专利名称：大规模生产病毒抗原的方法有效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出的病毒的生长。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大的意义。因此，为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。因此，为了获得多种病毒株的可接受的高产量，需要提供了对于大量不同的病毒来说最佳生长条件的系统。仅有的在经济上可实施的方法是反应器方法，因为可以按比例进行扩大以适于市场大小和所需的疫苗剂量。对于粘附细胞，使用传统微载体的载体方法在目前对于大规模培养病毒增殖所需的细胞来说是最好的选择(Van Wezel等人，1967，Nature 21664-65；Van Wezel等人，1978，Process Biochem.36-8)。已经描述了在微载体上大规模生产脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、HSV或马立克氏病病毒的方法(US 4,525,349；Widell等人，1984，J.Virological Meth.，863-71；Fiorentine等人，1985，Develop.Biol.Standard，60421-430；Griffiths等人，1982，Develop.Biol.Standard.，50103-110)。目前基于微载体培养的方法允许使用最多至1200L的发酵罐大小来生产病毒。Caij等人(1989，Arch.Virol.，105113-118)比较了在微载体培养物和常规的单层培养物上猪瘟病毒的病毒滴度的产量，并发现使用微载体系统可以获得更高的每单位体积培养基的病毒产量。Griffiths等人(1982，Develop.Biol.Standard.，50103-110)研究了微载体浓度对于细胞生长和HSV生产的影响。已经发现最佳的微载体浓度对于达到高细胞密度是必需的，其也影响所获得的病毒产量。可是，在灌注系统中更高的微载体浓度由于细胞层从小珠上脱落而导致细胞损失。在微载体系统上的病毒生产方法的生产力取决于病毒、细胞、微载体的类型和系统中所获得的细胞密度。细胞培养中更高的微载体浓度允许更高的总细胞数。可是，微载体是昂贵的，而且在这些条件下，由于细胞层在系统中受到剪切力的影响而从小珠上脱落，从而可能发生细胞损失。这意味着对于更高的病毒产量需要更大体积的微载体细胞培养物，但是这增加了对于处理和纯化这样的大体积所必须作出的努力。对于病毒增殖来说，重要的是达到最佳的细胞密度来获得最大病毒产量。允许病毒与细胞进行有效的吸附也是重要。因此，在常规方法中，于感染之前减小生长培养基的体积以便以最小的培养物体积和以更好的病毒与细胞的比例让病毒吸附到细胞上。可是，为了获得最佳的病毒增殖，在合适的吸附时间之后再次将培养基体积增加以便让细胞保持存活力和/或生长。但是这增加了含有细胞和/或病毒的培养基体积，增加培养基体积具有这样的缺点，即不得不处理大体积来进一步从细胞或者细胞培养基中纯化出病毒。在病毒感染爆发的时候，关键性的是及时地生产大量的疫苗以便在非常短的时间内提供几百万的疫苗剂量。因此，存在对于安全和有效的生产病毒和抗原的方法的持续需求。此外，还有对于获得病毒增殖的方法的需求，其使用已经可使用的材料和要求最少的消耗时间的操作，例如处理体积减少的细胞培养基和促进用于疫苗生产的纯化和下游处理。
发明概述本发明的一个目的是提供在与微载体结合的粘附细胞的细胞培养物中生产病毒或病毒抗原的方法。
提供以小细胞培养体积来生产病毒的方法也是本发明的一个目的。
提供与生长至汇合的原始细胞培养物相比具有更高的细胞密度的粘附细胞的细胞培养物，这也是本发明的一个目的。
本发明的一个目的是提供与微载体结合的粘附细胞的细胞培养物，其与生长至汇合的原始细胞培养物相比具有更高的细胞密度，其中这些细胞用病毒进行了感染。
发明详述根据这些和其他目的，本发明提供了用于生产病毒或者病毒抗原的方法，其包括下列步骤，即提供与微载体结合的粘附细胞的培养物，使细胞培养物生长至汇合，用病毒感染这些细胞，其中于(i)用病毒感染之前或者(ii)用病毒感染之后增加细胞培养物中的细胞密度，并孵育用病毒感染的细胞培养物以便增殖病毒。细胞培养物中细胞密度的增加通过浓缩细胞培养物来进行，其包括细胞培养物中微载体浓度的增加。
通常，与微载体结合的粘附细胞需要微载体浓度与细胞的最佳比例从而达到高细胞密度。细胞培养物中微载体浓度的增加在理论上会允许达到更高的每单位体积培养基的细胞密度。可是，由于剪切效应、培养基中营养源的减少和增加的微载体浓度所造成的细胞的生理胁迫，所以将细胞培养物系统中的载体浓度限制于特定的浓度(也可见Griffiths等人，1982，如上述)。
本发明的方法允许细胞在最佳的生长条件下生长，包括微载体浓度、给料和最小生理胁迫，以便达到对于所使用的系统来说最大的细胞密度。
在本发明中发现，于用病毒感染之前或者之后减少培养基体积，由此细胞培养生物质中细胞密度和微载体的浓度增加了，这不会影响细胞的生产力。相反地，还惊讶地发现，与作为原始汇合细胞培养物而保持在同样细胞密度的细胞相比，每个细胞中所获得的病毒产量增加了。当由于细胞培养物中微载体浓度的增加而引起细胞活力降低、细胞从微载体上脱落和更高的细胞密度造成生理胁迫时这是非常不希望的，而在病毒产生期间是希望的。
本发明的方法允许减少在进一步的病毒纯化过程期间必须处理的培养基体积，同时每个细胞的病毒生产力与原始细胞培养物相比是近似的或者甚至是增加的。该系统可以按比例扩大至6000L发酵罐体积，这一体积使得用于疫苗的病毒生产过程更加有效和消耗时间。
根据本方法的一个实施方案，贴壁依赖性细胞选自下列粘附细胞，即VERO、BHK、CHO、RK、RK44、RK13、MRC-5、MDCK、CEF或者Reuveny等人(1985，Develop.Biol.Standard.，60243-253)描述的二倍体单层细胞和其他本领域中熟知的细胞。
与微载体结合的粘附细胞可以在常规的含有血清的细胞培养基中生长。根据本发明的优选的实施方案，细胞可在Kistner等人(1998，Vaccine，16960-968)、Merten等人(1994，Cytotech.，1447-59)、Cinatl等人(1993，Cell Biology Internat.，17885-895)、Kessler等人(1999，Dev.Biol.Stand.，9813-21)、WO 96/15231、US 6,100,061所描述的无血清或无血清和蛋白质的培养基中生长，或者在任何其他的本领域中已知的无血清或无血清和蛋白质的培养基中生长。细胞优选地在无血清或无血清和蛋白质的培养基中从安瓿至大规模地生长成生物质。
根据本发明的一个实施方案，让与微载体结合的粘附细胞的培养物生长至汇合，并在汇合细胞培养物的细胞生物质的细胞密度和微载体浓度增加之后用病毒进行感染。
根据本发明的一个实施方案，让与微载体结合的粘附细胞的培养物生长至汇合，并在汇合生物质的细胞密度和微载体浓度增加之前用病毒进行感染。在任何情况下，即使在培养物浓缩之前或之后将具有更高的每单位体积细胞密度和微载体浓度的细胞培养物进行感染，生物质中的细胞密度和微载体浓度在病毒增殖和生产过程期间保持不变，而同时培养基的体积不再增加。用于增加在未感染或者用病毒感染的细胞培养生物质中的细胞密度和微载体浓度的方法可以是任何在本领域中已知用于浓缩细胞培养物的方法。这可以通过下列方法来完成，例如沉淀、离心、过滤、用灌注装置如筛来浓缩，这可引起工作体积的减少，或者集合2个或更多个生物反应器系统来进行。
增加长至汇合的细胞培养物的细胞培养物密度和微载体浓度，其中，与长至汇合的原始生物质相比这一增加应当为至少1.3倍。长至汇合的原始起始细胞培养物的细胞密度可以为大约0.6×106-大约7.0×106细胞/ml。在这种情况下，与起始培养生物质相比具有增加的细胞密度的生物质可以具有至少0.8×106-至少9.0×106细胞/ml的细胞密度。
起始细胞培养物中的微载体浓度优选地为大约0.5g/L-大约0.7g/L。在浓缩了汇合生物质之后，微载体浓度优选地为大约0.65g/L-大约21g/L。
根据本发明的方法所使用的微载体优选地选自基于葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯和塑料的微载体，和Miller等人(1989，Advances in Biochem Eng./Biotech.，3973-95)以及Butler(1988，InSpier & Griffiths，Animal cellBiotechnology，3283-303)描述的微载体。
根据本发明方法的一个实施方案，病毒选自流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒与重组痘苗病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒及其嵌合体，以及鼻病毒和呼肠孤病毒。选择粘附宿主细胞和易感染该宿主的病毒，以及使用本发明的方法来获得增加的所要病毒的病毒产量，这些均在本领域熟练技术人员的知识范围之内。
下列内容也在本领域熟练技术人员的知识范围之内，即选择各自的微载体类型、起始培养物中微载体的浓度、对于病毒易感的粘附细胞和培养基，以及选择最佳的生长条件如氧气浓度、培养基的补充物、温度、pH、压力、旋转速度和给料控制，从而获得汇合细胞培养生物质，其可以用于根据该方法来获得具有增加的细胞密度和微载体浓度的细胞生物质。然后可以将具有更高细胞密度生物质的细胞培养物用于有效的病毒增殖和生产。在细胞培养物达到汇合之后，本发明的方法可导致获得具有增加的细胞密度的细胞培养物，该细胞密度为至少1.3倍直至10倍的微载体浓度，并由于i)培养物体积减少和ii)每个细胞的生产力增加而获得更高的每单位培养物体积的病毒产量。
病毒生产过程和生产的时间跨度取决于所使用的系统。在各个系统中能够达到的最大病毒产量可以用标准方法来确定。当达到最大病毒产量时，收获病毒和/或含有病毒的细胞。因此，本发明的方法进一步包括收获增殖和生产出的病毒这一步骤。
本发明的另一方面提供了用于生产纯化的病毒或病毒抗原的方法，该方法包括下列步骤，即提供与微载体结合的粘附细胞的培养物，使细胞培养物生长至汇合，用病毒感染细胞培养物，其中于(i)用病毒感染之前或者(ii)用病毒感染之后增加细胞培养物中的细胞密度，然后孵育用该病毒感染的该细胞培养物以便增殖该病毒，(f)收获生产出的病毒和(g)纯化收获的该病毒。
依赖于用于感染和增殖的病毒的特性，生产出的病毒出现在细胞培养物的上清液中和/或与细胞生物质结合在一起。裂解病毒如流感病毒在感染后的适当时间之后裂解细胞，从而病毒释放入细胞培养基之中。产生并释放入细胞培养基之中的病毒可以用常规方法与细胞生物质或者其他细胞碎片分离开，例如离心(包括超离心、密度梯度离心)、微滤、超滤、离子交换层析等等，并进行纯化。
非裂解病毒在细胞内增殖，并仍然与生物质的细胞结合在一起。这些病毒可以通过收集生物质、用常规方法裂解细胞来收获，例如用去污剂、热、冷冻/解冻、超声处理、弗氏压碎器或者其他细胞裂解方法来处理细胞。收获从细胞中释放出的病毒，并浓缩和纯化。病毒的纯化可以用任何本领域中已知的方法来进行，例如超滤、离子交换层析或等密度离心等等。
流感病毒可以在包括最有效MDCK细胞在内的细胞系上进行增殖，以及在已经批准用于生产人疫苗的细胞系如VERO细胞上进行增殖。已经描述了在生物反应器中于微载体小珠上的哺乳动物细胞培养物之上的无血清或无血清和蛋白质的培养基中大规模生产流感病毒，以及流感病毒疫苗的发展(Merten等人，1999，Dev.Biol.Stand.，9823-37；Kistner等人，1998，Vaccine，16960-968；Kistner等人，1999，Dev.Biol.Stand.，98101-110和WO 96/15231)。
根据一个方面，本发明提供了生产流感病毒的方法，其包括下列步骤，即提供与微载体结合的粘附细胞的培养物，使细胞培养物生长至汇合，用流感病毒感染细胞，其中于(i)用病毒感染之前或者(ii)用病毒感染之后增加细胞培养物中的细胞密度，然后孵育用该流感病毒感染的细胞培养物以便增殖病毒。用流感病毒感染的细胞可以为VERO或MDCK细胞或者任何对于流感病毒易感的细胞。根据本发明的一个优选的实施方案，使用VERO细胞并用流感病毒感染。根据一个优选的实施方案，VERO细胞在无血清或无血清和蛋白质的培养基中从最初的安瓿生长至生物质。与微载体结合的VERO细胞在各自的培养基中生长至汇合，细胞密度与微载体浓度增加至少1.3倍。细胞可以在培养物体积的细胞密度增加之前或之后用流感病毒进行感染。在孵育经感染的高细胞密度生物质和产生病毒之后，收获生产出的流感病毒或者流感病毒抗原。收获得到的病毒用本领域中已知的方法进一步进行纯化，例如在Kistner等人1998(如上述)或者US 6,048,537中所描述的方法。
本发明的另一方面提供了具有高细胞密度的与微载体结合的粘附细胞的细胞培养生物质，其中，与生长至汇合的细胞培养物相比，细胞培养物中的细胞的细胞密度生物质为至少1.3倍。与微载体结合的粘附细胞的培养物为选自下列贴壁依赖性细胞的细胞，即VERO、BHK、CHO、RK、RK44、RK13、MRC-5、MDCK、CEF或者二倍体单层细胞。具有高细胞密度的细胞培养生物质优选地为VERO细胞的培养物。
根据本发明的一个优选实施方案，细胞培养物生物质在无血清的培养基中生长，其不含有任何来自血清的物质或试剂。根据另一个优选的实施方案，生物质不含血清和蛋白质，并且不含有任何来自血清的物质或加入培养基中的蛋白质。优选地，细胞在无血清或无血清和蛋白质的培养基中从最初的安瓿生长至生物质。在病毒增殖和产生过程期间，将具有高细胞密度的生物质保持在无血清或无血清和蛋白质的培养基中。
根据本发明的另一个实施方案，用病毒感染与生长至汇合的细胞培养物相比具有更高的细胞密度的生物质细胞。在病毒增殖过程期间，保持用病毒感染的高细胞密度生物质的细胞密度和培养基体积。
本发明的另一方面提供了与微载体结合的VERO细胞的细胞培养生物质，其中，与生长至汇合的VERO细胞培养物相比，在该细胞培养物中的VERO细胞的生物质和细胞密度为至少1.3倍。与生长至汇合的细胞相比，该细胞培养物也具有更高的微载体浓度。
根据本发明的一个优选实施方案，具有更高细胞密度的细胞培养生物质为VERO细胞的生物质。优选地，细胞在无血清的培养基中生长，并且生物质也不含血清。根据本发明的另一个优选实施方案，生物质培养物不含血清和蛋白质。
本发明的另一方面提供了与微载体结合并用病毒感染的粘附细胞的细胞培养生物质，其中，与在感染之前生长至汇合的细胞培养物相比，在该细胞培养物中的经感染细胞的生物质为至少1.3倍，该生物质具有更高的细胞密度。根据一个实施方案，细胞的细胞培养生物质不含血清。根据本发明的另一个优选的实施方案，细胞培养生物质不含血清和蛋白质。细胞优选地为VERO细胞。用病毒感染的高细胞密度生物质的细胞密度在病毒增殖过程期间不降低。
本发明的另一方面提供了与微载体结合的VERO细胞的细胞培养生物质，其以高细胞密度与微载体结合，其中，与生长至汇合的VERO细胞培养物相比，该细胞培养物中的VERO细胞的生物质为至少1.3倍，其中VERO细胞用病毒进行了感染。VERO细胞用选自下列的病毒进行感染，即流感病毒、罗斯河病毒、甲型肝炎病毒、痘苗病毒及其重组衍生物、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒及其嵌合体、鼻病毒和呼肠孤病毒。
根据另一方面，本发明提供了与微载体结合的VERO细胞的细胞培养生物质，其含有高细胞密度的用流感病毒感染的该细胞，其中，与生长至汇合的VERO细胞培养物相比，该细胞培养物中的VERO细胞生物质为至少1.3倍。
根据另一方面，本发明提供了与微载体结合的VERO细胞的细胞培养生物质，其含有高细胞密度的用罗斯河病毒感染的该细胞，其中，与生长至汇合的VERO细胞培养物相比，该细胞培养物中的VERO细胞生物质为至少1.3倍。
根据另一方面，本发明提供了与微载体结合的VERO细胞的细胞培养生物质，其含有高细胞密度的用甲型肝炎病毒感染的该细胞，在此，与生长至汇合的VERO细胞培养物相比，该细胞培养物中的VERO细胞生物质为至少1.3倍。
有了现在经大体上描述的本发明，通过参考下列的实施例将会理解同样的情况，在此提供的这些实施例只是为了举例说明的目的而不是要加以限制，除非另外规定。
实施例1在浓缩的VERO细胞生物质上生产病毒抗原a)细胞培养物的生长VERO细胞(非洲绿猴，Cercopthecus aethiops，肾)用作生产细胞系。该细胞已经从美国典型培养物保藏中心获得，其保藏号为ATCCCCL 81和传代数为124。这些细胞适合于在Kistner等人，1998(如上述)、WO 96/15231或US 6,100,061所描述的无血清或无血清和蛋白质的培养基中生长。为了在无血清的培养基中生长，使用添加了无机盐、氨基酸、碳酸氢钠(2g/L)和酵母或大豆提取物(0.1-10g/L)的基础DMEM HAM’s F12培养基。制备工作细胞库，但不要使用任何动物来源的培养基组分。
工作细胞库的细胞在T-烧瓶和滚动瓶中以1∶6或1∶8的分裂比例进行扩展。在搅拌型罐式生物反应器中用Cytodex?微载体作为附着物质来进行细胞的进一步增殖。细胞在37℃生长6-8天。保持氧气饱和度20％±10％和pH 7.25±0.35这一培养条件不变。在生物质生产的最后，当细胞已经达到汇合生长时，将一部分的生物质反应器体积通过沉淀浓缩2倍，然后测定未浓缩的和浓缩的细胞培养物的细胞密度。
b)生物质的细胞密度的测定在生物质生产的最后用下列方法测定细胞培养物生物质的细胞数，即Sch?rfe等人(1988，Biotechnologie in LaborPraxis，101096-1103)描述的用胰蛋白酶消化细胞和用CASY?细胞计数器进行计数(方法A)，或者Sanford等人(1951，J.Natl.Cancer Inst.，11773-795)描述的用柠檬酸和结晶紫处理并随后用血细胞计数器计数(方法B)。在生物质生产的最后和在浓缩汇合生物质之后(感染之前)，VERO细胞的细胞密度和载体浓度通过方法A和B来计算。数据显示在表1中。
表1在生物质生产的最后和在浓缩汇合细胞培养物之后汇合细胞培养物中细胞数的测定
实施例2汇合生物质与浓缩的汇合生物质的病毒抗原生产的比较将具有指定传代数的VERO细胞从液氮中解冻，然后将其在扁瓶和滚瓶中传代以便产生对于接种至1.5升生物反应器足够的细胞。在达到最终细胞密度为1.5×106细胞/ml的汇合之后，将细胞用胰蛋白酶消化并转移至10升生物反应器中。这随后用作具有1.5g/L的微载体浓度的100升生物反应器的接种物。从含有107个细胞的工作细胞库安瓿开始，需要大约30代来达到最终的汇合VERO细胞生物质。使这些培养物生长直至达到汇合，其具有1.9×106/ml的最终细胞密度。在病毒感染之前，将2个10升的生物反应器用细胞培养生物质进行加载，其具有不同的总细胞数。发酵罐A用1.9×1010的细胞加载，发酵罐B的总细胞数为3.8×1010。为了获得更高的生物质和载体浓度来加载至发酵罐B中，将生长至汇合的细胞培养物通过生物质沉淀进行浓缩以达到2倍浓度。发酵罐A含有100％的生长至汇合的原始细胞培养物的细胞生物质，发酵罐B含有200％的生长至汇合的原始细胞培养物的细胞生物质。
a)流感病毒的生产发酵罐A和B中的细胞培养物用流感病毒株H3N2 A/Sydney/5/97以0.01的m.o.i.进行感染。应用相同的操作参数，即32℃、20％的pO2和pH 7.1。为了活化流感病毒以进行病毒增殖，加入蛋白酶如胰蛋白酶、链霉蛋白酶或者其胰蛋白酶样部分。
测定在含有不同生物质浓度的发酵罐A和B中的两种不同细胞培养物的病毒抗原生产力，并根据流感病毒滴度(HAU/ml)和抗原含量(经密度梯度纯化的抗原)进行比较。峰区域相当于在感染后第3天于裂解循环最后的总抗原浓度。数据显示在表2中。
表2汇合VERO细胞培养物和浓缩的汇合VERO细胞生物质中的流感病毒滴度和抗原的测定
b)罗斯河病毒的生产如上所述增殖VERO细胞至汇合，其最终密度为1.6×106细胞/ml。在病毒感染之前，将2个50升的生物反应器系统用细胞培养生物质进行加载，其具有不同的总细胞数。发酵罐A的细胞密度为1.6×106细胞/ml，发酵罐B的细胞密度为2.3×106细胞/ml，这为1.5倍的汇合细胞培养生物质的浓度。用罗斯河病毒感染发酵罐A和B，并如上所述测定发酵罐A和B的病毒抗原生产力。表3显示了使用不同浓度的生物质用于病毒增殖而获得的病毒产量的结果。
表3罗斯河病毒滴度和抗原生产的测定
实施例3在浓缩的RK细胞生物质上的病毒抗原生产a)细胞培养物的生长使用Holzer等人(1997，J.Virol.，714997-5002)描述的兔肾细胞RK-13或者其互补衍生物RK-D4R-44作为生产细胞系。细胞在含有2％血清的常规培养基中生长。
来自工作细胞库的细胞在T-烧瓶和滚瓶中以1∶6的分裂比例进行扩展。在10L搅拌型罐式生物反应器中用Cytodex?(Pharmacia)微载体作为附着物质来进行细胞的进一步增殖。
b)缺陷型痘苗病毒的生产在RK-13或RK-D4R-44细胞于罐式生物反应器中达到汇合和最终细胞密度之后，生物质用Holzer等人，1997(如上述)描述的痘苗病毒WR或者缺陷型痘苗病毒vD4-ZG#2以0.01的m.o.i.进行感染。在感染之后，将2个10升的生物反应器系统用经感染的细胞培养生物质进行加载，其具有不同的总细胞数。发酵罐A用1.2×1010的细胞加载，发酵罐B用2.4×1010的细胞加载。为了获得更高的用于发酵罐B的生物质和载体浓度，将生长至汇合的受感染的细胞培养物通过生物质沉淀进行浓缩以达到更高的浓度。发酵罐A含有100％的生长至汇合的原始细胞培养物的细胞生物质，发酵罐B含有200％的生长至汇合的原始细胞培养物的细胞生物质。测定两个不同的细胞培养发酵罐A和B的病毒抗原生产力，它们含有不同的在每单位体积受感染细胞的培养基中的生物质浓度。结果概括在表4中。
表4RK细胞上痘苗病毒滴度的测定
提供上面的实施例是为了举例说明本发明，但不是要限制其范围。本领域中的普通熟练技术人员会容易明白本发明的其他变化形式，所附的权利要求包括了这些变化形式。由此加入此处引用的所有出版物、专利和专利申请以作为用于所有目的的参考。


本发明提供了经改进的在与微载体结合的粘附细胞培养物上生产病毒抗原的方法，其中该方法提供了增加的每单位培养基体积的病毒抗原产量。本发明也涉及粘附细胞的细胞培养生物质，其具有与各汇合细胞培养相比增加的细胞密度和微载体浓度。