专利名称：通过光化学内化作用在抗原呈递细胞表面上表达抗原的方法图1所述转运到细胞表面(Yewdell和Bennink，1992，Adv.Immunol.521-123)。如果肽是外来的抗原，那么此肽-MHC-I类复合物将被CD8+细胞毒T细胞(CTLs)识别。CTLs将与该肽-MHC-I类复合物结合，从而被激活，开始增殖并形成CTLs克隆。靶细胞和其它表面具有相同的肽-MHC-I类复合物的靶细胞可被该CTL克隆所杀死。如果能在胞质中能导入足量的抗原，就可能建立对外来抗原的免疫力(Yewdell和Bennink，1992，同上；Rock，1996，Immunology Today，17131-137)。这尤其是癌症疫苗开发的基础。一个最大的实际问题是将足量的抗原(或抗原的部分)导入胞质。这可用本发明的PCI解决。原理在图1中阐述，该图显示了怎样用PCI来刺激CTLs。将一条肽或一个蛋白(P)在胞外给予抗原呈递细胞。P通过PCI被胞吞和释放到胞质中。该肽或蛋白随后将被蛋白酶体部分降解，与MHC(HLA)-I类分子形成复合物，并被转运到细胞表面，在那儿，该复合物被CTLs识别。如同将在下面实施例中所作的更详细描述那样，已证明根据本发明，可以有效地用光化学内化进行癌特异性肽的胞质中传送。使用靶定向试剂如靶特异性传送或运载系统或载体分子，可将抗原分子和/或光敏剂导向特异性细胞或组织。这样，例如可将抗原分子和/或光敏剂通过载体或载体系统(如重建的LDL颗粒)传送给细胞。载体分子可与抗原分子、光敏剂或这两者结合或偶联，可采用相同的或不同的载体分子。抗原分子和/或光敏剂还可偶连于一位点靶向配体(site-targeting ligand)，例如对具体细胞类型或具体细胞结构具有特异性的配体，如抗体，该抗体能识别表达在某些类型细胞表面上的抗原如肿瘤特异性抗原。这些机制可通过受体介导的内吞作用增加光敏剂和/或抗原分子的摄取。还可以用这些靶定向分子载体和载体来引导抗原分子和/或光敏剂进入细胞内的区室中。胞内受膜限制的区室可以是存在在细胞内的任何区室，较佳的该区室是膜性囊，尤其是核内体或溶酶体。但是，该胞内区室还可以包括高尔基体或内质网。所有的这些要求是抗原分子和光敏剂定位在同一胞内区室中。在WO96/07432中较详细地描述了光化学内化方法(本文引用该文的内容作为参考)。现在在文献中也广泛地描述了PDT方法。本发明使用的光敏剂可以是能定位于胞内区室，尤其是内涵体或溶酶体任何试剂。这些光敏剂的范围是本领域周知的，在文献中有所描述，包括WO96/07432。这方面可能会提及的有双-和四磺酸铝酞菁、磺酸四苯基卟吩(TPPSn)、耐尔蓝、二氢卟酚e6衍生物、尿卟啉I、叶赤素、血卟啉和亚甲基蓝，这些都显示定位在培养细胞的核内体和溶酶体中。这种情况最多是由于内吞活动。可能提及的合适的光敏剂类型包括卟啉、酞菁、红紫素、二氢卟酚、二苯卟啉酞菁、阳离子染料、四环素和亲溶酶体弱碱(lysomotropic weak base)或者它们的衍生物(Berg等人，Photochemistry and Photobiology，1997，65，403-409)。较佳的是，光敏剂包括TPPS4(Zabner等人，J.Biol.Chem.1995，270，18997-19007)TPPS2a和AlPcS2a。
本发明的光化学内化作用可用PDT方法进行，该方法是本领域周知的和标准的，对这些技术做适当的修改在本方法中是有效的。因而，可根据PDT领域周知方法和手段的应用(application)或引入将抗原分子和光敏剂传送到细胞中。可用本发明方法体内或体外，原位处理或活体外处理细胞，然后将处理的细胞给予病人。
从而，本发明另一方面提供了在其表面表达有抗原分子或其一部分的抗原呈递细胞，该细胞通过前述方法获得(或已获得)。本发明另一方面提供了这种细胞的种群或培养物，特别是这种细胞的活的和具有完整功能的种群或培养物，本发明还提供了这种细胞(或这种细胞的种群或培养物)在治疗中的应用，具体是用来刺激免疫应答，尤其是刺激CTLs应答。
本发明还提供了这种细胞(或这种细胞的种群或培养物)的应用，即用来制备刺激免疫应答尤其是CTLs免疫应答的药物(如疫苗组分)。
可以采用本领域普通或标准的任何体内给药方式进行体内和体外表面给药，如注射、输灌、局部给药等。对于在体内使用，本发明可用于任何相关的含有靶细胞的组织，包括局部体液，以及固体组织。只要光敏剂能被靶细胞摄取并且光能正确地传送，可用其处理所有的组织。
从而，本发明的组合物可以根据制药技术领域周知的技术和工艺以任何方便的方式配制，如采用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。此组合物和载体或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择和所需的给药途径、接种目的等以常规方式选择。剂量同样地可以常规方式确定，可能依赖于抗原分子的性质、接种目的、病人年龄、给药方式等，还要考虑到光敏剂照射时破坏膜的力量/能力。
激活光敏剂的光照射步骤同样地可根据本领域熟知的技术和程序进行。例如，光的波长和强度可根据所用的光敏剂选择。合适的光源在本领域中是熟知的。
如前面所提到的，以及在WO96/07432中提到的，已发现这种方式的光化学内化作用对细胞的活力和功能没有有害的影响。具体而言，已发现当按照本发明处理全部或大多数细胞时，大多数细胞没有被杀死，而是活着，主要功能完整。
本文所用的术语“没有杀死细胞”是想定义这样的一种情况。换句话说，全部或多数细胞，实际上是所有的细胞或绝大多数细胞(如至少75％的细胞，较佳的是至少80％、85％、90％或95％的细胞)没有被杀死。
显然，当用光照射全部或多数细胞时，某些细胞群或某些区域的组织可得到更多的光，或者以某些其它方式比其它细胞群或组织区域受到更大的PCI影响。因而，在整个受照射细胞群中生存细胞的百分比不一定一致，该百分比指受照射细胞群中仍能存活的细胞的百分比，要求仅是有足够比例的受照射细胞存活。另外，照射导致细胞死亡要一些时间，例如几个小时。在这种情况下可能看到最终死亡的细胞也可能在其表面表达抗原分子，这与本发明的方法一致，因而包括在本发明的方法、使用等之中。因而，细胞死亡百分比是指在照射的数小时时间内(如照射后达到4小时)仍能存活的细胞百分比，较佳的是指照射后4小时或以上的存活细胞百分比。
本发明方法可以作修改，这样，可通过选择与光敏剂浓度相应的光剂量而调节存活细胞组分或比例。这些技术在本领域也是熟知的。
本发明提供了一种有效的方法来传送各种各样的抗原分子。本发明有许多特征，使得本发明特别适合作为疫苗传送工具，这些特征包括1)只要待输送的分子能被靶细胞胞吞，其分子的大小没有限制；2)它不依赖于细胞增殖；3)它是位点特异性，只有曝光的区域才受到影响；4)它不致瘤。另外，光化学内化作用可以和其它机制联合作用，以产生位点或组织特异性药物作用，如通过使用细胞表面结构的特异性配体来靶向，使用有组织特异性的调节基因元件或使用疾病特异性药物，从而开创了获得对靶细胞的药物特异性的充分协同作用的可能性。
现在，本发明将参考下列附图更详细地描述以下非限制性例子，其中图1显示了可用PCI如何刺激CTLs的示意图。在抗原呈递细胞的胞外加入一条肽或一个蛋白(P)。P被胞舌并通过PCI释放到胞质中。该肽或蛋白随后将被蛋白酶体部分降解，与MHC(HLA)-I类形成复合物，然后被转移到该细胞的表面，在那儿该复合物被CTLs识别。
图2显示了某肽的光化学诱导的主定域。将BL2-G-E6细胞与荧光素标记的p21ras衍生的5-21Val1A肽和AlPcS2a共同培育。用荧光显微镜定域方法检测细胞的荧光肽和AlPcS2a开始前(上图)和30分钟后(下图)，红光曝光4分钟。其标尺刻度为20μm。
图3显示了MART-1肽经PCI后CD8+T淋巴细胞克隆抗FM3黑色素瘤细胞的细胞毒性。
图4显示了PCI将HRP转运到胞质的能力。用3.2μg/ml的TPPS2a和1mg/ml的HRP处理NHIK 3025细胞18小时。然后在用所示光剂量曝光前用没有药物的培养基换掉原培养基。用电渗透(electropermeabilisation)和密度离心技术测量完整细胞(○)、和与没有胞质的死细胞(?)分开的胞质(●)中的HRP活性。
图5显示了GFP的光化学诱导表达。图a.GFP在THX细胞中的表达，该细胞在没有AlPcS2a和光、或者存在AlPcS2a下用pEGFP-N1-pLys复合物处理，随后用图中所示的光剂量曝光。用流式细胞术分析细胞，画线右边的细胞是GFP表达阳性细胞。图b.THX细胞中的GFP表达，该细胞用光敏剂(20μg/ml的AlPcS2a或0.25μg/ml的3-THPP)处理18小时接着用pEGF-N1-pLys复合物转染6小时并曝光，灭活了50％的细胞。用如图a.所述的流式细胞术分析分析GFP表达。
实施例材料和方法照射用两种不同的光源处理细胞，每种光源都有4个荧光管。使受TPPS4、TPPS2a和3-THPP(卟啉产品，Logan，UT)处理的细胞在蓝光(3026型；Appl.Photophysics，Lodon，UK)中曝光，其光强度达到1.5mW/cm2细胞，而用AlPcS2a(卟啉产品，Logan，UT)处理的细胞在红光(Philips TL 20W/09)中曝光，该光用Cinemoid 35型滤波器过滤，光强度为1.35mW/cm2细胞。
荧光显微镜检查将Berg.K.等人(Biochem.Biophys.Acta.，1370317-324，1998)描述用荧光显微镜分析了细胞。为分析荧光标记分子，该显微镜装备有一个450-490nm激发滤光片、一个510nm二向色光束分路器和一个510-540nm的波段通过发射过滤片。
质粒-pLys复合物的制备和细胞的处理用含5μg质粒(pEGFP-N1；Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的75微升HBS与含5.3μg pLys(MW20700；Sigma，St.Louis，MO)的75微升HBS轻轻混合制备了质粒-pLys复合物(电荷比为1.7)。该溶液在室温下培育30分钟，然后用培养基稀释，并加到细胞中。
将THX细胞在37℃下与20μg/ml的A1PcS2a培育18小时，洗涤并在与质粒-pLys复合物培育2小时之前与没有光敏剂的培养基培育3小时。将经pEGFP-N1/pLys处理过的THX细胞洗涤一次，然后在曝光前在没有添加物的培养基中培育2小时。37℃培育该细胞2天，传代培养并在进行流式细胞术分析GFP表达前进一步培育5天。
用20μg/ml的AlPcS2a培育HCT-116细胞18小时，洗涤然后在曝光前在没有质粒的培养基中用质粒-pLys复合物转染6小时。37℃培育40小时后，用显微镜研究其GFP表达。
流式细胞术分析用胰蛋白酶处理细胞，离心后重悬于400μl的培养基中，然后用50μm的尼龙网过滤器过滤。然后用FACStar与流式细胞术(Becton Dickinson)分析该细胞。用调到488nm的氩激光(200mW)激发之后，通过510-530nm滤光片测量了绿荧光蛋白(GFP)。用调到351-356nm的氪激光(50mW)激发之后，通过650nm长通路滤光片测量了AlPcS2a。通过门控GFP荧光信号的脉冲宽度将双染色细胞与单染色细胞相区分。该数据用PC Lysys II软件(BectonDickinson)分析。
荧光肽的制备和细胞的处理荧光标记的Val1A-p21ras-肽(残基5-21)由Alan Cuthbertson NycomedAmersham合成和提供。将BL2-G-E6与30μg/ml的荧光标记p21ras衍生肽一起培育18小时，随后与20μg/ml的AlPcS2a培育18小时，并在红光中曝光前在没有药物的培养基中培育1小时。
实施例1光化学内化(PCI)作用能用来使肽进入到细胞的胞质中为了评估PCI对癌特异性肽的胞质中传送，采用了荧光标记的含残基5-21的p21ras肽和含Val12突变(G12V)的肽(Gjertsen，M.K.等人，Int.J.Cancer，72784-790，1997)。ras肽和AlPcS2a共定域于BL2-6-E6小鼠纤维母细胞中，这表明该肽被胞吞摄入(图2)。曝光4分钟后，发现荧光标记的ras肽和AlPcS2a扩散到细胞质中。仅暴露于荧光标记的ras肽和光中的细胞没有观察到类似的作用(没有给出数据)。
实施例2用PCI诱导抗原呈递和CD8+T淋巴细胞介导的细胞杀伤将培养在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基不表达MART-1的FM3黑色素瘤细胞(在6孔板中，2×105/孔)以10μg/ml的光敏剂AlPcS2a处理18小时。然后用含EDTA(0.1M)的Dulbecco公司的磷酸缓冲溶液(PBS)从培养基中释放出该细胞，将51Cr(60μCi/ml Na2CrO4)的100％FCS加到该细胞中，并在溶液中保持1小时，然后与含5μg/ml MART-1肽的PPMI 1640的10％FCS溶液培育5小时，同时细胞仍保持在溶液中。MART-1肽的序列是TAEEAAGIGILTVILG。然后用含10％FCS的RPMI 1640培养基洗涤该细胞两次，并接种在96孔平板(在100μl的RPMI 1640/10％FCS培养基中，2000/孔)中。然后以图3所示的时间曝光该细胞(Philips TL 20W/09)，该光用Cinemoid 35滤光片过滤过，其光强度达到1.35mW/cm2细胞(Rodal等人，1998，J.Photochem.Photobiol.BBiol.45150-9)。曝光18小时后，去除原培养基，并加入含MART-1/HLA-A2特异性细胞毒T淋巴细胞的培养基(加入CTLs-40000/孔在100μl中)。培育4小时后，将FM3细胞与培养基相分离，计数释放在培养基中(作为溶解细胞的指示剂)的51Cr，同时如以前所述计算自发释放和最大释放(Fossum等人，1995，Cancer Immunol.Immunother.40165-172)。特异性铬释放百分比根据下式计算(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。从图3所示的结果可以看出，上述MART-1肽PCI之后的FM3细胞，对CD8+T淋巴细胞细胞毒性具有轻微的依赖易感性(dependent susceptibility)。
实施例3PCI诱导胞吞的分子大组分的释放这通过PCI诱导的辣根过氧化物酶(HRP)内化/胞吞所显示。
通过使用HRP证明(见图4)，PCI诱导胞吞的HRP大组分(60％)释放并进入到胞质中。
在这个实验中，用光敏剂TPPS2a(3.2μg/ml)和1mg/ml的HRP处理NHIK3025细胞(人子宫颈原位癌细胞)18小时。然后在以图4所示的曝光剂量曝光之前用没有药物的培养基替换原培养基。按照Steinman等人(J.Cell Biol.，68665-687，1976)描述的方法测量了HRP的活性。用电渗透和密度离心技术(Berg等人，Int.J.Cancer 59814-822，1994)将胞质与无胞质的死细胞相分离。
实施例4可用PCI来增加功能基因的递送为证明这一点，用编码绿荧光蛋白(GFP)的质粒(pEGFP-N1)的pLys复合物转染了TXH细胞。用流式细胞术(图5a和b)和荧光显微镜(未给数据)分析了GFP表达。从图5a可以看出，用AlPcS2a和光处理导致表达GFP的细胞的百分比强烈地增加。该报告分子阳性的细胞组分从没有光处理时的1％，到曝光5分钟后增加到50％。在不用光敏剂时用pEGFP-pLys处理的细胞中，光不增强GFP的表达。当用AlPcS2a和光联合处理时，不相关的质粒(编码血红素加氧酶)与pLys的复合物不诱导绿荧光(未给出数据)。因而，以光定向的方式，PCI能充分地增加功能基因转染到THX细胞中的效率。用TPPS2a作为光敏剂和BHK-21、HCT-116作为靶细胞得到了相似的结果(未给出数据)。基本上是非溶酶体定域的光敏剂3-THPP只诱导了GFP表达的微小增加(图5b)。不与pLys形成复合物的pEGFP-N1的PCI不导致GFP表达(未给出数据)。


本发明提供一种在抗原呈递细胞表面表达抗原分子或其一部分的方法,该方法包括通过光化学内化作用将分子导入胞质,其中所述分子或其部分随后呈现在所述细胞的表面。本发明还提供疫苗接种方法,该接种方法包括上述方法,及包含所述细胞的组合物、和包括所述能表达抗原分子的细胞的用途。