肺炎链球菌抗原制作方法

A·W·克利普斯, J·M·吉德, M·乔玛, J·M·威尔斯, P·M·翰斯博罗

2002年4月17日

2000年3月27日

1999年3月26日

普罗瓦利斯英国有限公司

A61P31/04GK1345375SQ00805589

链球菌 肺炎 抗原

1.可得自肺炎链球菌的蛋白质或多肽，选自(i)用SDS/PAGE测定的分子量为55kDa，并且所具有的N-末端序列为VEPKAKPADPSVV的蛋白质或多肽；(ii)用S/PAGE测定的分子量为50kDa，并且所具有的N-末端序列为NDRLVATQSADGRNESVLMSIET的蛋白质或多肽；(iii)用SDS/PAGE测定的具有分子量为85kDa，并且所具有的N- 末 端序 列 为EDTTNSRFGSQFDKYRQPNAEPDHSHDAVSADNSTAHNRFGYGFAIGSKYIRYD的蛋白质或多肽；(iv)用SDS/PAGE测定的分子量为38kDa，并且所具有的N-末端序列为DKYRQPNAEPDDHHYAV的蛋白质或多肽；(v)用SDS/PAGE测定的分子量为30kDa，并且所具有的N-末端序列为DAVSAD或SETNVY的蛋白质或多肽；(vi)用SDS/PAGE测定的分子量为32kDa，并且所具有的N-末端序列为DKVDGLSAKPDILKP的蛋白质或多肽；(vii)用SDS/PAGE测定的分子量为43kDa，并且所具有的N-末端序列为ELKEEG(W)VVK的蛋白质或多肽；(viii)用SDS/PAGE测定的分子量为100kDa，并且所具有的N-末端序列为EVHA的蛋白质或多肽；(ix)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列为MKLNEVKEFVKELRAET的蛋白质或多肽；(x)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列为AKYEILYIERPNIEEFAK的蛋白质或多肽；(xi)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列为I(R)LTRM(E)GGKKKP(K)FYY的蛋白质或多肽；(xii)用SDS/PAGE测定的分子量为16kDa，并且所具有的N-末端序列为VMTDPIADXLXRI的蛋白质或多肽；(xiii)SDS/PAGE测定的分子量为27.5kDa，并且所具有的N-末端序列为(VA)(KE)LVFARHGE(LT)E(NK)的蛋白质或多肽；(xiv)用SDS/PAGE测定的分子量为44kDa，并且所具有的N-末端序列为IITDVYAREVLDSRGNPTL的蛋白质或多肽；(xv)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量为12-14kDa，并且所具有的氨基末端序列如下的蛋白质或多肽A L N I E N I I A E I K I A SAla Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Ile Ala Ser(xvi)为上述(xv)中所定义的蛋白质的还原毒性变体或片段；(xvii)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量约为16kDa的蛋白质或多肽；或者(xviii)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量约为57kDa，并且具有下列氨基末端序列R I I K F V Y A KArg Ile Ile Lys Phe Val Tyr Ala Lys.2.权利要求1中所定义的蛋白质或多肽，其以基本上纯的形式存在3.权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽的同系物或衍生物4.权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽的或权利要求3中所定义的同系物或衍生物的一或多个抗原性片段5.包含下列序列或由下列序列组成的核酸分子(i)编码权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽的DNA序列或它们的RNA等价物；(ii)与(i)序列中的任意一个互补的序列；(iii)基本上具有与(i)和(ii)序列中的任意一个同一性的序列；(iv)编码权利要求1-4任意一项中所定义的蛋白质或多肽的同系物、衍生物或片段的序列6.包含权利要求5中所定义的核酸分子的载体7.包含权利要求6中所定义的载体的宿主细胞8.权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽，或权利要求3中所定义的同系物或衍生物在药物方面的用途9.含有一或多种权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽，或它们的同系物或衍生物，和/或任何这些物质的片段的免疫原性/抗原性组合物10.权利要求9中所定义的组合物，该组合物为疫苗或可用于诊断测定11.包含一或多种权利要求5中所定义的核酸分子的疫苗12.针对权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、权利要求3中所定义的同系物或衍生物或权利要求4中所述片段而产生的和/或可与之结合的抗体13.检测/诊断肺炎链球菌的方法，其包括使待测样品与至少一种权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、权利要求3中所定义的同系物或衍生物或权利要求4中所定义的片段进行接触的步骤14.检测/诊断肺炎链球菌的方法，其包括使待测样品与一或多种能够与一或多种权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、 3中所定义的同系物或衍生物或权利要求4中所定义的片段结合的抗体进行接触的步骤15.检测/诊断肺炎链球菌的方法，其包括使待测样品与至少一种权利要求5中的核酸分子进行接触的步骤16.给实验对象接种以抵抗肺炎链球菌的方法，其包括给予实验对象权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、权利要求3中所定义的衍生物或同系物、权利要求4中所定义的片段，或权利要求9或10中所定义的免疫原性组合物的步骤17.实验给对象接种以抵抗肺炎链球菌的方法，其包括给予对象权利要求5中所定义的核酸分子的步骤18.预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，其包括给予实验对象权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、权利要求3中所定义的衍生物或同系物、权利要求4中所定义的片段，或权利要求9或10中所定义的免疫原性组合物的步骤19.预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，其包括给予实验对象权利要求5中所定义的核酸分子的步骤20.用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一或多种权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽、权利要求3中所定义的同系物或衍生物、权利要求4中所定义的片段，或权利要求9或10中所定义的抗原性组合物21.用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一或多种权利要求5中所定义的核酸分子22.测定权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽是否代表潜在的抗微生物靶的方法，其包括使所述的蛋白质或多肽失活，并在体外或体内测定肺炎链球菌是否依然存活23.能够拮抗、抑制或干扰权利要求1或2中所定义的蛋白质或多肽的功能或表达的药剂在制备用于治疗或预防肺炎链球菌感染的药物中的用途24.制备分离和纯化的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤(a)制备肺炎链球菌培养物，使培养物在合适的条件下生长并采集，接着在离心下洗涤，得到洗涤过的细胞小丸；(b)将洗涤过细胞再悬浮于合适的缓冲液中，接着使细胞破裂；(c)离心除去细胞碎屑并获得含有可溶性细胞蛋白质的上清液；(d)使得到的溶液以氯化钠作为梯度洗脱液进行阴离子交换层析，合并相应于每一个峰的组分；(e)将蛋白质组分悬浮于含有0.5M Tris HCl pH 68；10％(v/v)甘油；10％(w/v)SDS；0.05％(w/v)溴苯酚蓝；以及0.05％(v/v)β-巯基乙醇的缓冲液中；将混合物煮沸，然后利用SDS-PAGE，采用带有4％(w/v)丙烯酰胺/BIS层积凝胶的12％(w/v)丙烯酰胺/BIS分离凝胶进行纯化，在16mA下在层积凝胶中和在24mA下在拆解凝胶进行试验；(f)选择含有分子量为12-14kDa，16kDa，34kDa或57kDa的蛋白质的组分，并从选择的组分中分离蛋白质

本发明涉及衍生自肺炎链球菌的蛋白质、编码这些蛋白质的核酸分子、核酸和/或蛋白质作为抗原/免疫原及在检测/诊断中的用途，以及筛选蛋白质/核酸序列作为潜在抗微生物靶的方法在世界范围内呼吸道疾病仍然是引起发病和死亡的主要原因肺炎链球菌是呼吸道的主要致病菌由此致病菌引起的感染包括中耳炎、下呼吸道感染、菌血症以及脑膜炎肺炎链球菌，通常又称为肺炎球菌，是一种重要的致病生物体已经有人对在发展中国家和发达国家中与人类疾病有关的肺炎链球菌感染的持续重要性进行了权威性的综述(Fiber，G.R.Science，2651385-1387(1994))该报告指出，在全球范围内，这种生物体被认为是急性呼吸道感染最常见的细菌性原因，估计每年可以导致一百万儿童死亡，主要是在发展中国家(Stansfield，S.K.，Pediatr.Infect.Dis.，6622(1987))在美国，有人提出(Breiman等人，Arch.Intern.Med.1501401(1990))肺炎球菌仍然是细菌性肺炎最常见的原因，该疾病在幼童、老人、和患有易感染疾病(例如无脾、心脏病、肺病以及肾病、糖尿病、酒精中毒或具有免疫抑制失调性疾病(尤其是AIDS))的患者中发病率特别高这些人群组具有肺炎球菌败血病并因此具有脑膜炎的高发危险性，因此更容易死于肺炎球菌感染这些肺炎球菌还可以导致中耳炎和鼻窦炎，其仍为发展中国家儿童中的流行性感染，并带来很大的费用由于新近出现了抗青霉素的肺炎球菌使得对肺炎球菌感染的有效预防战略的需要变得突出据报道，已发现在美国12个洲的13所医院中得到的肺炎球菌的分离物中有6.6％对青霉素具有抗性，有一些分离物还对其它抗菌素具有抗性，包括第三代的环孢菌素(Schappert，S.M.，Vital and Health Statistics of the Centres for DiseaseControl/National Centre for health Statistics，2141(1992))在一些医院中，青霉素抗性比率较高(高达20％)(Breiman等人，J.Am.Med.Assoc.，2711831(1994))由于肺炎球菌中产生青霉素抗性的情况是新近的而且很突然，其出现于一直用青霉素进行有效治疗的数十年之后，所以在这些发现被视为一种警示由这些致病菌引起的疾病的负担是很明显的，并对国家的健康预算有重大影响尽管有针对于肺炎链球菌的疫苗，但这种疫苗对2岁以下的儿童不是十分有效目前的治疗依赖于感染的抗菌素治疗许多患有因肺炎链球菌引起感染的人群生活在发展中国家，那里的一些社区仅有非常有限的获得适当药物治疗的手段因此，不可能得到抗菌素治疗在可以获得抗菌素的发达国家，已经明显出现了这些细菌对抗菌素具有抗性的情况因此，开发抗肺炎链球菌的有效疫苗是人们期望的目标特别地，期望开发出能够用于幼童的疫苗采取了各种方法以便提供用于预防肺炎球菌感染的疫苗出现了一些困难，例如就基于围绕在有机体周围的多糖荚膜结构的各种血清型(至少90种)而言能抵抗单个血清型的疫苗无法有效地抵抗其它血清型，这意味着疫苗必须包括来自全部血清型的多糖抗原，以便对大多数病症有效由于已经发现当被纯化和用作疫苗时，荚膜多糖(其中的每一个决定血清型并作为主要的保护性抗原)对2岁以下的幼童不能可靠地诱导保护性抗体反应，而侵入性肺炎球菌感染和脑膜炎在该年龄组中的发病率最高，所以产生了另外一个问题对采用荚膜抗原的方法的修饰依赖于多糖与蛋白质的缀合，以便诱导增强的免疫反应，特别是通过给出反应T-细胞依赖特性例如该方法已经被用于开发抗流感嗜血菌疫苗然而，这需要有关于复合多糖疫苗及基于缀合物的那些疫苗的费用支出第三个方法是寻找具有作为疫苗候选者潜力的其它抗原组分这是本发明的基础我们现已鉴定了一些来自肺炎链球菌的抗原性和免疫原性的蛋白质因此在本发明的第一个方面中提供了可得自肺炎链球菌的蛋白质或多肽，它们选自(i)用SDS/PAGE测定的分子量为55kDa，并且所具有的N-末端序列为VEPKAKPADPSVV的蛋白质或多肽；(ii)用SDS/PAGE测定的分子量为50kDa，并且所具有的N-末端序列为NDRLVATQSADGRNESVLMSIET的蛋白质或多肽；(iii)用SDS/PAGE测定的具有分子量为85kDa，并且所具有的N- 末 端 序 列 为EDTTNSRFGSQFDKYRQPNAEPDHSHDAVSADNSTAHNRFGYGFAIGSKYIRYD的蛋白质或多肽；(iv)用SDS/PAGE测定的分子量为38kDa，并且所具有的N-末端序列为DKYRQPNAEPDDHHYAV的蛋白质或多肽；(v)用SDS/PAGE测定的分子量为30kDa，并且所具有的N-末端序列为DAVSAD或SETNVY的蛋白质或多肽；(vi)用SDS/PAGE测定的分子量为32kDa，并且所具有的N-末端序列为DKVDGLSAKPDILKP的蛋白质或多肽；(vii)用SDS/PAGE测定的分子量为43kDa，并且所具有的N-末端序列为ELKEEG(W)VVK的蛋白质或多肽；(viii)用SDS/PAGE测定的分子量为100kDa，并且所具有的N-末端序列为EVHA的蛋白质或多肽；(ix)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列为MKLNEVKEFVKELRAET的蛋白质或多肽；(x)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-终端为AKYEILYIERPNIEEFAK的蛋白质或多肽；(xi)用SDS/PAGE测定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列为I(R)LTRM(E)GGKKKP(K)FYY的蛋白质或多肽；(xii)用SDS/PAGE测定的分子量为16kDa，并且所具有的N-末端序列为VMTDPIADXLXRI的蛋白质或多肽；(xiii)用SDS/PAGE测定的分子量为27.5kDa，并且所具有的N-末端序列为(VA)(KE)LVFARHGE(LT)E(NK)的蛋白质或多肽；(xiv)用SDS/PAGE测定的分子量为44kDa，并且所具有的N-末端序列为IITDVYAREVLDSRGNPTL的蛋白质或多肽；(xv)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量为12-14kDa，并且所具有的氨基末端序列如下的蛋白质或多肽A L N I E N I I A E I K I A SAla Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Ile Ala Ser(xvi)为上述(xv)中所定义的蛋白质的还原毒性变体或片段；(xvii)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量约为16kDa的蛋白质或多肽；或者(xviii)在还原条件下，用SDS/PAGE测定的分子量约为57kDa，并且具有下列氨基末端序列R I I K F V Y A KArg Ile Ile Lys phe Val Tyr Ala Lys.本发明中的蛋白质或多肽可以基本上纯的形式提供例如，其可以基本上不含其它蛋白质的形式提供关于上面引用的分子量，技术人员将会意识到用不同的人手或甚至用同样的人手在不同的场合会得到有细微差别的结果，因此，这里所引用的分子量数字应理解为有±5％或甚至±10％的波动正如这里所讨论的，本发明蛋白质和/或多肽可用作抗原物质这类物质可以是“抗原性”和/或“免疫原性”的通常，“抗原性”是指蛋白质或多肽能够用来产生抗体或确实能够诱导实验对象的抗体反应“免疫原性”是指蛋白质或多肽能够引发实验对象体内的保护性免疫反应因此在后一种情况下，蛋白质或多肽不仅可能能够产生抗体反应，另外还能产生非抗体基础的免疫反应技术人员将会意识到本发明中的蛋白质或多肽的同系物或衍生物也将在本发明的上下文中找到用途，即作为抗原性/免疫原性物质因此，包括一或多个添加、缺乏、取代等处理的蛋白质或多肽均包括在本发明的范围内另外，可以用另一个相似“类型“的氨基酸取代一个氨基酸例如用另一个氨基酸取代一个疏水性的氨基酸人们可以利用程序(例如CLUSTAL程序)来比较氨基酸序列该程序可比较氨基酸序列，并且在适当处通过在任一序列中插入间隔来发现最适顺序可以计算最适顺序的氨基酸同一性或相似性(氨基酸类型的同一性加保守性)类似BLASTx的程序将对比相似序列的最长的一段，并给该配合指定一个值因此，有可能获得一个比较，在其中发现有几个区域是相似的，每一个具有不同的分值这两种类型的分析本发明均予以关注在同系物和衍生物的情况下，与这里所述的蛋白质或多肽的同一性程度比起同系物或衍生物应该保留其对肺炎链球菌的抗原性或免疫性性来说重要性要小得多然而，适宜地是提供与这里所述的蛋白质或多肽具有至少60％相似性的同系物或衍生物(正如这里所讨论的)优选的是，提供具有至少70％的相似性、更优选的是至少80％的相似性的同系物或衍生物，最优选的是，提供具有至少90％或甚至95％的相似性的同系物或衍生物在另一个方法中，同系物或衍生物可以是混入使纯化更为容易的组成成分的融合蛋白质，例如通过有效地标记需要的蛋白质或多肽除去“标记”可能是必要的或也可以是这种情况融合蛋白质本身保持足够可用的抗原性在本发明的另一个方面中，其提供了本发明蛋白质或多肽或其同系物或衍生物的抗原性片段对于这里所述的蛋白质或多肽或其同系物或衍生物的片段来说，情况稍有不同已知可以筛选抗原性蛋白质或多肽来鉴定表位区域，即那些对蛋白质或多肽的抗原性或免疫性性负有责任的区域进行这类筛选的方法在本领域内是已知的因此，本发明的片段应包括一或多个这样的表位区域或与这些区域足够相似以保留它们的抗原性/免疫性性质因此，对于本发明的片段来说，同一性的程度可能是无关的，因为它们可与这里所述的蛋白质或多肽、同系物或衍生物的特定部分达到100％的同一性再一次地，关键的问题是该片段保留它们的抗原性/免疫原性因此，对于同系物、衍生物和片段来说，重要的是它们至少具有一定程度的蛋白质或多肽(它们从中衍生而来)的抗原性/免疫原性通过提取可以从肺炎链球菌中获得蛋白质，因此，在本发明的另一方面中，提供了一种制备分离的和纯化的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤(a)制备肺炎链球菌培养物，使培养物在合适的条件下生长并采集，接着用离心洗涤，得到洗涤过的细胞小丸；(b)将洗涤过细胞再悬浮于合适的缓冲液中，接着使细胞破裂；(c)离心除去细胞碎屑并获得含有可溶性细胞蛋白质的上清液；(d)使得到的溶液以氯化钠作为梯度洗脱液进行阴离子交换层析，合并相应于每一个峰的组分；(e)将蛋白质组分悬浮于含有0.5M Tris HCl pH 68；10％(v/v)甘油；10％(w/v)SDS；0.05％(w/v)溴苯酚蓝；以及0.05％(v/v)β-巯基乙醇的缓冲液中；将混合物煮沸，然后利用SDS-PAGE，采用带有4％(w/v)丙烯酰胺/BIS层积凝胶的12％(w/v)丙烯酰胺/BIS分离凝胶进行纯化，在16mA下在层积凝胶中和24mA下在拆解凝胶中进行试验；(f)选择含有分子量为12-14kDa，16kDa，34kDa或57kDa的蛋白质的组分，并从选择的组分中分离蛋白质另外，可以采用基因克隆技术来提供本发明的基本上纯化形式的蛋白质例如在J.Sambrook等人，Molecular Cloning 2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中公开了这些技术因此，在这里公开的蛋白质的N-末端序列可以反过来用作探针的基础，来分离编码单个蛋白质的基因因此，本发明的另一个方面是提供了包含或由下列序列组成的核酸分子(i)编码这里所述蛋白质或多肽的DNA序列或它们的RNA等价物；(ii)与(i)序列中的任意一个互补的序列；(iii)基本上具有与(i)和(ii)序列中的任意一个同一性的序列；(iv)编码这里所述的蛋白质的同系物、衍生物或片段的序列本发明的核酸分子可以包括众多的这类序列和/或片段技术人员会意识到本发明可以包括在此举例说明的那些特定的新颖核酸分子的新颖变体本发明包括这类变体这些变体可以是天然存在的，例如由于菌株变化例如，包括添加、取代和/或缺失另外且特别是当利用微生物表达系统时，人们可以寄希望于在用来表达的特定的有机体中，利用已知的优选的密码子选择来人工改造核酸序列因此，本发明也包括合成或非天然存在的变体上述使用的术语“RNA等价物”是指给定的RNA分子具有与给定的DNA分子的序列互补的序列(考虑这样一个事实，即RNA中的“U”取代了遗传密码中的“T”当为了测定同源性或同一性的程度而进行核酸序列比较时，可以采用BESTFIT和GAP等程序(两者均来自Wisconsin GeneticsComputer Group(GCG)软件包)例如BESTFIT可比较两个序列并产生最相似区段的最适顺序GAP可使序列沿着它们的整个长度排列，并通过在任一序列的适当位置插入间隔发现最适顺序适宜地，在本发明的上下文中，当讨论核酸序列的同一性时，通过使序列沿着它们的整个长度排列进行比较优选地，具有实质同一性的序列与所述序列具有至少50％序列同一性、期望的是至少75％序列同一性、更需要的是至少90％或至少95％的序列同一性在一些情况下，序列同一性可为99％或更高期望地，术语“实质同一性”是指，与现有技术的核酸序列相比，所述的序列与这里所述的任何序列具有更大程度的同一性然而，应该注意到，本发明的核酸序列为新颖基因产物的至少一部分进行编码，因此本发明包括所有可能为基因产物或为其新颖部分进行编码的序列核酸分子可以为分离或重组的形式其可以混入载体中，并且该载体可以混入宿主中这类载体和合适的宿主构成了本发明进一步的方面因此，例如，利用在这里所述的N-终端氨基酸基础上设计的探针，可以鉴定肺炎链球菌中的基因然后利用限制酶将它们切除，并克隆到载体中可将载体引入合适的宿主中进行表达通过使用合适的与核酸分子序列的一部分互补的探针，可以从肺炎链球菌中获得本发明的核酸分子可以采用限制酶或声处理技术来获得用于探测的合适大小的片段另外，可以利用PCR技术来扩增需要的核酸序列因此，这里提供的序列数据可用来设计两个用于PCR的引物，以便能够靶向需要的序列(包括其整个基因或片段)，然后以较高的程度进行扩增一般情况下，一个引物将对位于DNA分子一条链上的第一个序列显示出高度的特异性，而另一个引物将对位于DNA序列互补链上的第二个序列显示出高度的特异性，并且与第一个序列的互补序列隔开典型的引物具有至少15-25个核苷酸长度作为另外的方案，可以采用化学合成这种方法可以是自动化的可以通过化学方法合成相对短的序列，然后连接起来提供一个较长序列正如这里所讨论的，本发明人还发现12-14kDa的蛋白质是一种毒素，如果通过修饰降低其毒性，有可能提供高度有效验的疫苗确定蛋白质毒性部分的战略包括连续截短的片段或突变体的制备正如这里所讨论的，发现本发明的蛋白质以及其片段和同系物可以用作免疫原因此，在另一个方面中，本发明提供了本发明蛋白质、其同系物和/或其片段在药物方面的用途，尤其是在肺炎链球菌感染的预防和/或治疗方面的用途在进一步的方面中，本发明提供了一种免疫原性/抗原性组合物，该组合物包含一或多种这里所述的蛋白质或多肽、或它们的同系物或衍生物，和/或任何这些物质的片段在优选的实施方案中，免疫原性/抗原性组合物为一种疫苗或可用于诊断测定疫苗组合物还可以包含佐剂本领域内熟知的佐剂的实例包括无机凝胶，例如氢氧化铝或油包水乳剂，例如弗氏不完全佐剂其它有用的佐剂对于本领域内的专门人员来说是熟知的蛋白质可经各种途径进行给药，包括肠道给药，例如口服、鼻腔、颊、局部或肛门等途径，或非肠道给药，例如静脉、皮下、肌内或腹膜内等途径当然，组合物所采用的剂型以及其所含有的赋形剂取决于选择的给药途径例如，口服制剂可以为糖浆剂、酏剂、片剂或胶囊剂形式，其可以用肠衣包裹以使蛋白质免受在胃中的降解鼻腔或透皮制剂通常分别为喷雾剂或贴片形式注射制剂可以是溶于蒸馏水或其它药物上可接受的溶剂或悬浮剂中的溶液或悬浮液给予患者的本发明蛋白质合适的剂量将由医生来决定然而，作为一种指导，合适的剂量可为约0.5-20mg/kg体重在大多数情况下，预计剂量约为1-15mg/kg体重，优选的是1-10mg/kg体重因此对于一个体重约70kg的男性来说，典型的剂量约为70-700mg还可以利用这里所述的核酸序列来制备所谓的DNA疫苗因此，本发明还提供了包含一或多种这里所定义的核酸序列的疫苗组合物本领域内有关于这种DNA疫苗用途的描述例如，可以参见Donnelly等人，Ann.Rev.Immunol.，15617-648(1997)正如这里已经讨论的，这里所述的蛋白质或多肽、它们的同系物或衍生物，和/或任何这些物质的片段可以用于肺炎链球菌的检测/诊断方法中这种方法可基于对抵抗可能存在于检测对象体内的这种蛋白质的抗体的检测因此，本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，该方法包括使受试样品与至少一种这里所定义的蛋白质、或它们的同系物、衍生物或片段进行接触的步骤适宜地，样品为生物样品，例如得自受试对象的组织样品或者血液或唾液样品在另一个方法中，可用这里所定义的蛋白质、或它们的同系物、衍生物和/或片段来产生抗体，该抗体反过来可用来检测抗原，如肺炎链球菌这类抗体构成了本发明的另一个方面包括在本发明范围内的抗体可以是单克隆的也可以是多克隆的当将这里所定义的蛋白质、或其同系物、衍生物或片段注射到动物体内时，在合适的动物宿主(例如小鼠、大鼠、荷兰猪、兔子、绵羊、山羊或猴子)中通过刺激它们的生成可以产生多克隆抗体如有需要，可与蛋白质一起给予佐剂熟知的佐剂包括弗氏佐剂(完全的和不完全的)以及氢氧化铝借助该抗体与这里所述蛋白质的结合可以对其进行纯化从杂交瘤可以生产单克隆抗体通过将能产生需要抗体的骨髓瘤细胞和脾细胞融合在一起以便形成无限增殖的细胞系可以形成这些抗体因此，可以采用熟知的Kohler&Milstein技术(Nature 256(1975))或基于此技术其随后的变化形式用于生产与特定多肽/蛋白质结合的单克隆和多克隆抗体的技术在本领域中已经得到了充分的发展在标准的免疫学教科书中有所讨论，例如Roitt等人，Immunlogy第二版(1989)，ChurchhillLivingstone，London除了整个的抗体之外，本发明还包括能够与这里所述的蛋白质等结合的抗体衍生物因此，本发明包括抗体片段和合成构建物Dougall等人在Tibtech 12372-379(1994年9月)中给出了抗体片段和合成构建物的实例例如，抗体片段包括Fab，F(ab’)2和Fv片段Fab片段(在Roitt等人[上文]中讨论了这些片段)可以修饰Fv片段来生成已知为单链Fv(scFv)分子的合成的构建物其包括与Vh和Vl区域共价结合的肽接头，它们有助于分子的稳定性其它可用的合成构建物包括CDR肽这些是包含抗原结合决定簇的合成肽也可以采用肽模拟物这些分子通常是构象受限的有机环，其模仿CDR环结构并且包括抗原相互作用的侧链合成构建物包括嵌合分子因此，例如，人源化(或灵长类化)抗体或其衍生物也在本发明的范围之内人源化抗体的实例为具有人类构架区、但啮齿动物高变区的抗体例如Morrison等人在PNAS，81，6851-6855(1984)及Takeda等人在Nature.314，452-454(1985)中讨论了生产嵌合抗体的方式合成构建物还包括含有附加的部分，该部分可以提供除了抗原结合之外具有一些期望性质的分子例如该部分可以是一种标记(例如荧光或放射标记)另外，其可为一种药物活性剂发现抗体或其衍生物在肺炎链球菌的检测/诊断上有用因此，本发明的另一个方面提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，其包括使待测样品与能够与一或多种这里所述的蛋白质或多肽、或其同系物、衍生物和/或片段结合的抗体进行接触的步骤另外，可以利用所谓的“亲和体”它们是结合蛋白，选自α-螺旋细菌受体结构域的组合文库(Nord等人)因此，可利用组合方法来选择能够与不同靶蛋白特异性结合的小蛋白质结构域还将清楚地看到，这里所述的核酸序列可用来检测/诊断肺炎链球菌因此，再一方面本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，其包括使受试样品与至少一种这里所述的核酸序列进行接触的步骤适宜地，样品为生物样品，例如得自受试对象的组织样品或者血液或唾液样品这些样品在用于本发明方法之前可以进行预处理因此，例如，可以处理样品提取DNA，然后可用基于这里所述的核酸序列的DNA探针检测来自肺炎链球菌的核酸在另外的方面中，本发明提供了(a)给受试对象接种以抵抗肺炎链球菌的方法，其包括给予受试对象本发明中的蛋白质或多肽、或其衍生物、同系物或片段，或免疫原性组合物的步骤(b)给受试对象接种以抵抗肺炎链球菌的方法，其包括给予受试对象这里所定义的核酸分子的步骤(c)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，其包括给予受试对象本发明中的蛋白质或多肽、或其衍生物、同系物或片段，或免疫原性组合物的步骤(d)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，其包括给予受试对象这里所定义的核酸分子的步骤(e)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一或多种本发明蛋白质或多肽，或其同系物、衍生物或片段，或本发明抗原性组合物，以及(f)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一或多种这里所定义的核酸分子假设我们鉴定了一组重要的蛋白质，这类蛋白质是用于抗微生物治疗的潜在的靶然而，必要的是，测定是否每一种蛋白质对于有机体的存活来说都是必需的因此，本发明还提供了一种测定这里所述的蛋白质或多肽是否代表潜在的抗微生物靶(其包含失活的所述蛋白质或多肽)以及测定在体外或体内肺炎链球菌是否依然存活的方法合适的用于使蛋白质失活的方法是进行选择的基因剔除，即防止蛋白质表达并测定这是否导致致死性变化Li等人在P.N.A.S.，9413251-13256中描述了进行这类基因剔除的适宜方法本发明的最后一个方面提供了能够拮抗、抑制或干扰本发明蛋白质或多肽的功能或表达的药剂在制备用于治疗或预防肺炎链球菌感染的药物中的用途通过下列实施例将进一步描述本发明，这些实施例不应以任何方式限制本发明的范围实施例提到下列附图，其中