透骨草在抑制畜禽大肠杆菌对抗菌药的耐药性上的应用的制作方法[0002]大肠杆菌是常见的条件致病菌，也是常发的一种疾病，它可原发引起鸡急性败血症、腹膜炎、肝炎、肺炎、肠炎等多部位严重感染，亦可继发或混发于病毒病，给养殖业造成巨大的经济损失。阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢曲松、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦等内酰胺环类抗生素是防治该病的常用的重要药物，随着养殖规模集约化程度愈来愈大，用药愈来愈泛滥，其耐药菌株愈来愈多，关于大肠杆菌耐药性的报道也较多。研究证实，耐药的主要机制之一是产生内酰胺酶，尤其是超广谱内酰胺酶(Extended-Spectrum^ -lactamase, ESBLs),该酶能较强和快速地水解β-内酰胺环,使这类抗生素丧失抗菌活性。ESBLs是β -内酰胺酶的最主要酶型，它不仅对头孢三代和氨曲南耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类呈交叉耐药，仅对碳青霉烯类、头霉烯类药物敏感。许多文献已经报道大肠杆菌的多重耐药性与产生ESBLs有密切关系，国内外对之较为关注。发明人最近开展了食品动物源致病菌ESBLs的检测、提取、酶对抗生素的水解率及舒巴坦、他唑巴坦以及中药的抑酶保护作用等研究，对部分ESBLs大肠杆菌的药敏试验表明，其多重耐药率明显高于非ESBLs菌株。另外，结果还表明产ESBLs菌株不仅对头孢噻呋等第三代头孢菌素严重耐药，而且亦对氟喹诺酮类、氨基糖苷类和磺胺类、磷霉素等多种抗菌药耐药,呈严重的多重耐药。发明人在产ESBLs菌株中分离到耐磷霉素产fosA3耐药基因的大肠杆菌，更加强了细菌的耐药性。大肠杆菌的耐药性造成养殖户用药成本增加，治疗疗程延长,畜禽死亡率增加,给生产带来较大经济损失,并且增加畜禽药物残留风险。
[0003]本发明要解决的技术问题是将透骨草应用于抑制畜禽大肠杆菌对抗菌药的耐药性，较快地杀死细菌，克服抗菌药治疗由于耐药性问题造成的疗效差、用量大、残留高和成本高的缺陷。[0004]为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案:将透骨草应用于抑制畜禽大肠杆菌对抗菌药的耐药性。[0005]抗菌药为β -内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、卡巴氧类、多肽类、酰胺醇类或盐酸沃尼妙林中的一种。[0006]内酰胺类抗菌药为阿莫西林、头孢曲松钠或头孢噻呋钠；氟喹诺酮类抗菌药为诺氟沙星；氨基糖苷类抗菌药为阿米卡星；卡巴氧类抗菌药为痢菌净；酰胺醇类为氟苯尼考；多肽类抗菌药为粘杆菌素。[0007] 针对目前畜禽大肠杆菌感染存在的耐药性问题，发明人利用广西特色中药透骨草与抗菌药组成复方药物应用于畜禽大肠杆菌感染的疾病防治。研究证明，抗菌药中加入透骨草后，能够逆转细菌对抗菌药的耐药性，从而提高抗菌药的治疗效果。按常规方法将该复方药物制成散剂、片剂、口服液或颗粒剂，按照0.l_7g主药/kg饲料的添加量添加到畜禽饲料中进行饲喂，可大幅降低用药成本和药物残留，为养殖户创造更高的经济效益，同时也确保了食品安全。

[0008]一、透骨草对抗菌药的耐药逆转作用研究
[0009]抗菌药本身具有治疗大肠杆菌的效果，但由于产ESBLs耐药基因的大肠杆菌具有较强的耐药性，致使抗菌药在正常的使用剂量情况下并未表现出较好的治疗效果。
[0010]为了验证透骨草对抗菌药的耐药逆转作用，在96孔板上采用微量试管二倍稀释法，先测定了抗菌药对产ESBLs和fosA3耐药基因的大肠杆菌株的最小抑菌浓度和透骨草对产ESBLs和fosA3耐药基因大肠杆菌株的亚抑菌浓度，然后在培养基中加入亚抑菌浓度的透骨草再次使用微量试管二倍稀释法培养测定抗菌药的最小抑菌浓度；利用连续传代法在加有同样亚抑菌浓度透骨草和同样浓度抗菌药的培养基中对产ESBLs和fosA3耐药基因大肠杆菌株进行传代培养，直至观测到的抗菌药最小抑菌浓度与传代前相比变小4倍以上，即可判断为透骨草对抗菌药具有耐药逆转作用。试验结果统计如表1所示:
[0011]表1亚抑菌浓度(0.25g/mL)透骨草传代引起产ESBLs和fosA3大肠杆菌西药MIC的变化(mg/mL)。
[0012]