专利名称：一种鉴定辣椒疫霉CesA3基因核苷酸点突变及其对CAA类杀菌剂抗药性的方法辣椒疫病是一种世界性的重要病害，该病于1918年首次在美国被发现，现已遍及世界各地的辣椒种植区。辣椒疫病的病原是辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian), 为二倍体、丝状、异宗配合的卵菌。辣椒疫霉的寄主范围很广，可侵染茄科、葫芦科、豆科及松科50多种植物。世界五大洲均有辣椒疫霉引起植物病害发生的报道。辣椒疫霉可以危害辣椒的根、茎、叶和果实等部位。由于辣椒疫病是多循环的病害，在一个生长季可以发生多次接种体的产生和侵染循环，因此在气候条件适宜的情况下，短期内就可暴发，蔓延速度极快，使辣椒生产遭受严重的经济损失。并且随着病害的扩展蔓延和研究工作的深入，越来越多的地区发现辣椒疫霉的分布，并且其两种交配型在多数地区同时存在。有性生殖的发生使得田间辣椒疫霉菌株的遗传多样性越来越丰富，给病害的防治带来很多困难。虽然根据辣椒疫霉引起植物病害的发生流行特点，控制水分和湿度可以有效降低病害的严重度，然而在特定的地理环境和土壤条件下，农业防治措施不一定能够及时实施并有效控制辣椒疫霉引起的病害的发生，所以化学防治仍然是防治辣椒疫霉引起的植物病害的最重要措施。但是专门用于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，最具有代表性的是以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，是第一代专门用于防治卵菌病害的一大类重要的内吸性杀菌剂。然而，随着该类杀菌剂的广泛使用，有关甲霜灵类杀菌剂的抗性报道越来越多,抗性群体在田间所占的比例越来越高,并导致对苯酰胺类杀菌剂的抗性成为辣椒疫霉化学防治中最主要的问题。在此背景下另外一大类可用于辣椒疫霉引起病害的内吸性高效杀菌剂一羧酸酰胺类杀菌剂(CAA类杀菌剂)应运而生，并成为生产上防治疫病和霜霉病的主要杀菌剂类别，主要包括烯酰吗啉(dimethomorph)、氟吗啉(fIumorph)、异丙菌胺(iprovalicarb)和双块酸菌胺(mandipropamid)等(FRAC 网站，http://www. frac. info/frac/index. htm)。CAA类杀菌剂作用机制的研究结果表明，与纤维素合成相关的蛋白酶cesA3是CAA类杀菌剂的作用靶标(朱书生等，2007 ；Blum et al.，2010)。辣椒疫霉对CAAs杀菌剂的抗性机制目前还未明确，明确其具体的抗性基因及抗性检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展动态，制定合理的病害管理方案，延缓抗药性的产生。虽然从20世纪90年代末开始使用CAA类杀菌剂防治辣椒疫霉，但田间抗药性菌株发现的报道很少。然而在室内条件下通过自然培养获得了对CAA类杀菌剂产生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存适合度较高，推测随着CAA类杀菌剂在防治辣椒疫霉中的大量使用，田间有可能产生抗性菌株，并带来较高的抗性风险。植物病原菌抗药性检测方法包括普通生物学方法和分子生物学方法。普通生物学方法需要通过测定药剂对病原菌的EC5tl来比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在1%以上才能被检测到。而分子生物学方法，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10_5 10_4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。
本发明的一个目的是提供一种检 测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤以待测辣椒疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为302bp的片段，则所述待测辣椒疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；所述突变位点指辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3450位核苷酸为C。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3450位核苷酸也就是SEQ ID NO 4中自5’末端起第3450位核苷酸。上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为66°C。本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子组成。本发明的另一个目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突变位点。本发明所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3450位核苷酸为C。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3450位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第3450位核苷酸。本发明所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1105位氨基酸为丙氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1105位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自5’末端起第1105位氨基酸。上述任一所述突变位点在鉴定辣椒疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗CAA类杀菌剂。所述CAA类杀菌剂为异丙菌胺、烯酰吗啉、氟吗啉和/或及双炔酰菌胺。上述应用中，存在所述突变位点的辣椒疫霉具有或候选具有抗药性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也属于本发明的保护范围。本发明提供的检测辣椒疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间辣椒疫霉对CAA类杀菌剂的抗性发生发展动态，及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。图I为抗CAA类杀菌剂的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比较发现与抗性相关的一个突变位点。PCASl、PCAS2、nml3、PG13和SY12为敏感菌株，R1_1、R1_2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4 和 R2-5 为抗性菌株。图2为采用不同AS-PCR引物进行温度梯度PCR扩增电泳图。S :敏感菌株；R :抗性菌株；从上到下反向引物依次为PC05AR、PC05BR、PC05CR及PC05DR，正向引物均为PC05F1。图3为采用特异性引物PC05F1和PCR05BR扩增对CAA类杀菌剂敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。M DNA Marker ；PCASK PCAS2、nml3、PG13 及 SY12 为敏感菌株；R1_1、R1-4、Rl-8、R2-1和R2-5为抗性菌株；NC为空白对照。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。文中“抗性菌株”均指对CAA类杀菌剂抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指对CAA类杀菌剂敏感的辣椒疫霉菌。其中，CAA类杀菌剂可为烯酰吗啉、氟吗啉、异丙菌胺及双炔酰菌胺。下述实施例中使用的辣椒疫霉菌株为抗性菌株Rl-1、Rl-2、Rl-3、Rl_4、R1-5、Rl-7、Rl-8、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4 及 R2-5 ;敏感菌株 PCASl、PCAS2、nml3、PG13 和SY12。上述菌株在文献“Lu, X. H.，Zhu, S. S.，Bi, Y.，et al. (2010).Baselinesensitivity and resistance—risk assessment of Phytophthora capsici toiprovalicarb. Phytopathology, 100 (11) : 1162-1168. ” 中公开过，公众可从中国农业大学获得。上述菌株nml3采自中国内蒙古自治区，PG13和SY12均采自中国北京，其他菌株来源见上述文献，经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为辣椒疫霉。上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行抗药性验证。实施例I、辣椒疫霉中CesA3基因和CesA3蛋白突变位点的发现I、菌株抗性菌株为 Rl-1、Rl-2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4及 R2-5，敏感菌株为 PCASl、PCAS2、nml3、PG13 和 SY12。2、方法I)模板分别以抗性菌株和敏感菌株的基因组DNA为模板。2)纤维素合酶CesA3基因的PCR扩增引物C3F1(5，-TTACTTACCGTACTCCGATCGCACG-3，)C3R1 (5，-GCATGAACTCCAAACACAACAACAGC-3，)；目的片段长度小于2kb的PCR反应采用Promega公司试剂，25 μ L反应体系中包括I μ L 模板 DNA(30-50ng)，0. 5μ LlOmM dNTP, 2. 5 μ LlO X 扩增缓冲液(含 20mM Mg2+), 0. 3μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，每条引物(10 μ Μ)0. 3 μ L，20. IyL ddH20，反应体系根据后续试验需要进行成倍增减。反应程序为预变性94°C IOmin ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，35个循环；最后72°C下延伸lOmin。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳检测。
目的片段长度大于2kb的PCR反应采用高保真酶(High-FidelityDNAPolymerase, New England Biolabs Inc.)进行 PCR 反应。20 μ L 反应体系中包括 IyL模板 DNA，O. 4 μ LlOmM dNTP，4 μ L5 X 扩增缓冲液，O. 2 μ L Pfu DNA 聚合酶(2U/μ L)，每条引物(ΙΟμΜ) μ ，12.4μ ddH20，反应体系根据后续试验需要进行成倍增减。反应程序为预变性980C 3min ；98°C 15s，72。。3min，35个循环；最后72°C下延伸IOmin0扩增产物在O. 8%的琼脂糖凝胶中电泳检测。扩增产物在O. 8%的琼脂糖凝胶中电泳检测。3)测序将PCR产物进行测序。以基因组DNA为模板时，抗性菌株的纤维素合酶CesA3基因全长共3559bp，序列如SEQ ID NO :4所示，其中包含136bp的内含子序列；cDNA编码1140个氨基酸，蛋白序列如SEQ ID NO: 3所示。4)序列比对 分别将抗性菌株Rl-U Rl-2、Rl-3、Rl-5、Rl-7、Rl-9、R2-1、R2-2、R2-3、R2-4、R2-5，与敏感菌株PCASl、PCAS2、nml3、PG13和SY12的纤维素合酶CesA3基因全长进行测序。通过DANMAN软件分析序列结果，发现存在如下突变位点与敏感菌株相比，抗性菌株中基因组基因CesA3自5’末端起在DNA序列的3450位核苷酸由G突变为C，对应基因CesA3的cDNA序列的3314位。该位点碱基突变导致氨基酸序列在1105位发生突变，由甘氨酸(Gly，G)突变为丙氨酸(Ala, A)(图I)。PCR产物测序结果表明，抗性菌株在3450位都发生突变并由G突变为C，分析测序的峰线图，可发现该位点峰线图清晰单一明确，表明该位点的突变为纯合突变。因此，该位点的突变与辣椒疫霉对CAA类杀菌剂产生抗性相关(图I)。实施例2、检测辣椒疫霉中突变位点的方法一、引物设计菌株为实施例I中所用菌株PCASl和R2-5。根据突变体cesA3基因的序列设计allele specif ic-PCR引物，正向引物为PC05F1，反向引物PCR05AR的3’ -端最后一个碱基与突变后的碱基互补(表I)。为了增加引物的特异性，在反向引物3’ -端第二个碱基引入错配碱基(表1，引物PCR05BR、PCR05CR和 PCR05DR)。引物如表I.表I纤维素合酶cesA3基因克隆及抗药性检测引物。


本发明涉及辣椒疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在CAAs杀菌剂抗性监测中的应用，具体公开了一种鉴定辣椒疫霉对CAAs杀菌剂抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。该引物对，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示DNA分子组成。本发明提供的检测辣椒疫霉对CAA类杀菌剂产生抗药性的点突变的方法，具有高灵敏度、简单快速、稳定性好的特点，可以用于快速、灵敏地检测田间辣椒疫霉对CAA类杀菌剂的抗性发生发展动态，对于抗性病害的早期预警，指导及时调整病害防治策略，有效控制抗药性病害发展具有重要意义。