专利名称：一种用于分离辣椒疫霉的培养基的制作方法由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是一种世界性的毁灭病害。在气候适宜的条件下，短期内就可爆发，蔓延速度极快，一般发病可引起30%产量损失，严重情况下可导致辣椒绝收。1922年,Leonian首次报道在新墨西哥州Las Cruces农业试验站发现辣椒疫霉病害，现已在全世界范围内普遍发生，给农业生产带来严重的经济损失。我国最初由愈大绂于60年代在江苏发现此病，80年代后，该病在新疆、甘肃、北京和云南等20多个省市发生，至今在新疆、黑龙江、贵州、广州、甘肃、云南、上海、陕西等省(市)均发生过辣椒疫病，且有逐年加重的趋势。 辣椒疫病属辣椒疫霉菌侵染所致。辣椒疫霉(Phytophthora capsici)属于卵菌门霜霉目腐霉科疫霉属。辣椒疫病的初侵染源主要以辣椒疫霉(P. capsici)的卵孢子和厚垣孢子在土壤、病残体中越冬，种子也可带菌，其中土壤中的病残体带菌率最高。辣椒疫病是辣椒上的最重要的病害之一，苗期和成株期都能发生。叶片、茎、果实均可发病。叶片发病多在叶缘和叶柄连接处出现不规则暗绿色病斑，水溃状，边缘为黄绿色。茎基部和茎节分杈处发生成段暗绿色病斑，水溃状，基部多在近地面处发病。果实受害从蒂部开始，产生暗绿色水溃状病斑，边缘不明显，很快扩展到全果实，引起腐烂，潮湿时病部覆盖白色霉层，干燥后形成暗褐色僵果。为了对辣椒疫病进行相关研究，以及调查病原菌的越冬菌量和田间发病情况，做好病害的预测预报，筛选高效的药剂，最终达到有效防治该病害的目的，分离获得纯化的辣椒疫霉是必要的前提条件。常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75%乙醇和O. 1%升汞液表面消毒处理。实际工作中，从田间采集到的样本除被目标病原菌侵染外，不可避免的常常带有其他非目标真菌和细菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些非目标真菌或细菌的生长较辣椒疫霉迅速，其菌丝常将辣椒疫霉覆盖，而快速生长的细菌也会抑制其的生长。因此，利用普通培养基从病组织中分离辣椒疫霉时，病组织仅经过表面消毒处理，达不到分离纯化的目的。若表面消毒时间太长，往往在杀死非目标菌的同时，也会把目标菌杀死，造成目标菌分离率低或难于分离到目标菌。
本发明的一个目的是提供一种杀菌剂。本发明所提供的杀菌剂，其活性成分如下述1)、2)、3)或4)所示I)、由苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素组成；2)、由苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素组成；3)、由苯醚甲环唑、咪酰胺、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素组成；4)、由多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素组成。上述杀菌剂中，所述I)中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素的质量份数比为(10-20) :(10-50) :(10-50) :(50-100) : (50-100)，具体为 10 10 10 50 50 或 15 20 20 70 70 或 20 50 50 :100 :100 ；所述2)中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素的质量份数比为(10-20) :(10-50) :(10-50) :(50-100) :(30_50)，具体为 10 10 10 50 30 或 15 20 20 70 40 或 20 50 50 :100 50 ；所述3)中，所述苯醚甲环唑、咪酰胺、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素的质量份数比为(10-20) :(10-20) :(10-50) : (50-100) : (30-50)，具体为 10 10 10 50 :30，或 15 15 20 70 :40，或 20 20 50 :100 50 ；所述4)中，所述多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素的质量份数比为(10-50)(10-50) :(50-100) :(50-100);具体为 10 10 50 :50 或 20 20 70 :70 或 50 50 :100 100o本发明的另一个目的是提供一种用于分离辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的培养基。本发明所提供的用于分离辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的培养基,为如下I、II、III或IV所示I、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述I)所示杀菌剂得到的；II、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述2)所示杀菌剂得到的；III、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述3)所示杀菌剂得到的；IV、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述4)所示杀菌剂得到的。上述培养基中，所述I所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌灵在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为 50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。上述培养基中，所述II所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌灵在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL,70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述硫酸新霉素在所述PDA培养基中的浓度为30 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为 30 μ g/mL、40 μ g/mL 或 50 μ g/mL ；上述培养基中，所述III所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪酰胺在所述PDA培养基中的浓度为10μ g/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL,70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述硫酸新霉素在所述PDA培养基中的浓度为30 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为 30 μ g/mL>40 μ g/mL 或 50 μ g/mL。上述培养基中，所述IV所示培养基中，所述多菌灵在所述PDA培养基中的浓度为10μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述五氯硝基苯唑在所述PDA培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述PDA培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL>70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。上述培养基在分离辣椒疫霉(Phytophthora capsici)中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的分离辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的方法，包括如下步骤用上述任一所述培养基进行分离，用于分离的样本为感染辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的植物的叶片、果实、根茎或土壤。实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离辣椒疫霉，可解决辣椒疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。本发明为成功分离其他疫霉属菌株提供了参考，为进行田间一次性分离以及室内纯化辣椒疫霉提供技术支持。本发明选择培养基可用于简便、快捷地从病株组织上或病田土壤中一次性分离辣椒疫霉以及室内纯化辣椒疫霉。


图I为四种抗生素对植株叶片表面细菌的抑制作用。图2为四种抗生素对土壤中细菌的抑制作用。图3为立交疫霉病的发病情况。图4为不同杀菌剂组合物的用途。

50.6mg、52. 0mg、51. 5mg和125. Omg ;将这四种母液分别配制系列浓度为50 μ g/mL、20 μ g/mL和10 μ g/mL的多菌灵、五氯硝基苯、咪鲜胺和苯醚甲环唑的含药PDA平板，以加有溶剂 的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定辣椒疫霉对四种真菌抑制剂的敏感性。将供试的辣椒疫霉菌株在PDA平板上于25°C预培养3-4d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有四种药剂系列浓度的PDA含药平板中央(各浓度含等量有机溶剂)，于25°C下黑暗培养，7d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(％) = [(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/ (对照菌落增长直径)]X 100。测定了供试的四种真菌抑制剂对辣椒疫霉的抑制作用，结果如表I所示，不同浓度的多菌灵、五氯硝基苯对辣椒疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的多菌灵、五氯硝基苯作为选择性药剂；浓度为50 μ g/mL苯醚甲环唑对辣椒疫霉的抑制率大于20%，20 μ g/mL苯醚甲环唑对辣椒疫霉抑制率为14. 4%，10 μ g/mL的浓度对辣椒疫霉没有抑制作用，因此，可以采用10-20 μ g/mL浓度的苯醚甲环唑作为选择性药剂；咪鲜胺50 μ g/mL浓度的药剂对辣椒疫霉的抑制率为34%，10-20 μ g/mL浓度的咪鲜胺对辣椒疫霉抑制作用很小，所以可以采用10-20μ g/mL的咪鲜胺为分离辣椒疫霉中使用的选择性药剂。表I四种真菌抑制剂对辣椒疫霉的抑制作用


本发明公开了用于分离辣椒疫霉的培养基。该培养基是向PDA培养基中添加如下1)、2)、3)或4)所述杀菌剂得到的1)、由苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素组成；2)、由苯醚甲环唑、多菌灵、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素组成；3)、由苯醚甲环唑、咪酰胺、五氯硝基苯、利福平和硫酸新霉素组成；4)、由多菌灵、五氯硝基苯、利福平和青霉素组成。实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离辣椒疫霉，可解决辣椒疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。