专利名称：抗原肽及其用途的制作方法痤疮是一种炎性疾病，其主要在青春期以及也在成年期常见于人体从颈部至面部的部分。由于炎症所出现的位置，痤疮的出现对人的心理有极大的影响。到目前为止，已经开发了多种用于痤疮的治疗剂。特别的，已经进行了很多直接作用于作为痤疮病原体的痤疮丙酸杆菌之药物的开发2004年，确定了痤疮丙酸杆菌的完整基因组序列。其阐明了痤疮丙酸杆菌的很多基因编码毒力因子(见非专利文献1)。基于该信息，在开发疫苗过程中，已经对痤疮丙酸杆菌唾液酸酶进行了研究(见非专利文献2、。在非专利文献2中，在小鼠耳廓皮肤中重现了炎症。引文列表[非专利文献1]Bruggemann H.等，“The Complete Genome Sequence of Propionibacterium Acnes, a Commensal of Human Skin，，，Science, 2004, 305,671-673。[非专利文献2]Nakatsuji Τ.等,“Vaccination Targeting a Surface Sialidase of P. acnes Implication for New Treatment of Acne Vulgaris，，，PLoS ONE, 2008, 3, 2,1-9。
技术问题目前已开发的大多数药物作用于作为痤疮原因的痤疮丙酸杆菌细菌细胞本身并发挥抗炎作用。因此，在发生痤疮丙酸杆菌再次感染的情况下，炎症再次发生。此外，即便使用此类药物暂时有效，所述药物的使用也诱导耐药细菌的出现。这使得治疗更加困难。鉴于上述问题作出了本发明。本发明的目的是提供实现连续治疗痤疮的化合物。问题的解决方案可预期作为对痤疮的连续治疗是免疫治疗，即疫苗。一旦建立了有效的抗痤疮免疫(特定痤疮丙酸杆菌的识别和免疫记忆)，至少在相同痤疮丙酸杆菌菌株再次感染时，痤疮丙酸杆菌立即被清除。因此，预期免疫治疗将发挥连续抗炎作用。作为勤奋研究的结果，本发明的发明人发现，与在小鼠耳廓皮肤中注射相比，在小鼠腹中线皮肤中注射痤疮丙酸杆菌可以更有效地诱导感染。通过使用这种炎症诱导，发明人发现，一种由基于常规技术无法获得的氨基酸序列组成的肽可非常有效地抑制痤疮丙酸杆菌所诱导的炎症，完成了本发明。为了解决上述问题，本发明的肽是选自下列的肽(a)由SEQ NO. 1所示氨基酸序列组成的肽；和(b)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQ NO. 1所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。使用本发明的肽使得能够抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症(痤疮和丘疹 (pimple))。为了解决上述问题，本发明的肽可以是选自下列的肽(c)由SEQ N0.3所示氨基酸序列组成的肽；和(d)由通过缺失、替换、插入或添加一个或数个氨基酸衍生自SEQ NO. 3 所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。本发明的肽组合物可以是包括下列的肽组合物(e)上述(a)或(b)中描述的肽， 或者通过接头连接多个上文(a)或(b)中所述肽而获得的多价抗原肽形式的肽；和(f)上文(c)或(d)中所述的肽，或者通过接头连接多个上文(c)或(d)中所述肽而获得的多价抗原肽形式的肽。本发明的疫苗是对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗，其包含上述肽或上述肽组合物。本发明的多核苷酸是编码上述肽的多核苷酸。本发明的表达载体是有效连接上述多核苷酸的表达载体。本发明表达载体的使用使得能够提供可抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症的肽。本发明的抗体是特异性识别上述肽的抗体。用于测定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗有效性的本发明方法包括下述步骤检测从活体中收集的样品中是否存在编码上述肽的多核苷酸。使用本发明的方法使得能够在向活体施用所述疫苗前容易地确定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗在活体中是否有效。用于治疗或预防痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的本发明方法包括向个体施用上述疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的所述肽。用于治疗或预防痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的本发明方法包括向个体施用上述疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的所述多核苷酸。发明的优势作用本发明的肽具有非常高的抗原性。因此，使用本发明的肽可提供对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗。附图简述图1显示了测量通过将痤疮丙酸杆菌注射进个体部分所引起的炎症面积的结果。图2显示了通过注射痤疮丙酸杆菌所引起的炎症面积与注射后所经过时间之间的相关性。图3图示了检查肽的抗炎作用的步骤。图4显示了检查肽的抗炎作用的结果。图5显示了检查肽的抗炎作用的另一结果。图6对比了分离自患者的菌株的16S rDNA碱基序列与标准菌株的16S rDNA碱基序列。图7显示了检查肽针对注射分离自患者的痤疮丙酸杆菌的抗炎作用的结果。图8显示了用本发明的疫苗接种的痤疮患者的随访照片。图9显示了用本发明的疫苗接种的另一痤疮患者的随访照片。图10显示了用本发明的疫苗接种的又一痤疮患者的随访照片。图11显示用本发明的疫苗接种的再一痤疮患者的随访照片。本发明的疫苗组合物可口服施用。在口服施用的情况下，本发明的所述疫苗组合物与稀释剂联合使用，所述稀释剂例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖酸钠 (sodium saccharate)、纤维素和碳酸镁。当口服施用时，本发明的疫苗组合物可以是溶液齐U、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末药物的形式。在以冻干的形式提供本发明疫苗组合物的情况下，在施用之前，所述冻干物质可重构为混悬剂。所述重构优选在缓冲溶液中进行。本发明的疫苗组合物可含有用于增强所述疫苗有效性的佐剂。有效佐剂的例子包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、硅石、高岭土、炭、油包水型乳剂、水包油型乳剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂肪X、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、多聚核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、 溶血卵磷脂、维生素A、sp0nin、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物和其他合成的佐剂。这些佐剂可购自多个供应商。这些佐剂的代表性实例包括水包油型佐剂、氢氧化铝佐剂和与这些佐剂混合的佐剂。允许应用于人的佐剂为氢氧化铝。另一方面，本发明提供疫苗试剂盒。本发明的疫苗试剂盒对应于前述的疫苗组合物，可含有本发明的肽或本发明的多核苷酸作为有效疫苗组分，并且还可含有前述的疫苗组合物的组分。在一个实施方案中，本发明的疫苗试剂盒含有本发明的肽。在另一个实施方案中， 本发明的疫苗试剂盒含有本发明的多核苷酸。在本实施方案中，本发明的多核苷酸优选为能够表达本发明多核苷酸所编码的肽的形式，并且更优选以有效连接了本发明多核苷酸的表达载体的形式提供。本文中使用的术语“试剂盒”表示包含其中含有特定物质之容器(例如，瓶、板、管和皿)的套件(package)。所述试剂盒优选具有使用各个物质的说明。本发明的说明书中试剂盒方面所使用的术语“包含/包括”表示材料包含在构成所述试剂盒的各个容器的任一中。此外，本发明的试剂盒可为其中包含多个不同组合物的套件。组合物的形式可以如上所述，如果组合物是溶液的形式，则组合物可以包含在容器中。本发明的试剂盒可以设计成使得材料A和B混合并包含于单个容器中或包含于各自的容器中。所述“说明”可书写在纸或其他类型的媒介上，或可打印出来。或者，所述“说明”可为磁带或电子媒介的形式， 例如计算机可读的磁盘或磁带和CD-ROM。此外，本发明的试剂盒可包括含有稀释剂、溶剂、 清洁液或其他试剂的容器。此外，本发明的试剂盒可事先包括必要的用于预防/治疗痤疮丙酸杆菌感染所引起的痤疮的设备。按上文使用本发明的疫苗使得能够有效地预防/治疗痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症(痤疮)。也就是说，治疗或预防痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症的方法也涵盖于本发明中，所述方法包括向个体施用疫苗的步骤，所述疫苗含有治疗有效量的本发明的肽或治疗有效量的本发明的多核苷酸。本文中使用的术语“治疗有效量”表示使所述肽或所述多核苷酸能够发挥所需治疗作用或预防作用的肽或多核苷酸的量。所述治疗有效量可根据施用所述疫苗个体的年龄、体重和其他健康状况，要治疗的炎症的状况和施用方法而不同。在皮下施用的情况下，一个例子可为以这样的方式施用疫苗，即在一次施用中供给5-10 μ g肽/kg体重或10-50 μ g多核苷酸酶/kg体重。为了诱导足以用于抗炎的免疫应答，可给个体施用两次或更多次所述疫苗。在该情况下，以预定间隔进行施用。另一个例子如下在含有MAP混合物的疫苗的情况下，可通过下述方式的皮下注射进行施用，所述方式即以生理盐水溶液的形式施用100-500 μ g每种肽/ 一次注射，以 3 5天的间隔施用大约5次，，所述MAP混合物为基于由SEQ NO. 1所示氨基酸序列组成之肽的MAP和基于由SEQ NO. 3所示氨基酸序列组成之肽的MAP的混合物(重量比为1:1)。在通过贴片施用的情况下，一个剂量可能是小的，可降低剂量数，并且个体可自己使用贴片进行治疗。本文中使用的术语“个体”表示人或非人动物(例如，大鼠、小鼠、兔、猪、牛和猴) 个体。[抗体]本发明提供特异性识别任何本发明肽的抗体。也就是说，本发明的抗体可特异性结合任何所述肽。在一个实施方案中，本发明的抗体优选为与下述肽结合的抗体(1)由 SEQ NO. 1或3所示的氨基酸序列组成的肽，或( 通过MAP方法，从由SEQ NO. 1或3所示氨基酸序列组成的肽合成的多价抗原肽。本文中使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，及其Fab片段、F(ab’)2片段和Fc片段)。抗体的例子包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和抗独特型抗体。本发明的抗体可通过本发明所涉及的领域中公知的方法来产生。例如，可通过向哺乳动物活体施用本发明的肽并且引起免疫应答，以使所述活体中产生抗体，从而获得所述抗体。在该情况下获得的抗体通常是多克隆抗体。使用本发明的肽，可通过常规且公知的杂交瘤技术等来产生单克隆抗体。或者，可通过应用重组DNA技术或化学合成来产生所述单克隆抗体。使用本发明的抗体使得能够容易地纯化本发明的肽。例如，通过对本发明的肽进行亲和纯化，使得能够高效地收集所述肽，所述肽是使用本发明的载体或本发明的转化体在细胞中表达的。本发明的抗体可以是任何抗体，只要所述抗体特异性地结合本发明的肽，本发明的抗体不应在以下方面受到限制，即本说明书中具体描述的个别免疫球蛋白种类(IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM)、用于制备嵌合抗体的方法、用于制备肽抗原的方法等。因此，应当注意的是，通过不同于上述方法而获得的抗体也涵盖于本发明中。[测定疫苗有效性的方法]用于测定对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗之有效性的本发明方法仅需要包括检测步骤， 所述步骤检测编码上述肽的多核苷酸是否存在于收集自活体的样品中，并且所述方法在所使用的其他特异性步骤和仪器和设备方面没有特别限制。在所述检测步骤检测到编码所述肽的核苷酸的情况下，可确定向测试对象施用本发明的疫苗高度非常有可能导致对痤疮丙酸杆菌所引起的炎症的有效抑制。具体地说，当检出编码上述蛋白的多核苷酸时，则确定本发明的疫苗很可能有效对抗痤疮丙酸杆菌。检测编码所述肽的所述多核苷酸的方法没有特别的限制。例如，所述方法可以是通过PCR扩增的检测或通过测定PCR产物的碱基序列的检测。通过测定PCR产物的碱基序列，有可能更精确地确定是否可发挥疫苗接种的作用。还可依据通过扩增是否产生PCR片段来确定是否发挥疫苗接种作用。例如，在通过使用特异性引物来扩增上述多核苷酸扩增产生预期长度片段的情况下(在PCR检测的结果为阳性的情况下)，受试对象非常有可能被带有上述多核苷酸的痤疮丙酸杆菌所感染，并且因此确定所述接种作用是高度预期的。另一方面，在未产生预期长度片段的情况下(在PCR检测的结果为阴性的情况下)，则确定所述接种预期作用不大。PCR扩增之前，可通过培养可包含痤疮丙酸杆菌的样品来培养痤疮丙酸杆菌，所述样品收集自受试对象。可通过检测收集自活体之样品中痤疮丙酸杆菌的16S rDNA的部分序列是否存在来作为用于确定是否使用对抗痤疮丙酸杆菌的本发明疫苗的方法。对16S rDNA的部分序列是否存在的检测可以是下述检测即通过PCR扩增的检测和通过确定PCR产物碱基序列的检测。该检测可表明受试对象的炎症源自痤疮丙酸杆菌。这可以是使用该疫苗的基础。本发明中还涵盖非人哺乳动物的模型动物(例如下文中提到实施例中的小鼠)和制备所述模型动物的方法，以预先确定的或更高的细菌细胞浓度将痤疮丙酸杆菌皮内注射进所述模型动物的腹中线从而引起痤疮丙酸杆菌炎症。在所述模型动物中，使用相比于产生炎症的常规方法更高效的方式产生痤疮丙酸杆菌的炎症。迄今为止在开发抗痤疮药物中使用的检测系统是基于施加药物的假设。结果，在疫苗的开发中，迄今尚未构建能够体内测定疫苗之作用的有效检测系统。在对抗痤疮丙酸杆菌的疫苗的开发中，优选地可使用用于确定疫苗有效性的方法、模型动物和用于制备模型动物的方法。参照实施例，下文更详细地说明了本发明的实施方案。应当注意的是，本发明不限于如下的实施例，并可对其细节进行修改。本发明不限于上述对实施方案的描述，而本领域技术人员可在权利要求书的范围内对其进行改变。本发明的技术范围涵盖了基于对不同实施方案中所公开的技术手段进行合适组合的实施方案。说明书中引用的所有文献以参考的形式并入。[实施例][实施例1痤疮丙酸杆菌的培养]痤疫丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)(下文中缩写为“痤疫丙酸杆菌 (P. acnes)”)的菌株(ATCC6919)购自 RIKEN 生物资源中心(RIKEN BioResource Center) (JCM目录No. 642 。根据来自所述中心的培养条件信息来培养所购买的痤疮丙酸杆菌菌株。具体地，在厌氧手套箱中，将痤疮丙酸杆菌的菌株悬于IOOml的GAM培养基中(Nippon Suisan Kaisha, Ltd制造)，并使用小瓶在37°C下厌氧培养3天。[实施例2痤疮丙酸杆菌在小鼠皮肤中引发皮内炎症]将痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞放入脱气的生理盐水中，同时保持厌氧条件，以用 5 X IO7细胞/ml、1 X IO8细胞/ml或5 X IO8细胞/ml数目的痤疮丙酸杆菌活细菌细胞制备悬液。通过鼓氮气来保持厌氧条件。参照非专利文献Ramstad S等，Photochem. Photobiol. Sci.，2006，5，66-72，基于以下假定来计算痤疮丙酸杆菌的活细菌细胞数分光光度计在 550nm处测量的0. 98 1. 02的OD测量值对应于5X IO8细胞/ml。将50 μ 1所制备的痤疮丙酸杆菌悬液皮内注射进雄性Balb/c小鼠(9 10周龄) 剃毛的腹中线、颈部、腰背部、尾根背部和耳廓。在预先确定的时间测量皮内注射所述悬液的各个部分中的炎症面积(长轴χ短轴rnm2)。每组由5个个体组成。
结果，在注射了细菌细胞浓度为5X IO8细胞/ml痤疮丙酸杆菌悬液的组中明显地证实了炎症。图1显示在注射后第5天观察到的各个部分中炎症面积的结果。如图1所示，在皮内注射所述悬液的各个部分中观察到了炎症，并且腹中线皮内部分的炎症面积最大。也就是说，当引起小鼠皮内炎症时，皮内注射进入腹中线是最有效的。在所观察的部分之中，耳廓处的炎症最轻微。图2显示将所述悬液皮内注射进腹中线之后，在各个时间点腹中线处炎症面积的结果。如图2所示，注射痤疮丙酸杆菌后5天时，腹中线处的炎症面积最大。与之相反，在分别注射细菌细胞浓度为5 X IO7细胞/ml和1 X IO8细胞/ml的痤疮丙酸杆菌悬液的组中，在任何部分及在任何时间都不引起炎症。[实施例3:肽的制备]将由SEQ NO. 1所示氨基酸序列组成的肽P印A的粉末或由SEQ NO. 3所示氨基酸序列组成的肽P印D的粉末溶于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)中，以制备800 μ g/ml的肽溶液。作为对比实施例，使用了 P印B和P印C，所述P印B是对应于由在Genbank/EMBL/ DDBJ中以登记号No. AAT81852注册的氨基酸序列所组成的痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第10 26个氨基酸残基的肽，所述P印C是对应于由在Genbank/EMBL/DDBJ中以登记号No. YP 055518注册的氨基酸序列所组成的痤疮丙酸杆菌膜蛋白中第145 166个氨基酸残基的肽。表1显示各个肽的氨基酸序列。作为对比实施例使用的序列是可以在抗体生产中作为抗原有力候选的氨基酸序列，即富含亲水氨基酸和电荷的氨基酸序列，并且其选自具有转角结构的氨基酸序列。此外，按照上述非专利文献1中描述的基因组分析的结果，以上述登记号注册的氨基酸序列所组成的蛋白质被认为是表达的。[表1]


为了提供对抗痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)感染的有效疫苗，本发明提供一种肽，所述肽是由特异性氨基酸序列组成的肽或者是由通过缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸衍生自所述特异性氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽，所述肽通过免疫应答抑制痤疮丙酸杆菌感染所引起的炎症。