专利名称：一种简便的瓜类疫霉快速分离培养基的制作方法疫霉菌导致的植物病害对寄主植物的破坏性强、危害性大，传播与蔓延迅速，弓丨起的病害大多难以控制，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，导致农业生产的严重损失。因此由疫霉菌所致的植物病害通常称为“疫病”。例如马铃薯晚疫病从1835年第一次在北美洲流行，随后1845年在欧洲不断发生，1847年在爱尔兰曾因该病的大发生使马铃薯几近绝产，导致历史上著名的大饥馑，近百万人饿死，200多万人移民他乡。由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)导致的大豆疫病是危害极为严重的大豆病害之一，在环境条件适宜的情况下可导致感病类型的大豆绝产。恶疫霉(P.cactorum)为一同宗配合疫霉种，是导致我国梨、苹果、人參、草莓等多种植物疫病的主要病原菌。辣椒疫霉(P. capsici)可侵染辣椒、番茄、黄瓜、西瓜、南瓜和西葫芦等8科19种主要蔬菜和作物。由瓜类疫霉(P.melonis)引起的黄瓜疫病，可造成黄瓜大面积死亡，是影响黄瓜生产的重要因素之一。该病原菌除为害黄瓜外，还可侵染丝瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、葫芦、菜瓜、瓠瓜、甜瓜、白兰瓜、哈密瓜、苦瓜、越瓜等葫芦科作物，是近10多年来为害瓜类的重要病害。为了对疫霉进行相关研究，以及调查病原菌的田间发病情况，筛选高效的药剂，最终达到有效防治该病害的目的，分离获得纯化的疫霉是必要的前提条件。常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75%こ醇和0. I %升汞液表面消毒处理。实际工作中，从田间采集到的样本除被疫霉侵染外，不可避免的常常带有铼刀菌，立枯丝核菌和腐霉等其他非目标真菌和细菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些非目标真菌或细菌的污染，造成目标菌分离率低或难于分离到目标菌。因此，利用普通培养基从病组织上或土壌中分离疫霉吋，达不到分离纯化的目的。
本发明的ー个目的是提供ー种杀菌剂组合。本发明所提供的杀菌剂组合，其活性成分如下述I)、2)所示I)、由咯菌臆、恶霉灵、五氯硝基苯、利福平组成；2)、由咪鲜胺、恶霉灵、五氯硝基苯、利福平组成；上述杀菌剂中，所述I)中，所述咯菌臆、恶霉灵、五氯硝基苯和利福平的质量份数比为(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具体为 10 50 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100 ；所述2)中，所述咪鲜胺、恶霉灵、五氯硝基苯和利福平的质量份数比为(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具体为 10 50 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100 ；、本发明的另ー个目的是提供ー种用于分离疫霉属病原菌(Phytophthora spp.)的培养基。 本发明所提供的用于分离疫霉(Phytophthora spp.)的培养基,为如下I或II所示I、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述I)所示杀菌剂得到的；II、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述2)所示杀菌剂得到的；上述培养基中，所述I所示培养基中，所述咯菌腈在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述恶霉灵在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL>70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述培养基中，所述II所示培养基中，所述咪鲜胺在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL>70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述培养基在分离疫霉(Phytophthora spp.)中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的分离疫霉(Phytophthora spp.)的方法,包括如下步骤用上述任一所述培养基进行分离，用于分离的样本为感染疫霉(Phytophthora spp.)的植物的根茎或土壌。实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离疫霉，可解决疫霉分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。本发明为进行田间一次性分离以及室内纯化疫霉提供技术支持。本发明选择培养基可用于简便、快捷地从病株组织上或病田土壤中一次性分离辣椒疫霉、瓜类疫霉等疫霉病原菌以及室内纯化疫霉菌株。

图I为三种抗生素对植株根茎表面细菌的抑制作用。图2为三种抗生素对土壤中细菌的抑制作用。图3为黄瓜疫霉的发病情况和疫霉分离情况。A为为田间瓜类疫霉引起植株发病；B为瓜类疫霉侵染引起黄瓜果实发病；C为田间瓜类疫霉侵染导致黄瓜根茎部发病山为病样中分离到的瓜类疫霉。

咯菌腈原药 购自武汉福德化工有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是4_(2，2_ ニ氣-I, 3_苯并ニ氧戍环_4_基)卩比略-3_臆,分子式C12H6F2N202。该药中略菌腈的质量百分含量为96%。咪鲜胺(又叫“咪酰胺”)原药购自海南カ智生物工程有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是N-丙基-N-[2-(2，4，6-三氯苯氧基)こ基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。该药中咪鲜胺的质量百分含量为97%。恶霉灵原药购自山东潍坊天达植保有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是3-羟基-5-甲基异恶唑，通用名称为恶霉灵，分子式C4H5N02。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为98%。五氯硝基苯原药购自山西三立化工有限公司(原山西省临汾有机化工厂)，其主要活性成分物质的化学名称是五氯硝基苯，通用名称为五氯硝基苯，分子式C6C15N02。该药中五氯硝基苯的质量百分含量为95%。青霉素、利福平、氯霉素均购自北京拓英坊科技有限公司。实施例I、四种真菌抑制剂和三种抗生素对瓜类疫霉的抑制作用一、四种真囷抑制剂对瓜果疫霉的抑制作用以丙酮或甲醇为咪鲜胺、咯菌臆、恶霉灵和五氯硝基苯的溶剂，分别配制5000 μ g/mL的四种药剂母液IOml ;其中，将咪鲜胺、咯菌腈和五氯硝基苯这三种真菌抑制剂的母液分别配制系列浓度为50 μ g/mL、20 μ g/mL和10 μ g/mL的含药PDA平板；将恶霉灵这种腐霉抑制剂的母液分别配制系列浓度为100 μ g/mL、70 μ g/mL和50 μ g/mL的含药PDA平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法測定瓜类疫霉对咪鲜胺、咯菌臆、恶霉灵和五氯硝基苯的敏感性。将供试的瓜类疫霉菌株在PDA平板上于25°C预培养3d，用直径为5_的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有四种药剂系列浓度的PDA含药平板中央(各浓度含等量有机溶剤)，于25°C下黑暗培养，4-5d后用十字交叉法測量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率)，抑制率)=[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/ (对照菌落增长直径)]X 100。測定了供试的四种真菌抑制剂对瓜类疫霉的抑制作用，结果如表I所示，不同浓度的五氯硝基苯对瓜类疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的五氯硝基苯作为选择性药剂；50μ g/mL咯菌腈和咪鲜胺对瓜类疫霉的抑制率均大于10%，10-20 μ g/mL浓度的咯菌腈和咪鲜胺对瓜类疫霉抑制率较低，所以可以采用10-20 μ g/mL的咪鲜胺为分离疫霉中使用的选择性药剂。不同浓度的恶霉灵对瓜类疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用50-100 μ g/mL的恶霉灵作为选择性药剂；；表I四种真菌抑制剂对瓜类疫霉的抑制作用
ニ、三种抗生素对瓜类疫霉的抑制作用用灭菌水将上述三种抗生素均配制成5Χ104μ g/mL的母液，使用三种母液分别配制成浓度为100 μ g/mL>50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以加有无菌水的平板为对照。然后采用菌丝生长速率法測定瓜类疫霉对这三种抗生素的敏感性。将供试的瓜果瓜类疫霉在PDA平板上于25°C预培养3d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含药剂系列浓度的PDA含药平板中央，于25°C下黑暗培养，4-5d后用十字交叉法測量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(％)=[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/ (对照菌落增长直径)]X 100。同时测定了不同浓度的三种抗生素对瓜类疫霉的抑制作用，结果见表2，浓度为100和50 μ g/mL的青霉素、利福平和氯霉素对瓜类疫霉均没有明显的抑制作用。因此，可以在分离瓜果腐霉时使用100 μ g/mL或是50 μ g/mL浓度的青霉素、利福平和氯霉素作为分离纯化瓜类疫霉选择性培养基中的抗生素成份。并进ー步测定三种抗生素对环境中带菌土壌和黄瓜根茎组织上携帯的细菌的抑制作用。表2三种抗生素对瓜类疫霉的抑制作用
抑制率(％)
菌株青霉素 「利福平「氯霉素------
IOOppm 50ppm IOOppm 5 Oppm IOOppm 5 Oppm
—瓜类疫霉 L 2.2 J_1.6 I 3.5 I 1.2__1.8 J_-1.1 _实施例2、三种抗生素对环境中细菌的抑制作用供试植株将感病黄瓜品种长春密刺栽培于Φ 15cm,高12cm的育苗钵内，置于中国农业大学科学园辣椒试验田培养，植株长到4-5叶期后随即采集根茎部，用于菌悬液的制备。供试土壤于2009年从天津市西青区瓜类疫病发生严重地区采集土样，备用。试验方法此试验是在实施例I结果的基础上检测所选择的三种浓度抗生素是否可有效抑制环境中的细菌。对于环境中细菌的检测，主要针对来自植株茎基部以及发病土壤中的细菌，这是根据瓜类疫霉的分离部位主要是发病的茎基部以及带病土壤决定的，本实验采用的是黄瓜茎基部以及疫病发生比较严重的天津市西青区田间的土样。首先，采30棵黄瓜幼苗的根茎部，剪碎后采用四分法将样本随机分成4份，取出其中I份放入25ml离心管中，加入15ml灭菌水，200r/min振荡2分钟，过滤取滤液，使用无菌水稀释100X，分别取100 μ I涂布在分别含有100 μ g/mL、50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以不含药平板为对照，每处理3个重复，2d后观察其对细菌的抑制作用；然后从瓜类疫病发病严重的天津市河西区和西青区田间取土样，称取5g,放入烧杯中加入20ml灭菌水,200r/min振荡20min，取上清100 μ I分别涂布在含有100 μ g/mL,50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以不含药平板为对照，每处理3个重复，2天后观察其对细菌的作用。选择对细菌具有明显抑制作用的抗生素浓度。本研究在表2结果的基础之上，分别测定了初步选择可用的三种抗生素对幼苗茎基部和土壌中细菌的抑制作用，两个研究的结果一致。从图I和图2看出，氯霉素抑菌活性差，在其浓度达到100μ g/mL时，与对照相比，抑菌效果不明显。青霉素、利福平的抑菌活性较强，可以达到抑菌的作用。由于环境中细菌种类的多祥性，青霉素主要对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，所以平板中有少许零星革兰氏阴性菌菌落。而对于利福平，平板中只有少许真菌菌落。因此，利福平对幼苗根茎部和土壤中的细菌具有广谱的抑菌作用。综上所述，本发明筛选药剂的原则是对瓜类疫霉抑制率小于10%的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以看出，应用于从田间一次性分离瓜类疫霉的选择性培养基，可以选择的真菌抑制剂为咯菌腈、咪鲜胺、恶霉灵和五氯硝基苯，浓度分别为10-20 μ g/mL、10-20 μ g/mL、50-100 μ g/mL和10-50 μ g/mL ;可以选择的抗生素类为利福平,浓度采用50-100 μ g/mL。实施例3、用于分离瓜类疫霉的PDA选择性培养基一、分离方法2009,2011年从天津市西青区，河西区瓜类疫病发病严重地区采集病样，用于分离瓜类疫霉。瓜类疫霉的分离按下述方法进行在同一地区选择不同的田块，采集疫病的病样(根茎和土壌)进行分离。分离步骤将发病组织使用清水清理干净后充分晾干，切取根茎部病健交界处的小块组织接种在本发明的选择性培养基上，25°C下黑暗培养，至有菌丝长出；在菌落边缘打取菌饼，置于加入IOmL灭菌水的培养皿中，在28°C光照条件下培养24-48h，可诱导其产生孢子囊，将培养皿置于4°C冰箱中处理40-60min后放回到室温，30-60min后游动孢子释放；挑单游动孢子置于普通PDA培养基上培养，至长出菌落，得到瓜类疫霉。对得到的瓜类疫霉进行鉴定。将真正的瓜类疫霉菌落保存在白云豆培养基试管斜面上，加适量的灭菌石蜡油置于室温下保存备用。根据现有的瓜果腐霉菌鉴定方法进行鉴定。ニ、分离中使用的培养基(一)I、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的配制方法马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉14g,加蒸懼水定容至IOOOmL,高压蒸汽灭菌，121で，20min。2、白云豆培养基的配制方法白云豆粉60g，双层纱布过滤，琼脂粉14g，加蒸馏水定容至IOOOmL,高压蒸汽灭菌，121 °C, 20min。(ニ)从发病田土壌或病样根茎部分离瓜类疫霉使用不同的PDA选择培养基，具体如下I、病样分离部位为根茎PDA选择培养基I :向未冷却的PDA培养基中添加咪鲜胺、恶霉灵、五氯硝基苯、、和利福平，并用未冷却的PDA培养基定容至I升；咪鲜胺在PDA选择培养基I中的浓度为15 μ g/mL，恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为70 μ g/mL，五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为20 μ g/mL,利福平在PDA选择培养基I中的浓度为70 μ g/mL。PDA选择培养基II :与PDA选择培养基I基本相同，不同之处在于咪鲜胺在PDA选择培养基I中的浓度为10 μ g/mL,恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为50 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为10 μ g/mL，利福平在PDA选择培养基I中的浓度为 50 μ g/mL。PDA选择培养基III :与PDA选择培养基I基本相同，不同之处在于咪鲜胺在PDA选择培养基I中的浓度为20 μ g/mL,恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为100 μ g/mL,五 氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为50 μ g/mL，利福平在PDA选择培养基I中的浓度为 100 μ g/mL。2、病样分离部位为土壤PDA选择培养基I :向未冷却的PDA培养基中添加咯菌腈、恶霉灵、五氯硝基苯、和利福平，并用未冷却的PDA培养基定容至I升；咯菌腈在PDA选择培养基I中的浓度为15 μ g/mL,恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为70 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为20 μ g/mL，利福平在PDA选择培养基I中的浓度为70 μ g/mL。PDA选择培养基II :与PDA选择培养基I基本相同，不同之处在于咯菌腈在PDA选择培养基I中的浓度为10 μ g/mL,恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为50 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为10 μ g/mL，利福平在PDA选择培养基I中的浓度为 50 μ g/mL。PDA选择培养基III :与PDA选择培养基I基本相同，不同之处在于咯菌腈在PDA选择培养基I中的浓度为20 μ g/mL,恶霉灵在PDA选择培养基I中的浓度为100 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为50 μ g/mL,利福平在PDA选择培养基I中的浓度为 100 μ g/mL。真菌抑制剂溶液的配制以丙酮或甲醇为溶剤，以咯菌腈原药、咪鲜胺原药、恶霉灵原药和五氯硝基苯原药为溶质，分别配制浓度为5000 μ g/mL的母液IOml,四种原药的称量量依次为 50. 2mg、51. 0mg、50. 6mg 和 50. 5mg ；细菌抑制剂溶液的配制用灭菌水将各种抗生素均配制成浓度为5 X IO4 μ g/mL的溶液。四、分离及鉴定结果在使用不同的本发明选择培养基进行分离的过程中，PDA选择培养基中均没有杂菌长出，只有瓜类疫霉能够生长，说明本发明的PDA选择培养基抑制了杂菌和腐霉生长，使瓜类疫霉的分离更容易。本发明方法从开始将病变组织接种至选择性培养基上至有瓜类疫霉菌丝长出，一般只需要3-4天，本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生长，使瓜类疫霉在培养基中成为优势菌群，生长速度提高，从而加快了分离进程。2009,2011年从上述天津市西青区和河西区瓜类疫病发病严重地区采集黄瓜、冬瓜和南瓜病样，共分离得到167株瓜类疫霉菌株，167株瓜类疫霉均鉴定正确。在用于田间一次性分离疫霉时，根据疫霉分离部位和采样地区施药历史的不同，用于疫霉分离培养的杀菌剂组合物中以腐霉抑制剂恶霉灵和细菌抑制剂利福平为主，加入的其它真菌抑制剂可以有不同的组合。针对不同的分离部位，选择不同的真菌抑制剂。其中，咪鲜胺对铼刀属真菌有特效，对链格孢菌和立枯丝核菌也有较好的抑制作用，并且与生产中广泛使用的多菌灵无交互抗药 性。因此，对于植物根茎部组织中瓜类疫霉的分离，真菌抑制剂组合可选10-20 μ g/mL咪鲜胺，有利于抑制对多菌灵产生抗药性的铼刀菌和丝核菌。咯菌腈是ー种非内吸的杀菌剂，对立枯丝核菌有特效，对铼刀菌也有较好的抑制作用，在从病土中分离瓜类疫霉时，可以用于腐生铼刀菌及丝核菌的真菌抑制剂。因此，对于土壤中瓜类疫霉的分离，真菌抑制剂组合可选择10-20 μ g/mL咯菌腈；五氯硝基苯对子囊菌门的根霉特效，主要用于环境温度较高时空气中黑根霉的抑制，因此如在温度较高的季节分离瓜疫霉，需在上述杀菌剂组合物中添加浓度为10-50 μ g/mL五氯硝基苯后使用效果最佳。恶霉灵可选择性的抑制真菌和腐霉，但对疫霉没有抑制作用，在从根茎部组织中或从土壤中分离瓜类疫霉时，可以用于腐霉的抑制剂。因此，对于土壌中瓜类疫霉的分离，腐霉抑制剂组合可选择50-100 μ g/mL恶霉灵。将上述该含有不同杀菌谱的真菌抑制剂和抗生素类杀细菌剂的杀菌剂组合物添加至PDA培养基中，制备成瓜类疫霉的选择性培养基。


本发明公开了一种简便、快速分离瓜类疫霉菌的培养基。该培养基是向PDA培养基中添加如下1)或2)所述杀菌剂得到的1)、由咯菌腈、恶霉灵、五氯硝基苯和利福平组成；2)、由咪鲜胺、恶霉灵、五氯硝基苯和利福平组成；实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离瓜类疫霉等疫霉属卵菌，可解决疫霉分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。