCR抑制物时非常重要。而在其它疫霉的分子检测中，灵敏度只能到 Ipg 的 A ca^sici 基因组 DNA、10 pg 的 A uicotianaH P. citrophthora 基因组DNA和2. 5 pg的A flicoiia/^e基因组DNA，这表明本发明的引物具有很高的灵敏度。游动孢子能通过灌溉水传播和侵染寄主，因此是分子检测的另一个重要对象。在本发明建立的体系中，检测A lateralis的灵敏度达到了 0. 5个游动孢子。该体系的高灵敏度表明，这种方法可以用于发病植物中病原物的分子检测，能达到检验检疫的目的和要求。对发病植株进行检测时，结合简单的DNA提取方法使用特异引物T1/T2进行PCR扩增， 1个工作日就可以判断植物是否被A lateralis侵染。使用NaOH裂解法可以在30 min 之内即可得到病组织中病原菌的DNA用于PCR扩增，而使用传统的方法检测至少需要2周。致病植物中病原菌的精确定量对制定防治策略及防治时机极为重要，为此本发明建立了A hterahi的实时定量PCR检测体系，这对雪松疫霉根腐病的实时监测和制定防治策略有重要的指导意义。优化后的PCR体系和程序避免了因为非特异性扩增及引物二聚体等因素造成的非特异性扩增，提高了检测的准确性。图1基于雪松疫霉(Phytophthora htera^s) tRNA序列设计的一对特异性引物 T1/T2
图2引物T1/T2的特异性验证，M 2000 bp marker ；泳道1 一 43 表1中的所有菌株 (顺序从上至下)；泳道44 阴性对照。图3A常规PCR对雪松疫霉if. lateralis)的灵敏度检测，M 2000 bp marker ； 泳道 1 一 11 模板浓度分别为 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg, 100 ag, 10 ag和1 ag基因组DNA的PCR扩增产物；泳道12 阳性对照。图3B套式PCR对雪松疫霉iP. lateralis)的灵敏度检测，M 2000 bp marker ； 泳道 1 — 11 模板浓度分别为 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg, 100 ag和10 ag基因组DNA的PCR扩增产物；泳道12 阴性对照。图4雪松疫霉(P. lateralis)接种植株中游动孢子DNA的灵敏度检测。M 2000 bp marker ；泳道 1 — 11 模板分别为 0. 5，1，2，3，4，5，6，7，8，9 and 10个游动孢子基因组DNA ；泳道12 阴性对照。图5发病植株中雪松疫霉(P. lateralis)的PCR检测，M 2000 bp marker ；泳道1 一 6 以发病植株粗提DNA为模板的PCR扩增产物；泳道7 健康植株对照；泳道8 阳性对照。图6荧光定量分析标准曲线。

的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。实施例1 设计、合成引物并建立雪松疫霉检测试盒的PCR反应体系一、引物设计与合成
特异性引T1/T2的设计对GeneBank中的P. lateralis和其它疫霉中的tRNA序列进行比较分析(图1)，设计了一对特异性引物T1/T2，序列如下 Tl :5，- GCTTTATATATTTATTAGAT -3，(SEQ ID NO. 1)
禾口 T2:5，- CTCCTTTTTTGATATTAT -3，(SEQ ID NO. 2)。设计的引物重新在 GeneBank 中BLAST分析验证其特异性。同时还设计一对套式PCR外引物T3/T4，根据A lateralis的tRNA序列，使此引物在特异性引物外侧，设计一对外引物T3/T4，序列如下
T3 :5，- GTTCGAATCCCTTTTTTTGC -3，(SEQ ID NO. 3) T4 :5，- CAACAAATTTACAGTCTGCCGC -3，(SEQ ID NO. 4)。所有引物委托上海英俊(Invitrogen)生物公司合成。二、建立常规PCR反应体系
常规 PCR 扩增体系为10 X PCR buffer 2.5 μ L, MgCl2 2 mmol /L，2. 5 mmol/L dNTP 0. 5 μ L，引物(20ymol/L) 0.25 μ L,Taq DNA 酶(5U/μ L) 0. 25 μ L，模板 0· 25 μ L, 扩增体系为25 μ L，用灭菌水补足体积。在TaKaRa PCR扩增仪上进行扩增反应，反应程序为94° C预变性5min;94° C变性30 s，46° C退火30 s，72° C延伸30 s，共35个循环；72° C延伸10 min。取5 μ L扩增产物于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为192 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。三、建立套式PCR反应体系
为提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以T3/T4为第一轮反应引物，反应体系上述常规PCR体系。反应程序中退火温度为60° C，其他参数同上述常规PCR反应程序。然后以T1/T2为特异性引物，以第一轮PCR产物(1 μ L)为模板进行第二轮PCR扩增。体系同上，退火温度为46° C，其它参数不变。所有试剂均购于TaKaRa公司。取5 μ L扩增产物于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳(电压5 V/cm)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为192 bp的DNA条带，则证明所检样品中含有雪松疫霉。四、荧光定量PCR反应
本发明进一步建立了实时定量PCR检测体系。荧光定量PCR扩增体系为10.0 UL SYBR Premix Ex Taq (2X) ,0. 4 μ L ROX Reference Dye II(50X)，引物(10 μ mol/L) 各0.4 yL，模板2 yL，扩增体系为20 μ L，用灭菌水补足体积。优化后的反应程序为 94° C 预变性 30 s ；94° C 变性 5 s，46° C 退火 34 s，40 个循环；95° C 15 s，60° C 1 min，95° C 15 s，60° C 15 s。荧光定量 PCR 仪器为 7500 Real-Time PCR System。
实施例2 制备DNA模板
提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下 1.菌丝体的培养、收集及DNA提取 (1)培养基的制备
10% V8培养基100 mL V8汁，CaCO3 0. 2 g,加水定容至1 L。
PDA 培养基(Potato Dextrose Agar)琼脂粉 20 g, 土豆 200 g,葡萄糖 20 g, 加水定容至1 L。(2)菌丝体培养与收集
将供试疫霉转至V8固体培养基平板上，20° C黑暗培养3 d后从菌落边缘切取10块 2 mmX2 mm菌落块，转至V8液体培养基，25° C振荡培养5_7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成粉，-20° C保存备用。(2)菌丝DNA的提取
取少量菌丝粉，加900 μ L 2% CTAB提取液和90 μ L 10% SDS，漩涡混勻，于55° C水浴1 h，期间每10 min上下颠倒几次。12，000 g离心10 min，取上清加等体积酚/氯仿/ 异戊醇(25:24:1)，颠倒混勻，12，000 g离心10 min，将上清液移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12，000 g离心5 min。上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10 体积的 3 mol/L NaAc (pH 5. 2),-20° C 沉淀(>1 h)。12,000 g 离心 10 min，倾去上清， 沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE (pH8.0)溶解沉淀(含20 μ g /mL RNase)，37° C 处理 Ih 后，-20° C 保存备用。2.游动孢子液DNA的提取
^ M 7Jn Tj (Zheng X B. Phytophthora and methods in phytophthora^Xn Chinese) [M]· Beijing: China Agriculture Press (中国农业科学)，1997.)诱导 A lateralis释放游动孢子。游动孢子DNA粗提方法在60 μ L无菌水中加入60个游动孢子(显微镜下直接计数)，加0.05 g石英砂，在涡旋器上剧烈振荡3 min，稍离心，上清液即为游动孢子DNA粗提液，分别取0.5-10 μ L上清液直接作为模板进行PCR扩增。3.发病植物组织DNA的提取
将供试疫霉转至V8固体平板上，20° C黑暗培养3 d后从菌落边缘切取3块2 mmX 2 mm菌落块，创伤接种于美国扁柏上。20° C黑暗保湿培养，一段时间后切取发病组织提取基因组DNA。具体操作取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 μ L 0.5 mol /L NaOH, 在研钵中充分研磨后转移至1. 5 !1^的印 611(10什管中，12，000 g离心5 min，取5 μ L上清液加入495 μ L 0. 1 mmol /L Tris ( pH 8.0)，混勻后取1 μ L直接用于PCR反应。下面用上述实施例1检测引物及方法和实施例2制备的模板进行雪松疫霉的检测。实施例3 检测引物的特异性和灵敏度一、特异性检测
本发明所用菌株及相关信息见表1。采用本发明所设计的特异性引物Τ1/Τ2对表1中所有供试菌株基因组DNA进行PCR扩增，仅能从2个供试的A lateralis菌株中特异地扩增出一条192 bp的条带，而其它供试菌株及空白对照均无扩增条带(表1，图2)。表明该引物具有种的特异性，可以将A lateralis与其它近似种及其它相关种区分开。表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株


本发明公开了一种雪松疫霉的分子检测方法及其引物，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的检测雪松疫霉的分子检测技术。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于出入境植物和植物产品的检验检疫和田间调查，对控制雪松疫霉传入我国具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其它病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。